一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法与流程

本发明涉及一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法，属于微生物发酵领域。

背景技术：

淡紫拟青霉隶属于半知菌亚门、丝孢钢、丝孢目、丛梗孢科、拟青霉属，在植物根结线虫病害治疗和防治效果方面表现突出，是目前市场上主要应用的菌株。

淡紫拟青霉主要特征是分生孢子梗直立，瓶梗上常有2-4个轮状排列的个孢子梗，呈瓶状或近球形，分生孢子单孢串生，呈纺锤形或椭圆形，孢壁光滑或微粗糙，单个透明无色，成团时呈紫色。

淡紫拟青霉（paecilomyceslilacinus(thom.)samson）属于内寄生性真菌，能寄生多种植物寄生线虫。国内外研究表明：淡紫拟青霉能寄生的植物寄生线虫主要有根结线虫（meloidogynespp）、胞囊线虫（heteroderaspp）、甘薯茎线虫（ditylenchusclestructor）、马铃薯金线虫（globoderarostochiensis）等。

目前，世界上许多线虫专家都在使用淡紫拟青霉来防治根结线虫、胞囊线虫等植物寄生线虫，而且取得了很好的防效。研究表明，淡紫拟青霉对大豆、小麦、棉花、黄麻、番莉、南瓜、茶苗、辣椒、菊花、葡萄、甘蔴、马铃薯、痴子、批橘、甘薯、烟草、花生、香蕉、疲萝、马铃薯、西瓜、甜瓜、番石播、罗汉果、称猴桃、黄瓜等作物的寄生线虫均有防治作用。

自从1961年，捷克学者sasinakova首次使用深层液体发酵生产白僵菌芽生孢子，从而引起了人们广泛的兴趣。虽然液体发酵技术在真菌产孢发酵上，具有条件易控、可重复性强、污染少、产量大、生产周期短等优点，但因其产出的孢子活孢率低影响孢子品质而不能广泛推广。

目前国内外对淡紫拟青霉液体深层发酵产孢技术的控制条件研究较少，基于菌体生长阶段和孢子形成及成熟阶段不同的溶氧和通气需求，将其应用于发酵参数控制，以提高孢子的存活率，在此方面尚无报道。

技术实现要素：

为了解决淡紫拟青霉液体发酵产出的孢子活孢率低的问题，本发明提供了一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法；在液体深层发酵工艺控制上对发酵过程中的通气和溶氧采用分段控制，发酵初期，淡紫拟青霉处于菌丝生长阶段，此时生物量低需氧量少所以采用低通气量和45～50%的较高溶氧来促进菌丝平稳增长，随着发酵进行溶氧下降至15%左右，低氧胁迫开始形成，淡紫拟青霉进入产孢阶段，为了满足产孢和孢子成熟的溶氧需求，因此提供高通气增强菌的获氧量，同时为了不打破低氧胁迫的环境因素，因此维持溶氧在5～10%，从而在促进产孢和孢子成熟过程中也提高了孢子的活孢率；该方法生产的淡紫拟青霉孢子能够用于农作物根结线虫病害的防治，也可以作为微生物肥料用于改善植物生长。

本发明方法包括以下具体步骤：

a、菌种平板的制备

将淡紫拟青霉菌种接种于pda固体培养基上，放入28℃培养箱中培养3～5天，待菌丝长满平板产孢即可；

b、液体摇瓶种子培养

将三角锥形瓶中装入液体培养基，用121℃高压灭菌20min，待冷却至室温后，用打孔器打取菌块接入液体培养基中，并置于恒温培养箱中28℃、200r/min条件下培养24h～30h，获得淡紫拟青霉种子液；

c、发酵罐发酵

在发酵罐中装入液体培养基，用121℃高压灭菌20min后，冷却至26～28℃，将淡紫拟青霉种子液接种于发酵罐中，26～28℃下进行液体深层发酵36～48h，发酵完成后收获孢子；

上述液体深层发酵过程中采用通气和溶氧两段控制法，在0～24h的菌体生长阶段，通气比为3:4～4:4l/（l·min），并通过控制转速使发酵液的初始溶氧值为较高的45～50%，促进菌丝平稳增长；随着发酵延续，溶氧量降至15%左右而开始进入产孢期，从24h到36～48h的孢子形成及成熟阶段，发酵液的溶氧值控制为5～10%，通气比为2:1～2.5:1l/（l·min），促进产孢和孢子的成熟，提高活孢率。

本发明方法具有如下特点：

在发酵工艺控制上通气和溶氧采用两段控制，发酵初期，淡紫拟青霉处于菌丝生长阶段，此时生物量低需氧量少所以采用低通气量和45～50%的较高溶氧来促进菌丝平稳增长，随着溶氧下降至15%左右，低氧胁迫开始形成，淡紫拟青霉进入产孢阶段，为了满足产孢和孢子成熟的溶氧需求因此提供高通气增强菌的获氧量，同时为了不打破低氧胁迫的环境因此维持溶氧在5～10%，从而在促进产孢和孢子成熟过程中也提高了孢子的活孢率；本发明方法简单易行，获得的孢子成活率高，适于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为实施例1中发酵参数控制图；

图2为实施例1中发酵过程通气量控制图；

图3为本发明工艺和其他控制工艺活菌数结果对比图；

图4为本发明工艺和其他控制工艺活孢率结果对比图；

图5为未被侵染的正常虫卵；

图6为淡紫拟青霉菌丝侵染进入虫卵；

图7为淡紫拟青霉菌丝从虫卵中伸出图；

图8为淡紫拟青霉侵染的虫卵解体示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂等如无特殊说明均从商业途径得到。

实施例1：本提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法如下：

（1）菌种平板的制备

取削皮后的马铃薯100g用500ml的水煮沸20min，取汁液，在汁液中添加10g葡萄糖、10g琼脂和水制得500ml溶液，调节ph为6.8-7.0，装入2l三角锥形瓶内，灭菌后倒平板；然后将淡紫拟青霉菌种接种于pda平板上，放入28℃培养箱中培养5天，待菌丝长满平板产孢即可；

（2）液体摇瓶种子培养

将500ml三角锥形瓶中装入100ml液体培养基，用121℃高压灭菌20min，待冷却至室温后，用打孔器打取菌块接入液体培养基中，并置于恒温培养箱中28℃、200r/min条件下培养25h，获得淡紫拟青霉种子液；其中液体培养基配方为：在50ml培养基中含2.25g葡萄糖、1g大豆粉、0.1g磷酸二氢钾、0.015g无水氯化钙、0.015g七水合硫酸镁、0.00185g六水合氯化钴、0.0025g七水合硫酸铁、0.0008g一水合硫酸锰、0.0007g七水合硫酸锌；

（3）发酵罐发酵

在5l发酵罐中装入2l液体培养基，用121℃高压灭菌20min后，冷却至28℃，将淡紫拟青霉种子液按1.5%（v/v）的比例接种于发酵罐中，发酵罐发酵控制参数为温度控制为28℃，通气和溶氧采用两段控制，0-24h为菌体生长阶段，初始溶氧值为48%，通气比为1:1l/（l·min），24-48h为孢子形成及成熟阶段，溶氧维持为5%，通气比为2.5:1l/（l·min）；发酵各参数控制见图1、2，通过约48小时的发酵，收获孢子；发酵罐中液体培养基的配方为：45g/l蔗糖、20g/l大豆粉、2g/l磷酸二氢钾、0.3g/l无水氯化钙、0.3g/l七水合硫酸镁、0.037g/l六水合氯化钴、0.05g/l七水合硫酸铁、0.016g/l一水合硫酸锰、0.014g/l七水合硫酸锌；

发酵过程中，0-24h为菌丝生长阶段，菌丝快速增长，随着溶氧逐渐下降24h后形成低氧胁迫，淡紫拟青霉进入产孢阶段，提供高通气量至5l/min增强菌从气相中获氧量促进产孢和提高孢子活孢率。

在相同培养基配方条件下，本实施例方法同其他控制工艺（其控制参数为温度28℃，0-60h通气量比为1:1l/(l/min)，初始溶氧值为60%）上罐发酵效果对比，结果见图3、4，图中显示本发明方法淡紫拟青霉的活菌数为12.35×10⁸/ml，活孢率36h为86%，48h为71%；明显优于对比工艺，进一步对其进行单因素方差分析表明，本发明方法与对比工艺在发酵36h和48h的活菌数单因素方差分析显著性为p<0.009，p<0.006。

实施例2：本提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法如下：

（1）菌种平板的制备同实施例1步骤（1）；

（2）液体摇瓶种子培养同实施例1步骤（2）；

（3）发酵罐发酵

在5l发酵罐中装入2l液体培养基，用121℃高压灭菌20min后，冷却至26℃，将淡紫拟青霉种子液按1.5%（v/v）的比例接种于发酵罐中，发酵罐发酵控制参数为温度控制为27℃，通气和溶氧采用两段控制，0-24h为菌体生长阶段，初始溶氧值为45%，通气比为3:4l/（l·min），24-40h为孢子形成及成熟阶段，溶氧维持为10%，通气比为2:1l/（l·min）；通过40小时的发酵，收获孢子；发酵罐中液体培养基同实施例1；结果为淡紫拟青霉的活菌数为8.8×10⁸/ml，活孢率36h为81%，40h为72%。

实施例3：淡紫拟青霉液体深层发酵产出的孢子杀根结线虫活性的检验

（1）南方根结线虫虫卵悬液制备

将南方根结线虫病的植物病根剪碎放入容器内，然后添加质量浓度2%的naclo溶液混匀震荡2min，使虫卵囊破裂虫卵悬浮出来；将虫卵悬液注入200目、400目、500目组合成的套筛中，用无菌水缓慢冲洗套筛，过筛后将500目筛的残渣用无菌水缓慢冲洗至无菌容器中，即为收集的虫卵悬液，虫卵悬液浓度为2000个卵/ml。

（2）侵染实验流程

吸取500μl虫卵悬液和50μl浓度为2×10⁸孢子/ml的淡紫拟青霉孢子悬液，在水琼脂平板上混匀，再轻轻涂布开，然后置于28℃培养箱中培养；每12h用1cm直径打孔器随机打取样品块显微镜观察卵侵染情况；

（3）结果

虫卵未被侵染前，表面光滑、形态规整、卵内结构正常，在侵染的初期，表面形成菌丝附着胞，随着侵染的逐步加深，虫卵表面变得褶皱，卵内有菌丝生长和菌丝从卵内长出，直至侵染的最后卵内充满菌丝，在无卵内结构（图5、图6、图7、图8）；以上结果表明本发明液体深层发酵收获的孢子具有良好的侵染活性。