一种预示和鉴定公鸡繁殖能力的分子标记方法与流程

本发明具体涉及一种预示和鉴定公鸡繁殖能力的分子标记方法，属于分子标记方法技术领域。

背景技术：

据相关研究报道，雄性鸟类6～7周龄已经具备了繁殖能力，鸡睾丸的大小受遗传因素控制，睾丸较小的公鸡通常繁殖能力较差。敲除雄性小鼠的tcf21基因，小鼠会出现性别反转。性别决定基因sry能够正向调控tcf21基因，然后tcf21再通过调节同一家族的其它基因影响睾丸发育和睾丸支持细胞的分化。

有文献报道，肉鸡的生长速度与生理适应性状呈负相关，所以应用传统的表型选择同时提高生长速度和改善肉鸡生理适应性状比较困难，肉鸡大多数重要经济性状都属于数量性状，而数量性状不仅受许多微效基因调控，而且还有可能受到一个或几个主效基因控制，所以将分子遗传标记育种与传统表型选择相结合能极大提高育种效率，加快育种进展。近年来，随着分子遗传学的迅猛发展，遗传标记逐渐被应用于畜禽的标记辅助选择，此项技术可大大提高育种效率、缩短世代间隔。开展与肉鸡重要经济性状相关基因多态性的研究具有现实意义。

技术实现要素：

为了解决无法从表型上对公鸡繁殖能力进行筛选，本发明提供了一种预示和鉴定公鸡繁殖能力的分子标记方法，所采取的技术方案如下：

1)根据鸡tcf21基因snp位点g.1892a>g上下游512bp序列设计引物tcf21-f和tcf21-r，获得扩增引物；

2)提取鸡的基因组dna；

3)利用步骤1)所得的扩增引物以步骤2)提取的dna为模板，进行鸡基因组dna的pcr扩增，获得扩增产物；

4)利用限制性内切酶bpuei对步骤3)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

5)利用琼脂糖凝胶对步骤4)所得的酶切产物进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，比较各基因型对应的公鸡睾丸性状，确定公鸡睾丸性状标记基因型，即完成预示和鉴定公鸡繁殖能力；

步骤1)中所述引物tcf21-f序列如seqidno：1所示；所述引物tcf21-r如seqidno：2所示；

步骤5)中所述基因型判定标准：①电泳呈现一条带，大小为512bp，则鸡tcf21基因位点g.1892a>g为a碱基，将其命名为aa基因型；②电泳呈现一条带，大小为460bp，则鸡tcf21基因位点g.1892a>g为g碱基，将其命名为gg基因型；③电泳呈现两条带，大小分别为512bp和460bp，则该位点处于杂合状态，将其命名为ag基因型；所述公鸡睾丸性状是指公鸡睾丸重和睾丸比率，所述公鸡睾丸性状标记基因型为gg。

优选的，步骤3)所述的pcr扩增，是25μl反应体系，由下列成分组成：

pcr扩增条件为：94℃变性5min；94℃30sec，63.9℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。

优选的，步骤4)所述的酶切，是10μl反应体系，由下列成分组成：3～5u的内切酶，1μl的buffer，0.3～0.5μg的pcr产物，添加去离子水至10μl；37℃反应3小时。

有益效果

本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明的分子标记方法对公鸡睾丸性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的繁殖能力改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。

附图说明

图1为tcf21基因snp位点g.1892a>g分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

1.本发明涉及的药品和酶如下：

三羟甲基氨基甲烷(tris)，sigmachemicalsco；tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶k(proteinasek)，mmerckco；dl2000，大连宝生物公司；dntp(datp；dttp；dctp；dgtp)、taq酶、dnamarker，北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶bpuei，北京neb公司；琼脂糖(agarose)，原平皓公司。

2.缓冲液与常用试剂的配制如下：

1mtris·cl：121.14gtris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调ph值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

te缓冲液：10mmtris·cl,1mmedta,ph8.0,高压灭菌。

20×set缓冲液：3mnacl,1mtris·cl(ph8.0),20mmedta(ph8.0),高压灭菌。

50×tae缓冲液：242gtris碱，57.1ml冰乙酸,100ml0.5medta(ph8.0),加水至1l。

1mtris·cl：121.14gtris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调ph值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5medta：186.1gedta溶于800ml双蒸水中，用naoh调ph值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

禽血裂解液：10mmtris·cl(ph8.0)，0.1medta(ph8.0),0.5％sds。

实施例1.预示和鉴定公鸡繁殖能力的分子标记方法。

本实施例所述的预示和鉴定公鸡繁殖能力的分子标记方法包括如下步骤：

1)根据鸡tcf21基因snp位点g.1892a>g上下游512bp序列设计引物tcf21-f和tcf21-r，获得扩增引物；

2)提取鸡的基因组dna；

3)利用步骤1)所得的扩增引物以步骤2)提取的dna为模板，进行鸡基因组dna的pcr扩增，获得扩增产物；

4)利用限制性内切酶bpuei对步骤3)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

5)利用琼脂糖凝胶对步骤4)所得的酶切产物进行电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定，比较各基因型对应的公鸡睾丸重和睾丸比率大小，确定公鸡睾丸性状标记基因型，所述公鸡睾丸性状是指公鸡睾丸重和睾丸比率，即完成预示和鉴定公鸡繁殖能力；

步骤1)中引物设计方法如下：

根据鸡tcf21基因snp位点g.1892a>g上下游512bp，所述序列如seqid:3所示，设计引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：

tcf21-f:5’-ttgtctgagacctgtggaatatgtagatgccttga-3’

tcf21-r:5’-ggcaataatcctcagccccacaccga-3’

步骤2)中提取鸡的基因组dna可以采用以下两种方法：

方法一：

(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶k至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。

(2)将溶液冷却至室温，加入5mnacl至终浓度1.5m，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。

(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。

(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀dna。

(5)将dna挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。

(7)将dna干燥后(注意不能太干)溶于200μlte中。

方法二：

(1)将20μl全血加入装有700μl1×set的1.5ml离心管中，轻轻混匀。

(2)加入蛋白酶k(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的sds至终浓度0.5％，55℃消化12h。

(3)待消化完全后，加入等体积的tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀

(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。

(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24：23：1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23：1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(7)向水相中加入1/10体积naac(3m，ph5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀dna。

(8)将dna挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。

(10)加入200μl的te，置50℃水浴中过夜溶解dna。溶解后贮存于-20℃备用。

上述方法中的鸡血来自于东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第二十一世代共675只个体，7周龄时翅静脉采血，edta-na2抗凝。

第二十一世代高脂鸡是第十九世代肉鸡高脂系经过系内繁殖两代后获得的，第二十一世代低脂鸡是第十九世代肉鸡低脂系经过系内繁殖两代后获得的，第十九世代高、低对高、低脂系肉鸡的详细信息记载在genetselevol.2017feb24；49(1):25.doi:10.1186/s12711-017-0299-0.tcf21isrelatedtotestisgrowthanddevelopmentinbroilerchickens.zhangh,naw,zhanghl,wangnzq,wangsz,wangzp,zhangz,lih.

步骤3)中鸡dna的扩增体系反应条件如下：

pcr反应

(1)以鸡dna为模板进行pcr扩增，25ul反应体系中包含以下溶液或试剂：

(2)将上述溶液混合并按以下条件进行pcr反应。

94℃变性5min；94℃30sec，63.9℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸10min。

(3)反应结束后，取pcr反应液(5～10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，检测pcr产物。

步骤4)中酶切鉴定体系及反应条件如下：

3～5u的内切酶bpuei，1μl的buffer，0.3～0.5μg的pcr产物，去离子水添加至10μl；37℃反应3小时。

步骤5)中利用3％琼脂糖凝胶检测酶切结果并进行基因判定，电泳结果有以下三种情况，如图1所示。

①电泳呈现一条带，大小为512bp，则鸡tcf21基因位点g.1892a>g为a碱基，将其命名为aa基因型；②电泳呈现一条带，大小为460bp，则鸡tcf21基因位点g.1892a>g为g碱基，将其命名为gg基因型；③电泳呈现两条带，大小分别为512bp和460bp，则该位点处于杂合状态，将其命名为ag基因型；

对所有鸡只电泳结果进行统计，结果显示，tcf21基因snp位点g.1892a>g的等位基因频率在高、低脂系间存在极显著差异(p<0.01)(表1)。

表1snp位点g.1892a>g在高、低脂系第二十一世代群体中等位基因频率

选择gg基因型的公鸡，组成睾丸重和睾丸比率高的公鸡群体，即作为繁殖能力强的公鸡群体，用于后续育种。

为了验证本实施例所用分子标记方法用于预示和鉴定公鸡繁殖能力的可靠性，进行如下实验：

对东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第二十一世代共675只个体，7周龄屠宰前测定活重，屠宰后测定睾丸重，并除以7周龄活重计算出睾丸比率。

根据群体的特点，构建如下线性模型：

y＝μ+g+f+d(f)+bw7+e

模型用于在东北农业大学高、低脂系肉鸡第二十一世代群体中分析位点多态性与睾丸性状的相关性，y为性状观察值，μ为群体均值，g为基因型固定效应，f为公鸡家系的随机效应，d(f)为公鸡家系内与配母鸡的随机效应，bw7作为协变量，e为剩余值，然后利用jmp7.0统计软件将基因型效应与性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值。p<0.05为显著相关，p<0.01为极显著相关。

从睾丸重和睾丸比率的表型数据来看，低脂系个体的睾丸重和睾丸比率极显著高于高脂系(表2)，低脂系个体的繁殖能力优于高脂系个体。

表2肉鸡高、低脂系第二十一世代群体的睾丸性状表型数据

以肉鸡高、低脂双向选择品系第二十一世代群体为材料，分析位点g.1892a>g对肉鸡睾丸性状的影响，结果显示，位点g.1892a>g多态性与肉鸡睾丸重和睾丸比率显著相关(p<0.05)(表3)。

表3位点g.1892a>g与肉鸡睾丸性状的相关性(p值)

注：*表示显著相关(p<0.05)

对在高、低脂系二十一世代中，与鸡睾丸性状显著相关的snp位点进行不同基因型个体间最小二乘均值的多重比较，结果发现，g.1892a>g位点的gg基因型个体的睾丸重、睾丸比率显著高于ag、aa基因型个体(表4)。

表4tcf21基因g.1892a>g位点不同基因型个体间睾丸性状的比较分析

注：同一行不同字母表示差异显著。

以上结果表明，tcf21基因snp位点g.1892a>g可作为公鸡繁殖能力的候选基因，tcf21基因snp位点g.1892a>g的gg基因型可以用于预示和鉴定公鸡繁殖能力，可以组建gg基因型个体为主的公鸡种群进行选种，从而提高肉鸡的繁殖能力。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>东北农业大学

<120>一种预示和鉴定公鸡繁殖能力的分子标记方法

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>35

<212>dna

<213>g.1892a>g位点上游引物tcf21-f

<400>1

ttgtctgagacctgtggaatatgtagatgccttga35

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>g.1892a>g位点下游引物tcf21-r

<400>2

ggcaataatcctcagccccacaccga26

<210>3

<211>512

<212>dna

<213>多态性分析位点序列

<400>3

ttgtctgagacctgtggaatatgtagatgccttgagaaaaacaaaaaaactgactttgac60

agtcatctctatgaactcatttgccctaaagatatatagatatattttcttcaagcaggt120

ttttgctctatttctgtgaataaaccttcctttccattgaacacggagccgtgtactttt180

cgtttccaactcaccaggcagtgggagcaccacacctggctccctgcggtgggacggggg240

gtccagccctgtgccagggcaaactggggtggggggaacagttggtacatcttcagaccg300

aactccccaaggagggtcaactctgagctcagcagggagcaggagagcagtgagagaaag360

gaactgccttgcctctctttttttcatcgaataacagcaaagccgcgggttttaaccttc420

ctgaggaaccggcgtgggccttcctgcggggctgccgtgggagcgttgaggtggctcatt480

gacagatcggtgtggggctgaggattattgcc512