从刺松藻中提取分离多糖的方法与流程

本发明涉及多糖的提取技术领域，尤其是涉及从刺松藻中提取分离多糖的方法。

背景技术：

刺松藻为多年生绿藻，属于绿藻门。藻体呈树枝状，多为鹿角形分支、圆柱形枝体，少数扁平状，内部为海绵形结构，由管状丝状体交织组成，表面有紧密排列的丝状体组成棍棒状囊体。从刺松藻中提取含有糖类的大分子早有研究，例如lovej等人证明了该藻水提物中含有葡聚糖、甘露聚糖、高度硫酸化和丙酮酸化的半乳聚糖和硫酸化的阿拉伯聚糖。但是对提取的多糖的分离纯化仍是个难题。另外，这种海藻的细胞壁是一个高度组合的结构，包括31%(w/w)的甘露糖单元连接成的分子链、9%丙酮酸化的硫酸阿拉伯半乳聚糖和少量的羟脯氨酸糖蛋白抗原决定簇，甘露聚糖和丙酮酸化的硫酸阿拉伯半乳聚糖在细胞壁中间，羟脯氨酸糖蛋白抗原决定簇在细胞壁的边缘区域，特别是在椭圆囊的根尖区。这种结构导致刺松藻中多糖提取率低、要破坏细胞壁结构处理麻烦，所以需要一种理想方法解决这一问题。

技术实现要素：

本发明为了克服从刺松藻中提取多糖提取率低、分离困难的问题，提供从刺松藻中提取分离多糖的方法，水提前通过脂肪酸醚硫酸钠和聚山梨酯-80活性多肽大大促进细胞壁的破裂和多糖的释放，减少了提取时间，提高了多糖提取率，在强阴离子交换色谱柱中通过合适的梯度洗脱制备得到有抗hpv活性的多糖。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

从刺松藻中提取分离多糖的方法，包括以下步骤：

1）对刺松藻进行包括脱脂的预处理后干燥备用；

2）干燥的刺松藻用水在80-100℃下提取1-4h，离心，藻渣重复提取多次，合并上清液浓缩后醇沉，3-9℃下静置过夜，抽滤，加入乙醇洗涤、脱水，烘干得刺松藻热水提粗多糖；

3）用强阴离子交换色谱柱分离刺松藻热水提粗多糖：以nacl溶液梯度洗脱，部分收集器收集，将各组分洗脱液减压浓缩，透析脱盐，冷冻干燥得产物多糖。

本发明将刺松藻经过脱脂等预处理后用热水提取、醇沉的方法制得刺松藻热水提粗多糖。离子交换色谱柱具有开放性支持骨架，允许多糖这种大分子自由进入和迅速扩散，故吸附容量大，而且其具有多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高的优点；阴离子交换色谱柱有亲水性，对大分子的吸附不太牢固，用温和条件即可洗脱，不会引起变性。

作为优选，所述步骤1）中的预处理还包括破坏细胞壁，所用试剂为脂肪酸醚硫酸钠和聚山梨酯-80的乙醇溶液，其中脂肪酸醚硫酸钠添加质量为刺松藻的0.5-2%，聚山梨酯-80添加质量为刺松藻的3-5%。聚山梨酯-80对疏水性物质有强亲和力，可以结合并溶解细胞壁的脂类，有助于增加细胞壁的通透性。脂肪酸醚硫酸钠可以与羟脯氨酸糖蛋白抗原决定簇反应，破坏细胞壁的外层，使多糖易于渗出被提取；另外脂肪酸醚硫酸钠还可以溶解蛋白，起到除蛋白的作用。乙醇除了作为溶剂，还能溶解细胞壁中磷脂层，促进细胞破壁。利用脂肪酸醚硫酸钠和聚山梨酯-80的乙醇溶液增加细胞壁通透性，相比于物理破碎细胞阀，能保持细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于后续的过滤分离。

作为优选，所述破坏细胞壁的过程为：将刺松藻溶于最少量的50-70℃的水中，加入乙醇溶液，其中乙醇溶液的体积为水的5-20%，剧烈搅拌2-3h，离心取水相，过滤取滤饼。

作为优选，所述步骤2）中提取用水的质量为刺松藻的10-30倍，洗涤用乙醇为2-5倍体积的95%乙醇，脱水用无水乙醇。

作为优选，所述步骤3）中nacl溶液梯度洗脱的浓度依次为0、0.1m、0.25m、0.5m、0.75m、1m和2m。在大量试验基础上，这个条件下洗脱效果最理想。

作为优选，所述步骤3）中柱体积60ml；上样量60mg；流速0.5ml/min洗脱2个柱体积后以2ml/min洗脱。

作为优选，所述多糖中的单糖组成为半乳糖和阿拉伯糖，硫酸根含量为16-25%。制得的多糖是硫酸酯化的半乳阿拉伯聚糖，纯度高、品质质量好，体外抗病毒活性显示其与阿昔洛韦具有相当的抗hpv活性，硫酸基含量较高，有强抗凝血活性，具有较好的开发利用前景。

因此，本发明具有如下有益效果：（1）本发明水提前通过脂肪酸醚硫酸钠和聚山梨酯-80活性多肽大大促进细胞壁的破裂和多糖的释放，减少了提取时间，提高了刺松藻多糖提取率，而且相比于物理破碎细胞阀，能保持细胞外形完整，得到的浆液粘度低，易于后续的过滤分离；（2）离子交换色谱柱具有开放性支持骨架，允许多糖这种大分子自由进入和迅速扩散，故吸附容量大，而且其具有多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高的优点；阴离子交换色谱柱有亲水性，对大分子的吸附不太牢固，用温和条件即可洗脱，不会引起变性；（3）制得的多糖是硫酸酯化的半乳阿拉伯聚糖，纯度高、品质质量好，体外抗病毒活性显示其与阿昔洛韦具有相当的抗hpv活性，具有较好的开发利用前景。

附图说明

图1是实施例1多糖的q-sepharoseff色谱分离图。

图2是实施例1多糖的单糖分析谱图。

图3是实施例1多糖分子量测试结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

1）将刺松藻40℃烘干后粉碎过60目筛备用。取刺松藻粉，经85%乙醇回流脱脂2h，重复2次后干燥得脱脂刺松藻粉。接着进行破坏细胞壁处理：将少量水加热至50℃，加入100g脱脂刺松藻粉搅拌，分批加入水至脱脂刺松藻粉刚好溶解，将0.5g脂肪酸醚硫酸钠和5g聚山梨酯-80溶于体积为水体积5%的乙醇中，将乙醇溶液加入脱脂刺松藻粉水溶液中，剧烈搅拌2h，离心取水相，过滤取滤饼，干燥备用；

2）干燥的刺松藻中加入约20倍体积的水，于100℃水浴中电子搅拌机搅拌提取2h，离心，藻渣重复提取2次，合并上清液浓缩后醇沉，于4℃冰箱中静置过夜，抽滤，加入4倍体积的95%乙醇洗涤，无水乙醇脱水，烘干，即得刺松藻热水提粗多糖；

3）采用aktafplc液相色谱仪，q-sepharosefastflow(qff)强阴离子交换色谱柱进行分离纯化，采用0、0.1m、0.25m、0.5m、0.75m、1m和2mnacl溶液分别洗脱2个柱体积，硫酸-苯酚法检测。色谱条件：柱体积60ml；上样量60mg；流速0.5ml/min洗脱2个柱体积后以2ml/min洗脱。部分收集器收集将各组分洗脱液减压浓缩，透析脱盐，冷冻干燥得产物多糖。

分离结果如图1所示。从图1可以看出，样品经0、0.1m、0.25m、0.5m、0.75m、1m和2mnacl梯度洗脱后，得到6个峰。

采用pmp衍生化方法，对各单糖混合标准品和低分子量多糖各组分的单糖组成进行衍生，然后进行高效液相色谱分析。取样品1mg，加入2ml2mol/ltfa，封管后于105℃烘箱中水解10h，加甲醇反复旋转蒸发去除tfa，然后水解产物进行pmp衍生处理。色谱条件：色谱柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18column(5µm,4.6*150mm)；柱温：35℃；流动相：0.1mpbs:ch3cn=83:17(v:v);流速：1.0ml/min；检测器：dad(254nm)。各纯化组分的单糖组成分析谱图见图2，pmp柱前衍生色谱测得主要单糖组成为半乳糖和阿拉伯糖，比例为1:4，硫酸根含量为25%，所以目标多糖是硫酸酯化的半乳阿拉伯聚糖。

如图3所示，多糖分子量测得约为63万。

另外，体外抗病毒活性显示产物多糖与阿昔洛韦具有相当的抗hpv活性。

实施例2

1）取实施例1的脱脂刺松藻粉，进行破坏细胞壁处理：将少量水加热至70℃，加入100g脱脂刺松藻粉搅拌，分批加入水至脱脂刺松藻粉刚好溶解，将2g脂肪酸醚硫酸钠和3g聚山梨酯-80溶于体积为水体积20%的乙醇中，将乙醇溶液加入脱脂刺松藻粉水溶液中，剧烈搅拌3h，离心取水相，过滤取滤饼，干燥备用；

2）干燥的刺松藻中加入约30倍体积的水，于80℃水浴中电子搅拌机搅拌提取4h，离心，藻渣重复提取2次，合并上清液浓缩后醇沉，于9℃冰箱中静置过夜，抽滤，加入2倍体积的95%乙醇洗涤，无水乙醇脱水，烘干，即得刺松藻热水提粗多糖；

3）其他条件同实施例1的3），梯度洗脱换为采用0、0.2m、0.4mnacl溶液分别洗脱。

硫酸根含量20%，其他结果与实施例1相似。

实施例3

取实施例1的脱脂刺松藻粉，进行破坏细胞壁处理：将少量水加热至60℃，加入100g脱脂刺松藻粉搅拌，分批加入水至脱脂刺松藻粉刚好溶解，将1g脂肪酸醚硫酸钠和4g聚山梨酯-80溶于体积为水体积10%的乙醇中，将乙醇溶液加入脱脂刺松藻粉水溶液中，剧烈搅拌3h，离心取水相，过滤取滤饼，干燥备用；

2）干燥的刺松藻中加入约20倍体积的水，于90℃水浴中电子搅拌机搅拌提取1h，离心，藻渣重复提取2次，合并上清液浓缩后醇沉，于3℃冰箱中静置过夜，抽滤，加入5倍体积的95%乙醇洗涤，无水乙醇脱水，烘干，即得刺松藻热水提粗多糖；

3）其他条件同实施例1的3），梯度洗脱换为采用0、0.5m、0.8m、1.0m、1.2m、1.4mnacl溶液分别洗脱。

硫酸根含量16%，其他结果与实施例1相似。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。