具有免疫调节作用的多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物医学
技术领域：
，具体涉及一种具有抗细菌感染和免疫调节作用的多肽及其应用。
背景技术：
：抗生素的广泛应用，耐药菌株和多重耐药菌株日益增加，临床抗感染治疗已面临严峻挑战，寻找广谱高效的抗细菌、抗病毒药物，仍然是一个十分艰巨的任务。抗菌肽是动物体内极为重要的先天免疫物质，是一种具有高效抗菌、抗病毒、免疫功能的生物活性因子。抗菌肽是宿主非特异性免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，是天然免疫的效应分子。研究表明，抗菌肽有着与传统抗生素完全不同的作用机制，不易诱导耐药菌株的产生；抗菌谱广，对细菌、真菌、病毒、原虫及癌细胞均有作用。在家禽上，已经发现了3个家族的抗菌肽包括cathelicidin，liver-expressedantimicrobialpeptide(leap)，andβ-defensin。这些抗菌肽对于家禽抵抗细菌性、病毒性疾病具有至关重要的作用。相关这些基因的突变或者缺失对于家禽抗微生物感染的能力将有显著的影响。这些些抗菌肽除了具有广谱抗菌活性，同时还有高效的抗真菌、抗病毒、抗原虫和(或)抗肿瘤活性，如bat5和imc7能杀灭钩端螺旋体，对白色念珠菌、隐球菌和包膜病毒和寄生虫都有较好的杀灭作用；一些抗菌肽对疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒等有囊膜病毒有明显的杀伤力。此外，有些抗菌肽同时还具有多种其他的调控功能，如cathelicidin还具有促进伤口愈合、组织损伤修复、化学趋化作用、促血管生成和抗寄生虫等功能，在调节动物机体免疫上有着重要生物学活性。技术实现要素：针对上述问题，本发明的目的在于提供具有抗细菌感染和免疫调节作用的多肽及其应用，本发明的多肽(在本发明中将其命名为多肽gc35)人工合成方便，具有较好的抗菌和免疫调节作用，采用多肽gc35制备的抗细菌感染和免疫调节药物具有较好的临床应用前景。本发明通过下述技术方案实现。具有抗细菌感染和免疫调节作用的多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如seqidno:1所示；本发明所用的多肽gc35可采用常规的化学合成的方法获得，其氨基酸序列为gcpldqmqchnhcqsvryrggyctnflkmtckcyg。上述多肽在制备抗细菌感染和免疫调节药物中的应用。作为优选技术方案，所述抗细菌感染药物的制剂类型为溶液型、胶体溶液型、乳剂型或混悬型。作为优选技术方案，所述抗细菌感染药物包括治疗大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草杆菌或白色念珠菌感染的药物。作为优选技术方案，所述免疫调节药物的给药剂型为口腔速溶药膜、口服液、胶囊、注射剂或透皮吸收制剂。本发明的有益效果：本发明的多肽gc35人工合成方便，具有较好的抗菌和免疫调节作用，采用多肽gc35制备的抗细菌感染和免疫调节药物具有较好的临床应用前景。附图说明图1为本发明多肽gc35对大肠杆菌、金色葡萄球菌，枯草杆菌以及白色念珠菌的抑制效果图。图2为本发明多肽gc35对lps诱导小鼠脾细胞产生细胞因子ifn-γ，tnf-α和il-6的影响。图3为本发明多肽gc35对小鼠脾细胞增殖的影响。图4为本发明多肽gc35对小鼠脾细胞活力的影响。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。实施例1本发明多肽gc35的制备采用fmoc固相合成法，具体步骤如下。称取树脂0.2g放置于干燥洁净的反应管中，加入适量的n,n-二甲基酰胺(dmf)，活化30分钟，将称取第一氨基酸残基1mmol，dmap150mg加入到反应管中，dmf做为溶剂反应3小时；反应完毕后用dmf洗3～6次，加入适当的吡啶和乙酸酐，体积比为1:1，反应30min；反应完毕后dmf洗3～6次；然后用哌啶洗脱氨基酸的保护基团fmoc，洗脱两次，每次15min，再用dmf洗4次，甲醇洗2次。称第二个氨基酸3mmol，hbtu3mmol于反应管中，加入diea0.5ml，反应40分钟，用dmf洗3～6次，加入哌啶溶液两次洗脱氨基酸的保护基团fmoc，每次10分钟，再用dmf洗4次，甲醇洗2次。重复第二个步骤直到最后一个氨基酸残基。最后一个氨基酸反应完毕后，用三氟乙酸切割2小时，反应抽滤，得到多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，再用乙醚洗3～5遍，得到白色固体，经过hplc脱盐冻干得到多肽gc35样本。本发明的多肽gc35的分子质量为4046.70da，等电点为8.65。实施例2多肽gc35对大肠杆菌、金色葡萄球菌，枯草杆菌以及白色念珠菌的抑菌强度。采用纸片法测定多肽gc35对大肠杆菌、金色葡萄球菌，枯草杆菌以及白色念珠菌的抑菌强度。将已制备好的高柱肉汤琼脂培养基加热熔化后，待冷却至50℃左右时，加入肉汤培养基菌液1ml(经过恒温37℃培养18小时的菌液)，轻轻摇动，使之均匀，然后倒入无菌的平皿内，轻轻晃动平皿，以使培养基均匀地平铺在平皿上，待冷却凝固后，用消毒过的镊子将多肽gc35干纸片整齐有顺序的放入平血内，盖上陶瓦盖，标好记号置37℃恒温培养箱内培养24小时，24小时后取出培养基，用卡尺量取抑菌圈大小并记录之，并比较多肽gc35对50μg/ml大肠杆菌、50μg/ml金色葡萄球菌、50μg/ml枯草杆菌、50μg/ml白色念珠菌及6株剂量均为50μg/ml的耐药白色念珠菌的抑菌强度，测定结果见图1。图1的标识中，大肠为本发明多肽gc35对50μg/ml大肠杆菌的抑制效果图；金葡为本发明多肽gc35对50μg/ml金色葡萄球菌的抑制效果图；白念为本发明多肽gc35对50μg/ml白色念珠菌的抑制效果图；枯草为本发明多肽gc35对50μg/ml枯草杆菌的抑制效果图；白念08022710、白念08032821、白念08030102、白念08030401、白念08030809、白念08032815为本发明多肽gc35对6株耐药白色念珠菌的抑制效果图。其中，6株耐药白色念珠菌为医院经临床筛选提供的耐药菌株。由图1可知，多肽gc35对50μg/ml大肠杆菌、50μg/ml金色葡萄球菌，50μg/ml枯草杆菌以及50μg/ml白色念珠菌都有很强的抑制作用，其中多肽gc35对临床上的耐药白色念珠菌也有明显的抑制作用。实施例3多肽gc35对不同细菌的最低抑菌浓度。采用常量肉汤稀释法测定多肽gc35对不同细菌的最低抑菌浓度，结果见表1。表1多肽gc35对不同细菌的最低抑菌浓度种类最低抑菌浓度大肠杆菌17.5μg/ml金色葡萄球菌10.0μg/ml枯草杆菌5.0μg/ml白色念珠菌10.0μg/ml由表1可知，其中多肽gc35对大肠杆菌、金色葡萄球菌，枯草杆菌以及白色念珠菌的最低抑制浓度分别为：17.5ug/ml、10.0ug/ml、5.0ug/ml、10.0ug/ml。实施例4多肽gc35对lps诱导小鼠脾细胞产生细胞因子的影响。首先，断颈处死昆明小鼠，取出脾脏并剥离脂肪组织，用rpmi1640培养基冲洗后剪碎，再用5ml注射器活塞在200目铜筛网中将脾脏研磨分散成单个细胞，细胞悬液1000rpm离心10min，弃上清。加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，冰上裂解3-5min，1000rpm离心10min，弃上清。然后将细胞重悬于含5％胎牛血清的rpmi1640培养基中，轻轻吹打混匀，1000rpm离心10min，弃上清。再次重悬细胞并离心以洗去红细胞裂解液。重悬细胞并用血球计数板计数，使细胞浓度达到1×106/ml，加入到96孔板进行培养，每孔180μl，于37℃，5％co2培养箱中培养4h，再加入lps(2μg/ml)刺激，同时加入样品20μl(样品溶解于rpmi1640培养基中，用0.22μm的滤器过滤，终浓度为5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml)。于37℃，5％co2培养箱继续培养48h后收集细胞上清液，2000rpm离心15min，采用酶联免疫吸附法(elisa)检测上清液中细胞因子的含量。该实验中，同时设置不加lps，加lps刺激但不加样品的孔作为对照，每组设置3个重复。操作方法按照说明书进行，结果见图2。由图2可知，gc35能呈浓度依赖的形式明显抑制lps诱导小鼠脾细胞产生细胞因子ifn-γ，tnf-α和il-6。与单加lps刺激组相比，不同浓度(5，10，20，40μg/ml)的gc35可以使小鼠脾细胞产生的ifn-γ分别降低了6.3％，20％，48％，64％，产生的tnf-α分别降低了4.9％，24％，68％，77％，产生的il-6分别降低了50％，53％，93％，94％。实施例5mtt法检测多肽gc35对小鼠脾细胞增殖的影响。无菌分离小鼠脾细胞，将细胞悬浮于含5％胎牛血清和4μg/ml伴刀豆球蛋白a(cona)的rpmi1640培养基中，使细胞浓度达到1×106/ml，加入到96孔板，每孔180μl，于37℃，5％co2的培养箱中培养4h后加入样品(样品溶解于rpmi1640培养液中，用0.22μm的滤器过滤)，使其终浓度达到5，10，20，40和80μg/ml，继续培养44h。每孔加入5mg/mlmtt20μl，孵育4h，每孔加入二甲亚砜(dmso)150μl，吹打均匀使紫色结晶物充分溶解。酶联检测仪测定570nm处的吸收值，参考波长为630nm。同时设置不加cona和样品的空白对照孔，每个实验组设置6个重复。本实验用不同浓度的gc35作用cona刺激的小鼠脾细胞，测定570nm处的光吸收值并计算细胞活力，结果见图3。由图3可知，gc35浓度为5，10，20，40和80μg/ml与仅用cona刺激的对照组相比细胞活力差别不大，表明gc35不会抑制小鼠脾细胞的增殖。实施例6mtt法检测多肽gc35对小鼠脾细胞活力的影响。无菌分离小鼠脾细胞，稀释成浓度为5×104个/ml的细胞悬液。加入到96孔板，每孔中加180μl细胞悬液，在37℃，5％co2培养箱中培养5-6h。细胞贴壁后，每孔加入用rpmi1640培养基稀释成不同浓度的样品20μl，每个浓度作6个重复，空白对照加入等体积的rpmi1640培养液，培养24h。然后每孔加入5mg/mlmtt20μl，孵育4h，可观察到蓝紫色结晶物。吸出培养基，每孔加150μldmso，振荡混匀，使结晶物充分溶解。于酶联检测仪上测定570nm处的光吸收值，参考波长为630nm。每个实验组设置6个重复。细胞活力计算公式如下：细胞活力(％)＝ax/a0×100(a0为空白对照光吸收值，ax为样品组光吸收值)用不同浓度的gc35作用小鼠脾细胞培养24h，测定570nm处的光吸收值并计算细胞活力，结果见图4。实验结果图4显示在10，20，40和80μg/ml浓度下，gc35对小鼠脾细胞基本没有影响。在160μg/ml能轻微促进细胞增殖。因此gc35对小鼠脾细胞活力基本没有影响。。序列表<110>湖南师范大学<120>具有免疫调节作用的多肽及其应用<130>2019<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35<212>prt<213>人工序列()<400>1glycysproleuaspglnmetglncyshisasnhiscysglnserval151015argtyrargglyglytyrcysthrasnpheleulysmetthrcyslys202530cystyrgly35当前第1页12