一种复合微生物菌剂及其用于土壤增肥和含重金属场地生态恢复的方法与流程

1.本发明属于矿物土壤修复和农业土壤增肥领域，主要面向矿区农田和破坏生态的恢复，高端农业作物品质提高方面，通过使用多种微生物改善土壤肥力，抑制土壤板结，促进重金属固化，促进已破坏生态的植被和微生物生态恢复，从根本上改善农田土壤的生态和质量。


背景技术：

2.矿区农田大多重金属含量高，重金属对植物毒性大导致植被发芽率低，死苗率高，同时由于矿区土壤营养贫瘠，导致植物生长不良，作物产量和品质低。当前农业领域化肥使用过量，导致土壤易板结，重金属含量超标，土壤微生物失衡，农产品重金属超标，农产品品质下降，难以生产高品质农产品，产品附加值也不高。随着人们生活生平的提高和健康意识的增强，人们对有机食品，绿色食品，无公害食品等高端农产品的市场需求越来越大，这些产品的附加值也比普通农产品价格高很多，是农业发展的方向。针对当前农业和生态恢复的不同市场需求，本方法主要是通过多种功能微生物的组合实现不同的目标。通过腐殖质降解微生物实现有机物的自然生态循环，增强土壤肥力的同时抑制土壤板结；通过解磷，解钾菌促进土壤中磷元素和钾元素的释放；通过固氮微生物将空气中的氮气固化成可生物利用的有机氮；通过重金属固化微生物将可溶性重金属进行固化，减少植物对重金属的吸收，从而降低重金属对植物的毒害作用。通过植物和微生物的相互促进作用，促进农业生态环境的恢复，最终达到提高农田肥力，提高农产品产量和质量的目的。


技术实现要素：

3.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂通过从环境中分离多株有助于植物生长的微生物，经人工复配形成微生物菌肥，并且通过向土壤中人为补充微生物菌肥搭建促进植被营养物固化，释放及转化的微生物生态体系，同时通过微生物固化环境中的可溶性重金属，减少植物对重金属的吸收。
4.本发明的另一目的在于提供一种用于土壤增肥和含重金属场地生态恢复的方法，该方法通过向土壤中人为补充微生物菌肥，搭建促进植被营养物固化，释放及转化的微生物生态体系，同时通过微生物固化环境中的可溶性重金属，减少植物对重金属的吸收，从而降低重金属对植物的毒害作用，促进植物生长，逐渐形成微生物促进植物生长，植物促进微生物生长，植物和微生物相互促进的良性循环，从根本上改善土壤生态。
5.为了实现上述目的，本发明提供一种复合微生物菌剂，由下列微生物等质量比混合制成：巨大芽孢杆菌grinml5，盐生固氮菌grinml6，假单胞菌grinml7，地衣芽孢杆菌grinml8，寡营养单胞菌grinml9，短杆菌grinm l2，硫酸盐还原菌em2，硫酸盐还原菌srb-4，脂环酸杆菌biometek-a；
6.其中，巨大芽孢杆菌grinml5分类命名为：巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)
grinml5，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018672；
7.盐生固氮菌grinml6分类命名为：盐生固氮菌(azotobacter salinestris)grinml6，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018673；
8.假单胞菌grinml7分类命名为：假单胞菌(pseudomonas sp.)grinml7，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018674；
9.地衣芽孢杆菌grinml8分类命名为：地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)grinml8，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018675；
10.寡营养单胞菌grinml9分类命名为：寡营养单胞菌(stenotrophomonas sp.)grinml9，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m 2018676；
11.短杆菌grinm l2分类命名为：短杆菌(brevibacterium sp.)grinm l2，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号为：cgmcc no.13064；
12.硫酸盐还原菌em2分类命名为：硫酸盐还原菌(desulfovibrio vulgaris)em2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：cctcc m 2017645；
13.硫酸盐还原菌srb-4的分类名称为：uncultured sulfate-reducing bacterium srb-4，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日期为：2015年9月14日，保藏编号为：cctcc no：m2015535；
14.脂环酸杆菌biometek-a分类命名为：脂环酸杆菌(alicyclobacillus sp.)biometek-a，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：cgmcc no.7038。
15.本发明还提供一种用于土壤增肥和含重金属场地生态恢复的方法，其特征在于，包括如下步骤：
16.1)配制培养基
17.培养基配方为：葡萄糖0-3g/l，蔗糖0-3g/l，甘油0-3g/l，k2hpo
4 0-5g/l，kh2po
4 0-3g/l，mgso
4 0-5g/l，(nh4)2so
4 0-5g/l，k2so
4 0-5g/l，蛋白胨0-5g/l，(nh4)2co
3 0-3g/l，cacl
2 0-0.5g/l，酵母浸提物0-5g/l，乳酸钠0-5g/l，121℃灭菌20min，冷却至室温，其中，各成分不同时为零；
18.2)将权利要求1所述的复合微生物菌剂加入到步骤1)的培养基中，添加质量为培养基质量的1-10％，15-40℃下静置培养1-20天至对数生长期，制成微生物种子液；
19.3)将步骤2)制成的微生物种子液使用步骤1)的培养基，15-40℃下静置培养1-20天至对数生长期，添加种子液体积为培养基体积的1-10％，反复进行放大培养2-3次，制成
微生物菌液；
20.4a)将作物秸秆或落叶进行粉粹至1-20mm，将步骤3)制成的微生物菌液按照固液体积比3:1的比例喷淋到粉碎后的作物秸秆或落叶中，在15-40℃下静置培养5-30天制成固体培养物，然后将固体培养物按照2-50kg/m2的量添加到土壤中；
21.或4b)直接将步骤3)制成的微生物菌液直接按照总量为5-300l/m3的比例分1-100批次喷洒到土壤中，每次间隔时间1天-1年。
22.由于污染地区条件差异很大，对于营养贫瘠，持水能力差，光照强，偏干旱的地区喷洒间隔短一些，可以1天一次；持水能力好一些的地区，光照弱一些的地方可以间隔长一些。喷洒方式可以采用喷淋的方法，原则是保证菌液能有效渗入，不存在外流的情况。所有的修复喷淋随着修复土壤的好转，间隔时间一般都会越来越长，可以将间隔延长到1周、2周，1月，后期养护甚至可以几个月甚至1年喷淋一次。
23.本发明一方面投入对土壤环境中的可溶性重金属进行转化的微生物，降低可溶性重金属对植物的毒害，同时人为补充环境有益微生物(固氮菌、解磷菌、腐殖质降解菌、固碳菌等多种微生物菌种的有机组合)和营养源，通过一段时间的人为干预首先在场地搭建初级的环境微生物生态。
24.矿山里的金属硫化矿会被氧化菌氧化，硫被氧化成硫酸根，金属被氧化成可溶性离子，铁被氧化成三价铁，同时产生氢离子。三价铁是强氧化剂会进一步氧化其它金属硫化矿，在这过程中三价铁变成二价铁，二价铁还会被氧化微生物氧化成三价铁，铁元素起到类似催化剂的促进重金属溶出的恶性作用。而被溶出重金属污染的农田中投入本发明提供的复合微生物菌剂，其中的硫酸盐还原菌em2和硫酸盐还原菌srb-4，可以将尾矿库或农田中的被氧化的硫酸根离子还原成硫负离子，硫负离子可与大多数的可溶性重金属结合形成沉淀，从而起到固化重金属的作用。脂环酸杆菌biometek-a为铁还原菌，可以将三价铁还原成二价铁，从而减少三价铁的作用，抑制受重金属污染尾矿库或农田可溶性重金属的继续溶出，阻止污染的进一步恶化。巨大芽孢杆菌grinml5具有解磷、固钾、促钾的作用，盐生固氮菌grinml6具有固氮作用，假单胞菌grinml7有极强分解有机物的能力，有助于土壤有机物的分解，地衣芽孢杆菌grinml8具有促进有机质分解和固碳作用，能够抑制土壤中病原菌的繁殖和对植物根部的侵袭，减少植物土传病害，促进作物生长，提高种子的出芽率和保苗率的作用，寡营养单胞菌grinml9具有解磷、固氮的作用，短杆菌grinm l2具有腐殖质降解作用和对植物病虫害的拮抗作用。
25.本发明通过一部分微生物固定重金属，提升土壤的ph，另一部分微生物为植被的恢复和生长创造条件，促进植被的恢复，例如依靠固氮微生物固化空气中的氮气成为植物可利用的氮源，依靠解磷微生物溶解土壤中的磷元素为植物提供磷元素，依靠解钾微生物为植物提供钾元素，这些微生物的存在对植物的生长是有利的。通过本发明构建的微生物生态系统改善土壤条件，为植物的生长创造了条件。植被恢复后，植物的落叶等可以再被腐殖质降解微生物分解为植物和微生物生长所需的营养，从而促进植物和微生物的生长。
26.本发明将固定重金属与提供土壤肥力的微生物进行组合，对培养基进行了优化，使所用的培养基可供两大类微生物进行共同培养，使得这两大类微生物同时培养，同时使用，减少了工作程序，减少了培养成本，缩短工作流程。
27.1)本发明所提供复合微生物菌剂为从自然界分离的天然微生物经过复配和特定
的条件制成的复合制剂，不存在生态风险。
28.2)土壤的微生物增肥方法是通过多种微生物的组合从根本上改善土壤结构和生态，通过微生物的作用不断实现营养素的富集和转化，源源不断的提高土壤肥力，一次使用长期有效，不同于化肥等见效时间短。
29.3)土壤的微生物增肥方法不会向土壤中添加重金属等有毒有害物质，相对环保。
30.4)某些微生物具有固化重金属的作用，可以通过重金属的固化减少植物的吸收，从而提高作物的品质。
31.5)土壤的微生物增肥方法会通过有机质的降解和腐殖质的不断积累使土壤通透性大大增加，从而改善土壤品质，抑制土壤板结。
32.6)微生物和植物之间存在相互促进的作用，微生物生态系统的恢复会对植物的生长起到促进作用。
33.本发明的有益效果在于：
34.本发明提供一种复合微生物菌剂以及使用该菌剂进行的土壤增肥和含重金属场地生态恢复的方法，通过从环境中分离多株有助于植物生长的微生物，经人工复配形成微生物菌肥；并且通过向土壤中人为补充微生物菌肥搭建促进植被营养物固化，释放及转化的微生物生态体系，同时通过微生物固化环境中的可溶性重金属，减少植物对重金属的吸收，从而降低重金属对植物的毒害作用，促进植物生长，逐渐形成微生物促进植物生长，植物促进微生物生长，植物和微生物相互促进的良性循环，从根本上改善土壤生态。
附图说明
35.图1为使用本发明所提供的复合微生物菌剂对实施例1在不同阶段的修复效果图。
36.图2为用于收集渗液的集水立管的示意图。
37.图3为使用本发明所提供的复合微生物菌剂对实施例2的广西某农田使用15天以后修复区和对照区对比照片。
38.图4为使用本发明所提供的复合微生物菌剂对实施例2的广西某农田使用75天以后修复区和对照区对比照片。
39.图5为使用本发明所提供的复合微生物菌剂对实施例2的广西某农田使用若干天的修复区和对照区植株高度统计图。
具体实施方式
40.本发明所提供巨大芽孢杆菌grinml5分类命名为：巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)grinml5，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018672，该菌分离自北京市农田。
41.盐生固氮菌grinml6分类命名为：盐生固氮菌(azotobacter salinestris)grinml6，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018673，该菌分离自北京市农田。
42.假单胞菌grinml7分类命名为：假单胞菌(pseudomonas sp.)grinml7，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018674，该菌分离自北京市农田。
43.地衣芽孢杆菌grinml8分类命名为：地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)grinml8，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m2018675，该菌分离自北京市农田。
44.寡营养单胞菌grinml9分类命名为：寡营养单胞菌(stenotrophomonas sp.)grinml9，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2018年10月15日，保藏编号为：cctcc no：m 2018676，该菌分离自北京市农田。
45.短杆菌grinm l2分类命名为：短杆菌(brevibacterium sp.)grinm l2，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号为：cgmcc no.13064，该菌分离自北京市农田。
46.硫酸盐还原菌em2分类命名为：硫酸盐还原菌(desulfovibrio vulgaris)em2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2017年11月1日，保藏编号为：cctcc m 2017645，该菌分离自广西河池河道。
47.硫酸盐还原菌srb-4的分类名称为：uncultured sulfate-reducing bacterium srb-4，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日期为：2015年9月14日，保藏编号为：cctcc no：m2015535，该菌分离自广西河池河道。
48.脂环酸杆菌biometek-a分类命名为：脂环酸杆菌(alicyclobacillus sp.)biometek-a，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2012年12月26日，保藏编号为：cgmcc no.7038，该菌分离自广西河池河道。
49.实施例1
50.某尾矿库面积3万平米，最深130米，因重金属毒性和营养贫瘠，尾矿库表面长期无植被生长。
51.将尾矿库表面土壤划分为修复区与对照区，修复区进行如下处理：
52.1)将冻干保藏的微生物巨大芽孢杆菌grinml5，盐生固氮菌grinml6，假单胞菌grinml7，地衣芽孢杆菌grinml8，寡营养单胞菌grinml9，短杆菌grinm l2，硫酸盐还原菌em2，硫酸盐还原菌srb-4，脂环酸杆菌biometek-a按照等质量比进行复配，制成复合微生物菌肥。
53.2)配制培养基
54.培养基配方为：葡萄糖3g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 1.5g/l，(nh4)2so
4 1g/l，蛋白胨2g/l，cacl
2 0.5g/l，121℃灭菌20min，冷却至室温。
55.3)将复配的复合微生物菌剂加入到培养基中，添加质量为培养基质量的10％，30℃下静置培养5天至对数生长期，制成微生物种子液，采用同样条件放大培养3次制成微生物菌液，放大培养添加微生物种子液的体积为培养基的10％。
56.4)直接将微生物菌液按照总量为300l/m3的比例分批次喷洒到修复区土壤中，采用喷淋的方式，在本次修复中前3次每次喷淋60l/m3，间隔3天，然后按30l/m3间隔7天喷2次，剩下的每次10l/m3，每次间隔2周。
57.间隔喷洒每次计算喷洒量并按照当次喷洒量培养微生物菌液。
58.对照区喷洒按照与修复区所喷洒菌液相同频次和用量的水作对照。
59.实施效果
60.如图1所示，修复前尾矿库表面无植被生长，尾矿库经微生物修复2个月后，表面首先有苔藓类生长，修复6个月后在苔藓的基础上有草生长，修复18个月后尾矿库表面植被恢复。对修复区和对照区(裸露区)渗液进行检测。
61.渗液取样方法为：尾矿库打一竖井，在竖井中植入一根集水立管(如图2所示)，集水立管埋入地下部分周向按照孔间距大约2-3cm(本实施例中为2cm)，每个孔直径大约1-2mm(本实施例中为1mm))打有多个小孔，并沿径向如每隔0.5米深度打一圈孔，通过小孔向管内渗液。管子下端封闭用于聚集渗液，管子上端设有一个可开可关的盖子供取样用。然后用带铁丝的小桶取样。
62.样品通过硝酸纤维素滤头过来除杂后用icp进行检测。检测结果如表1所示。
63.表1不同区域外渗水水质(单位：mg/l)
[0064][0065][0066]
从上述表1可以看出，无论是修复6个月还是修复18个月，修复区比裸露区有大幅下降。经过修复，尾矿库表面重金属被固定，植被逐步修复。由于修复18个月时渗液中重金属含量降低，修复6个月时使用的检测底线为0.1mg/l，并且并未对as进行检测，修复18个月时降低了检测底线并增加了as的检测。从上述水质检测可以看出，修复18个月后的尾矿库表面已经适于植被生长，渗出水质已符合工业污水排放标准。
[0067]
实施例2
[0068]
某矿区农田土壤重金属含量高，营养贫瘠，植物发芽率低，死亡率高，作物产量低，品质低。
[0069]
将农田土壤划分为修复区与对照区，修复区进行如下处理：
[0070]
1)将冻干保藏的微生物巨大芽孢杆菌grinml5，盐生固氮菌grinml6，假单胞菌grinml7，地衣芽孢杆菌grinml8，寡营养单胞菌grinml9，短杆菌grinm l2，硫酸盐还原菌em2，硫酸盐还原菌srb-4，脂环酸杆菌biometek-a按照等质量比进行复配，形成复合微生物菌肥。
[0071]
2)配制培养基
[0072]
培养基配方为：蔗糖1g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 1.5g/l，(nh4)2so
4 1g/l，蛋白胨0.3g/l，cacl
2 0.5g/l，121℃灭菌20min，冷却至室温。
[0073]
3)将复配的复合微生物菌剂加入到培养基中，添加质量为培养基质量的10％，30℃下静置培养5天至对数生长期，制成微生物种子液，采用同样条件放大培养2次制成微生物菌液，放大培养添加微生物种子液的体积为培养基的10％。
[0074]
4)直接将菌液按照总菌液80l/m3的比例分批次喷洒到修复区土壤中。其中，第一次喷30l/m3，第二次20l/m3，剩下的每次10l/m3，每次间隔7天。
[0075]
间隔喷洒每次计算喷洒量并按照当次喷洒量培养微生物菌液。
[0076]
对照区喷洒按照与修复区所喷洒菌液相同频次和用量的水作对照。
[0077]
实施效果
[0078]
将植物玉米在喷完第一次之后以相同密度播种于修复区和对照区，如图3所示，微生物修复15天以后修复区和对照区，从植物长势上可以看出，修复区玉米植株普遍高于对照区，修复区玉米植株约为20cm，而对照区玉米植株在15cm上下；当微生物修复75天以后，如图4所示，修复区和对照区可以看出玉米生长差异显著，对照区植物生长缓慢，稀疏，修复区植物茂盛，浓密，说明菌液为土壤提供了营养。
[0079]
对修复区及对照区分界线两侧1m对应位置30株植株高度(厘米)及统计结果见下表2和图5所示。
[0080]
表1玉米高度测量结果
[0081] 对照组(厘米)修复组(厘米)15天15.73
±
5.9124.87
±
8.2735天63.6
±
30.5773.3
±
25.5342天74.83
±
40.14109.5
±
34.7
[0082]
对对照区和修复区玉米进行重金属含量检测，检测结果如表3所示。
[0083]
表3修复一季后对照区和修复区玉米粒内重金属含量对比(mg/kg)
[0084][0085]
微生物修复是一个相对缓慢的过程，从上述表2可以看出，在重金属污染农田一季玉米粒中重金属含量已经有了明显下降(降低率5％-25％)，可以推测，随着时间的延长，修复区和对照区的差异会进一步增大。
[0086]
在上述实施例中相同菌种组合采用不同培养基是根据待修复场地自身条件来决定的。由于混合微生物生长需要碳源、氮源、硫酸根、还要通过磷酸盐缓冲ph，有些情况需要少量的钙质。因修复场地自身条件差异很大，需要的微生物优势种群会有差异，在调整微生物比例时会涉及使用不同的碳源，如有时候用葡萄糖多一些，有时候用蔗糖多一些，甚至只用其中的一种碳源，那么另一种碳源就可能为零。氮源也是，有时候用无机氮多一些，有时候用有机氮多一些，有时候只用一种氮源，那么另一种氮源就可能为零。重金属固化需要硫酸根为反应物，但当某些场地(例如矿区土壤)已有足够的硫酸根满足固化反应的量，这种情况就可以不用添加硫酸根，硫酸根用量为0，当土壤里边没有硫酸根，这时就需要往里边补充硫酸根。有些农田土壤本身含有大量的碳源或氮源，满足微生物生长需要，这时就可以不用添加碳源和氮源，碳源和氮源就可以为0。因此，这个培养基成分根据环境场地条件而
定，会出现较大差异。
[0087]
从上述实施例可以看出，本发明提供一种复合微生物菌剂以及使用该菌剂进行的土壤增肥和含重金属场地生态恢复的方法，通过从环境中分离多株有助于植物生长的微生物，经人工复配形成微生物菌肥。通过向土壤中人为补充微生物菌肥搭建促进植被营养物固化，释放及转化的微生物生态体系，同时通过微生物固化环境中的可溶性重金属，减少植物对重金属的吸收，从而降低重金属对植物的毒害作用，促进植物生长，逐渐形成微生物促进植物生长，植物促进微生物生长，植物和微生物相互促进的良性循环，从根本上改善土壤生态。