一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法与流程

本发明涉及一种细菌耐药基因的检测领域，尤其涉及一种可视化检测mcr-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法。

背景技术：

自20世纪20年代开始，大量天然抗生素相继被发现，开启了抗生素时代，但随着对抗生素使用的过度依赖，细菌抗药问题日益凸显。耐药性细菌使得抗生素药物效减弱、甚至失效。多粘菌素(polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(a,b,c,d,e)。临床常用的是多粘菌素(polymyxinb)和多粘菌素e(colislin,抗敌素)。多粘菌素被认为是人类抗击细菌的最后防线；

近几年来，质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的快速进化及其在全球范围内的广泛传播，给公共卫生和人类健康造成了严重威胁，从而一个新的可移动粘菌素耐药基因mcr-3，自从在中国山东首次发现以来，已在多个国家的重症患者所携带的多重耐药的肠道细菌中大量检出，并且在全国13个省份中的8个省份发现了mcr-3阳性菌；

由于mcr-3的广泛存在，特别是在健康人群和动物性食品中的存在，使得针对mcr检测现用的选择性筛菌、质谱鉴定菌种、药敏检测和普通pcr验证的检测程序方法变得十分繁复且低效。且需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地检测到mcr-3基因，无需昂贵复杂的仪器，为细菌耐药基因的检测提供了新的方法，具有较大的应用价值的可视化检测mcr-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法。

本发明是通过如下措施实现的：

一种可视化检测mcr-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，其特征在于，所述引物组包括外引物f3和b3，内引物fip和bip；

所述引物组中各引物的核苷酸序列分别如下所示：

所述外引物f3：caacaccatccgctacac；

所述外引物b3：tccaggtgacatccacac；

所述内引物fip：agcaacgcggtgttgtacttgattggagagatgattgcca；

所述内引物bip：catggtgaatcactgggagcattaaggaacacgggtctgatc；

所述内引物和所述外引物，通过从美国基因数据库检索获得mcr-3基因序列，并通过blast软件进行同源性分析，获得mcr-3基因的特异性保守靶序列，再根据该保守靶dna序列，用软件primerdesignv4设计用于对mcr-3基因进行lamp检测的引物；

所述检测方法包括以下步骤：

s1、提取待测样品的dna；

s2、以步骤s1中提取的基因组dna为模板，在所述引物组的引导下进行等温lamp扩增反应，在lamp反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(hnb)；

s3、结果判定：根据步骤s2中的反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在mcr-3基因，紫色表示待测样品中不存在mcr-3基因。

本发明的具体特点还有：

所述引物组还包括将所述外引物f3、所述外引物b3、所述内引物fip和所述内引物bip的引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的dna分子。

所述步骤2中的lamp扩增反应的25ul反应体系含有：待测物的基因组dna1μl、0.8m甜菜碱(betaine)、180μmol/l羟基萘酚兰、8mmmgso4、1.4mmdntpeach、8ubstdnapolymerase、所述内引物各0.2μm和所述外引物各1.6μm，用灭菌去离子水补齐到25µl。

所述步骤s2中的lamp扩增反应条件为：62℃恒温60min。

本发明的有益效果为：本发明能够在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地检测到mcr-3基因，无需昂贵复杂的仪器，为细菌耐药基因的检测提供了新的方法，具有较大的应用价值；

其中，高特异性：4条引物对mcr-3基因靶序列的6个特异区域的识别保证了lamp扩增的高度特异性，即lamp能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；

高灵敏度：灵敏度比普通pcr高10倍；

结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(hnb显色)；

操作简单：只要将检测样品和检测试剂一起放入62℃恒温水浴锅中60分钟后就可以判断结果；

快速、高效扩增：整个lamp扩增反应一小时即可完成。

附图说明

图1为本发明实施例实验一中lamp检测结果。

图2为本发明实施例实验一中电泳判定lamp检测结果。

图3为本发明实施例中实验三lamp检测方法的特异性检测结果。

图4为本发明实施例中实验三电泳判定lamp检测的特异性检测结果。

图5(a)为本发明实施例中实验三lamp检测方法的灵敏度检测结果。

图5(b)为本发明实施例中实验三lamp检测方法的灵敏度检测结果。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

一种可视化检测mcr-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，其特征在于，引物组包括外引物f3和b3，内引物fip和bip；

引物组中各引物的核苷酸序列分别如下所示：

外引物f3：caacaccatccgctacac；

外引物b3：tccaggtgacatccacac；

内引物fip：agcaacgcggtgttgtacttgattggagagatgattgcca；

内引物bip：catggtgaatcactgggagcattaaggaacacgggtctgatc；

内引物和外引物，通过从美国基因数据库检索获得mcr-3基因序列，并通过blast软件进行同源性分析，获得mcr-3基因的特异性保守靶序列，再根据该保守靶dna序列，用软件primerdesignv4设计用于对mcr-3基因进行lamp检测的引物；

检测方法包括以下步骤：

s1、提取待测样品的dna；

s2、以步骤s1中提取的基因组dna为模板，在所述引物组的引导下进行等温lamp扩增反应，在lamp反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(hnb)，并将反应液放置在水浴加热锅中；

s3、结果判定：根据步骤s2中的反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在mcr-3基因，紫色表示待测样品中不存在mcr-3基因。

本发明的具体特点还有：

引物组还包括将外引物f3、外引物b3、内引物fip和内引物bip的引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的dna分子。

步骤2中的lamp扩增反应的25ul反应体系含有：待测物的基因组dna1μl、0.8m甜菜碱(betaine)、180μmol/l羟基萘酚兰、8mmmgso4、1.4mmdntpeach、8ubstdnapolymerase、内引物各0.2μm和外引物各1.6μm，用灭菌去离子水补齐到25µl。

步骤s2中的lamp扩增反应条件为：62℃恒温60min。

本发明引物组及其检测方法的发明人在检测方法的反应条件及其性能上，进行了一系列实验研究，确定了制备本发明引物组及其检测方法，使其与现有技术相比具有明显的高效检验优势。

实验一、本发明中lamp扩增反应体系的建立

使用实施例1的用于对mcr-3基因进行lamp检测的四条引物对含mcr-3基因的大肠杆菌进行lamp检测，以获得最佳反应体系及反应条件，具体方法如下：

一、最佳反应体系的确定

在相同反应条件(置62℃恒温60min)下，在反应体系中添加不同浓度的mg²⁺，以确定最佳反应体系，包括以下步骤：

1)以含mcr-3基因的大肠杆菌的基因组dna为模板，在实施例1获得的四条引物的引导下进行lamp扩增，其中，25ullamp反应体系包括：含mcr-3基因的大肠杆菌的基因组dna1μl，0.8m甜菜碱(betaine)，分别添加(6mm、7mm、8mm、9mm、10mm)mgso4，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase，内引物各0.2μm和外引物各1.6μm，180μmol/l的羟基萘酚兰(hnb)；反应条件为置62℃恒温水浴锅中60min。

2)反应结束后进行结果判定：根据反应液的颜色变化判断结果(原理：羟基萘酚兰是金属离子指示剂，能指示反应液中mg²⁺的变化。)，天蓝色表示待测样品中存在mcr-3基因(阳性)，紫色表示待测样品中不存在mcr-3基因(阴性)，参见图1，左侧试管显示天蓝色，中间和右侧试管显示紫色。

判定结果，在8mmmg²⁺浓度下，反应结果最好，故将本发明最佳的mcr-3基因的lamp检测体系定为(25ul)：待测物的基因组dna1μl、0.8m甜菜碱(betaine)、180μmol/l羟基萘酚兰、8mmmgso4、1.4mmdntpeach、8ubstdnapolymerase、内引物各0.2μm和外引物各1.6μm，用灭菌去离子水补齐到25µl。

实验二、本发明中检测方法的条件的确定

在实验一中确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含mcr-3基因的大肠杆菌的基因组dna进行lamp检测，以确定最佳反应条件，包括以下步骤：

1)以含mcr-3基因的大肠杆菌的基因组dna为模板，在实施例1获得的四条引物的引导下进行lamp扩增，分别在不同恒定温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)和反应时间(40min、50min、60min、80min、90min)下反应。

2)结果判定方法同步骤一。

在62℃恒温60min下，反应结果最好；故将最佳的本发明mcr-3基因的lamp反应条件定为置62℃恒温反应60min。

实验三、本发明中检测方法特异性、灵敏性检测

一、本发明mcr-3基因的lamp检测方法的特异性检测

分别以两株含mcr-3基因的大肠杆菌、十株不含mcr-3基因但分别含ndm-5、oxa-10、tem-1b、oxa-1、ctx-m-65、mcr-1、tet（a）、sul2、sul3和qnrd的大肠杆菌的基因组dna为模板，以depc水为阴性对照，检测实施例二获得的最佳的mcr-3基因的lamp检测方法的特异性，检测结果如图3所示。

反应结束后，对lamp扩增产物进行2％琼脂糖凝胶检测，检测结果如图4所示(m，dnamarkerd2000；1和2，两株含mcr-3基因的大肠杆菌；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，分别为含ndm-5、oxa-10、tem-1b、oxa-1、ctx-m-65、mcr-1、tet（a）、sul2、sul3和qnrd的大肠杆菌；13，阴性对照(depc水)。含mcr-3基因的大肠杆菌中检测到了特异性的lamp条带，其余不含mcr-3基因的菌株均未检测到特异性的lamp条带，与用实验三中步骤一的羟基萘酚兰(hnb)染色方法的结果一致，表明本发明的mcr-3基因的lamp检测方法具有较高的特异性，可以在众多细菌耐药基因中特异性地检测到mcr-3基因。

二、本发明mcr-3基因的lamp检测方法的灵敏度检测

检测本发明lamp检测方法与普通pcr方法检测mcr-3基因的灵敏度，方法为：提取含mcr-3基因的大肠杆菌总dna，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍)进行稀释，再以经梯度稀释的dna为模板，分别用本发明检测方法与普通pcr方法进行灵敏度检测。

结果判定方法同实施例2中的步骤一。检测结果如图5所示(a：lamp的灵敏度检测结果。b：普通pcr的灵敏度检测结果。1，1倍稀释；2，10倍稀释；3，10²倍稀释；4，10³倍稀释；5，10⁴倍稀释；6，10⁵倍稀释；7，10⁶倍稀释；8，10⁷倍稀释；9，10⁸倍稀释；10，10⁹倍稀释；11，10¹⁰倍稀释)，本发明mcr-3基因的lamp检测方法可检测到10²倍稀释浓度，而普通pcr方法仅能检测到10倍稀释浓度，表明本发明mcr-3基因的lamp检测法比普通pcr检测方法的灵敏度高10倍。

本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。