一种成团泛菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物种质资源的开发与利用
技术领域：
，尤其涉及一种成团泛菌菌株及其应用。
背景技术：
：小麦是我国近半数人口的主粮，保障小麦的生产和质量安全直接关系到我国粮食和食品的安全。近年来，由禾谷镰刀菌(fusariumgraminearium)为优势种的镰刀菌复合种群引起的小麦赤霉病，已成为影响我国小麦产量的最重要病害之一。小麦赤霉病一般流行年份可引起10％-30％的产量损失，大流行年份甚至会导致田块绝收。同时，病菌在侵染小麦时会产生呕吐毒素(deoxynivalenol，脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、玉米赤霉烯酮等多种真菌毒素。其中，呕吐毒素是小麦及其制品中污染率和污染水平最高的真菌毒素。该毒素具有很强的细胞毒性并干扰免疫系统，能引起人畜的多种疾病，严重威胁食品安全。目前，农业生产中防治由小麦赤霉病、番茄灰霉病等真菌病原菌引起的病害主要以多菌灵、戊唑醇等化学杀菌剂为主。但是，随着多菌灵等杀菌剂的长期使用已导致使用次数和用药浓度增加，也提高了病原菌产生对杀菌剂的抗性的风险。同时，由于化学杀菌剂的广谱性，大量使用不但破坏了微生态环境，而且导致非靶标抗性。相对于化学杀菌剂，生物防治剂和天然产物的使用，尤其是微生物杀菌剂的使用具有更加诱人的前景。一方面微生物是地球上最庞大的生物类群，具有广泛的生物多样性，还可以通过生物工程技术大幅度提高目标物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物杀菌剂环境友好，较化学农药更加安全。成团泛菌在自然界中分布较广，是重要的生物防治资源之一。但目前，利用成团泛菌作为生防菌同时防治赤霉病、灰霉病、稻瘟病、水稻纹枯病、大豆炭疽病等植物病原真菌病害及真菌毒素的研究还未见报道。技术实现要素：本发明提供了一种成团泛菌菌株及其应用，该成团泛菌菌株不仅对小麦赤霉病的防治效果高达50-70％，呕吐毒素降低50-80％，而且能够同时防治赤霉病、灰霉病、稻瘟病，大豆炭疽病等植物病原真菌所引起的病害。具体技术方案如下：一种成团泛菌菌株，命名为成团泛菌(pantoeaagglomerans)zju23，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.16174，保藏日期为2018年7月30日。具体的，所述成团泛菌菌株的16srdna序列如seqidno.1所示。本发明还提供了一种生防菌剂，所述菌剂的活性成分为所述的成团泛菌。其中，所述成团泛菌浓度为1×109～1×1010cfu/ml。本发明还提供了一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将所述成团泛菌菌接种于培养液中培养至培养液od600为0.5～0.8，获得种子液；所述培养液可选用lb液体培养基，其配方为：氯化钠10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，调节ph值为7.0；(2)将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，调节发酵液中成团泛菌菌的浓度至1×109～1010cfu/ml，获得所述生防菌剂。其中，所述种子液的接种量优选为1～2％。所述发酵培养基可选用ta培养液，其配方为：k2hpo47g，tri-na-citrate·2h2o0.5g,kh2po43g,mgso4·7h2o0.1g,(nh4)2so42g，ph6.8，1000ml水。本发明中，所述扩大培养是在200l发酵罐中进行的，扩大培养的温度为28℃，时间为60h；发酵液ph值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5-7m3/小时，转速200r/min，罐压0.05-0.1kpa。发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度为1×109～1010cfu/ml。本发明还提供了所述成团泛菌菌株在制备防治小麦赤霉病的生防菌剂中的应用。其中，所述成团泛菌菌株通过控制小麦赤霉病所引起的呕吐毒素来防治小麦赤霉病。具体为：在小麦齐穗期或扬花初期，将含所述的成团泛菌的菌悬液均匀喷施在小麦穗部；所述菌悬液中成团泛菌的浓度为1×108～109cfu/ml。本发明还提供了所述成团泛菌菌株在制备防治禾谷镰刀菌病的生防菌剂中的应用。在平板拮抗试验中，zju23菌株对禾谷镰刀菌的抑菌圈半径为10mm，菌丝抑制率为76％，ec50值为7cfu/ml。zju-23菌株的发酵液上清不仅能有效抑制菌丝生长，还能强烈抑制禾谷镰刀菌ph-1孢子的萌发，处理后的孢子不能形成芽管，萌发率极低。本发明还提供了所述成团泛菌菌株在制备防治稻瘟病、大豆炭疽病、灰霉病和/或水稻纹枯病的生防菌剂中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明获得的成团泛菌菌株不仅对小麦赤霉病的防治效果高达50-70％，呕吐毒素降低50-80％，而且能够同时防治赤霉病、灰霉病、稻瘟病、大豆炭疽病和水稻纹枯病等植物病原真菌病害，防治范围广谱。附图说明图1为实施例1和实施例2中生防菌zju23的菌落形态图以及对不同菌株的拮抗作用图；其中，a为生防菌zju23在培养基上的菌落形态图；b为生防菌zju23对禾谷镰刀菌ph-1的拮抗作用图；c为生防菌zju23对稻瘟病菌的拮抗作用图；d为生防菌zju23对大豆炭疽病菌的拮抗作用图；e为生防菌zju23对灰霉病菌的拮抗作用图；f为生防菌zju23对水稻纹枯病菌的拮抗作用图。图2为实施例2中不同含菌量的zju23在平板中对禾谷镰刀菌ph-1的菌丝生长抑制图和ec50测定结果图；其中，箭头表示wa平板中zju-23(log10cfu/ml)逐渐变小；“ph-1”表示ph-1直接接种在不含有zju23的wa平板上生长的菌落；折线为各生防菌浓度下对应ph-1菌落直径的点连线，直线为折线的趋势线。图3为实施例3中zju23发酵液的无菌上清抑制禾谷镰刀菌ph-1孢子的萌发示意图。图4为实施例3中zju23发酵液的无菌上清、化学药剂戊唑醇和无菌水对照抑制禾谷镰刀菌菌丝生长的活性测试图。图5为实施例4中光照培养箱内无菌水对照和zju23对济麦22的小麦赤霉病防治效果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。实施例1含zju23菌株的生防菌剂的制备1.zju23菌株的获取成团泛菌菌zju23,革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动。在lb培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生黄色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐(见图1a)。其16srdna序列见附件，在ncbi进行比对结果，显示其为成团泛菌(pantoeaagglomerans)。上述成团泛菌(pantoeaagglomerans)已于2018年07月30日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为cgmccno.16174，故命名为成团泛菌(pantoeaagglomerans)zju23cgmccno.16174，简称zju23菌株。2.生防菌剂的制备1)将zju23菌株接种到lb培养液中，于30℃下，180rpm振荡培养12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的od值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；lb培养液的配方为：氯化钠10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，调节ph值为7.0；2)当培养至od600值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1：1000体积比加入装有发酵培养液(ta培养基)的200l发酵罐中，22℃220rpm振荡培养60～72小时，发酵液ph值维持在7.0，溶氧量20％，通气量5-7m3/小时，罐压0.05-0.1kpa。发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为1×109cfu/ml，获得生防菌剂。ta培养基的配方为:k2hpo47g，tri-na-citrate·2h2o0.5g,kh2po43g,mgso4·7h2o0.1g,(nh4)2so42g，ph6.8，1000ml水。实施例2zju23菌株对禾谷镰刀菌的拮抗活性1.zju23菌株对禾谷镰刀菌的平板拮抗活性测定用对峙培养法，将保存于4℃中的禾谷镰刀菌ph-1(模式菌)接种到pda平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为6mm的圆形菌块。将菌丝块接种在wa平板(wa培养基/l：蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，ph＝7.0)的中心，在其四周距中心约25mm处分别接种zju-23，试验以清水为对照组。25℃培养，待菌丝长满平板后记录抑菌圈的大小。根据抑菌圈的大小对对zju-23拮抗禾谷镰刀菌的活性进行评估：0mm，无抑制作用；＜2mm，有轻微的抑制作用；2-5mm，中等抑制作用；＞5mm，较强的抑制作用。抑制率根据式(1)进行计算：抑制率＝[(r1-r2)/r1]×100％(1)；其中，r1为对照病原菌的菌落半径；r2为病原菌在细菌方向的菌落半径。检测结果见图1b。由图1b可见，生防菌zju23对禾谷镰刀菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑制圈半径为13mm，菌丝抑制率为76％。与阴性对照清水处理组相比，拮抗效果十分明显。2.zju-23菌株对其他植物病原菌的平板拮抗活性测定利用与步骤1相同的方法，检测zju-23菌株对灰霉病菌、水稻纹枯病菌、大豆炭疽病菌、稻瘟病菌的拮抗活性。检测结果见图1c～f。由图1c～f可见，zju-23菌株对这些植物病原真菌都具有良好的拮抗效果。3.zju-23菌株抑制禾谷镰刀菌菌丝生长的ec50向50℃的wa培养基中加入梯度稀释的zju23菌株，使zju23的终浓度依次为106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml，制备含生防菌zju23的wa平板。在平板中央接种禾谷镰刀菌ph-1菌碟，25℃培养至无生防菌wa平板上菌丝长满平板时统计数据并进行分析(见图2a和图2b)，测量含各梯度生防菌平板中ph-1菌落的大小，计算半最大效应浓度(ec50)。由图2b可见，随着平板中含菌量的升高，对菌丝抑制率增加。统计结果显示，平板含菌量与抑制率呈现线性关系：y＝-1.45x+7(r2＝0.939)(2)；其中，x为zju-23菌株浓度log10cfu/ml，y为ph-1菌落直径(cm)，r2表示趋势线的估计值与对应的实际数据之间的拟合程度。通过式(2)计算，当平板中zju-23菌量约为103cfu/ml时，能抑制50％禾谷镰刀菌菌丝生长，即zju-23对禾谷镰刀菌的ec50＝103cfu/ml。4.生防菌剂无菌上清抑制禾谷镰刀菌菌丝生长和孢子萌发的活性将实施例1获得的生防菌zju23菌株发酵液，10,000rpm离心10min后取无菌上清。无菌上清经细菌滤器(0.22μm)过滤后待用。将ph-1菌碟接到pda板上，用7mm直径的打孔器在平板的对称位置打2个孔，每孔分别加入25μl制备的无菌上清，以清水为对照组。25℃静止培养3天后观察抑菌效果。由图3可见，该无菌上清能有有效抑制菌丝生长。在含2％蔗糖的清水和zju-23发酵液上清中分别加入终浓度为104个/ml的禾谷镰刀菌ph-1的孢子，每个处理组各取10μl孢子悬浮液置于载玻片上(作5次重复)；玻片置于保湿盒中25℃静止培养，每隔1小时观察各处理组的孢子萌发情况，计算萌发率。由图4可见，无菌上清能强烈抑制禾谷镰刀菌孢子的萌发，zju23发酵液上清处理的ph-1孢子不能形成芽管。对孢子诱导萌发，3小时、6小时后分别统计各处理组的孢子萌发率，统计结果见表1。表1.各处理组的禾谷镰刀菌孢子萌发率处理组3小时6小时清水86％100％zju-23发酵液上清00由表1可见，诱导萌发10小时后，含2％蔗糖的zju23发酵液上清处理的禾谷镰刀菌ph-1，其孢子萌发率仍为0，而含2％蔗糖的清水处理的禾谷镰刀菌ph-1，其孢子萌发率为100％。实施例3zju23菌株对小麦赤霉病及其产生的呕吐毒素防治效果1.光照培养箱内zju-23菌株防治小麦赤霉病的效果评价采集扬花期麦穗，先喷雾接种108cfu/ml(含0.05％tween20)的zju-23菌株至水珠流动为止(约5ml每穗)，后置于光照培养箱中，25℃保湿24h。次日，禾谷镰刀菌ph-1孢子悬浮液(105个/ml，含0.05％tween20)喷雾接种至麦穗(喷雾至形成小水珠，约每穗4ml)，然后置于25℃，90％湿度的光照培养箱内，观察发病情况。试验设zju23及清水对照两个处理组。每个处理组接种15株麦穗，接种后培养至清水处理组的麦穗整穗发病时(见图5)，统计各处理组的发病小穗数量，计算防治效果(见表2)。表2.光照培养箱内各处理组对小麦赤霉病的防治效果由图5和表2可见，zju23菌株在温室试验中能够显著抑制禾谷镰刀菌ph-1在麦穗上的生长及致病。2.zju-23菌株田间防治小麦赤霉病效果评价田间防效试验于2017年、2018年、2019年连续3年在江苏省海安县农科院进行，试验田面积100m2，供试小麦品种为扬麦18，田间土壤肥力中上，小麦长势平衡。将试验田划分为9个区，于小麦齐穗期、扬花初期(喷生防菌时扬花数约为10％)向小麦穗部喷施zju-23生防菌剂、氰烯菌酯和清水，每种处理喷施3个区(3个重复)。zju-23生防菌剂的施用浓度为108cfu/ml，施用剂量为75kg/667m2。25％氰烯菌酯施用剂量为45kg/667m2。喷施两次，第一次喷施后1天进行第二次喷施。第二次喷施的次日向小麦穗部喷雾接种浓度为5×105孢子/ml的禾谷镰刀菌ph-1。待小麦赤霉病病情稳定后进行调查病害情况。病害严重度的分级标准：1级，病穗占全穗的1/4以下；2级，病穗占全穗的1/4一l/2；3级，病穗占全穗的1/2—3/4；4级，病穗占全穗的3/4以上。在试验田的每个区内跳跃5点取样，每点40穗，共计200穗。记录各区内的病穗数，计算病害严重度，防治效果及don毒素抑制效果(见表3，表4，表5)。表3各处理组田间防治小麦赤霉病的效果(2017年)表4.各处理组田间防治小麦赤霉病的效果(2018年)表5.各处理组田间防治小麦赤霉病的效果(2019年)由表3-5病害防效试验数据可以，zju23田间防治小麦赤霉病的防治效果在50-70％之间，显示出较好的应用前景。3.zju-23菌株田间抑制小麦赤霉病毒素产生效果评价待上述田间试验过程中，小麦赤霉病病情稳定并且小麦成熟之后。在试验田的每个区内挑取5点取样，每点100穗。收集麦粒，将田间麦粒用榨汁机打碎，在50℃烘箱中放置24h直到麦粒干燥，称取1g麦粉到50ml离心管中，加入4倍体积的乙腈：水(84:16，v:v)，室温放置6h，三层擦镜纸过滤，滤液中加入等体积的乙酸乙酯，涡旋混匀，溶液在氮吹仪上完全蒸干。加入5ml的乙腈：水(84:16，v:v)溶解，再用puritoxsrcolumns(donvomitoxincolumns,tc-t200)纯化。表6各处理组田间抑制小麦赤霉病毒素产生的效果(2017年)表7各处理组田间抑制小麦赤霉病毒素产生的效果(2018年)表8各处理组田间抑制小麦赤霉病毒素产生的效果(2019年)由表6-8病害防效试验数据可以，田间喷施zju23防治小麦赤霉病对收获麦粒中呕吐毒素降低效果在50-80％之间，显示出较好的控制呕吐毒素，保障食品安全的应用前景。序列表<110>浙江大学<120>一种成团泛菌菌株及其应用。<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1476<212>dna<213>成团泛菌(pantoeaagglomerans)<400>1attgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcggacggtagcacagaggagcttgc60tccttgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgavtggggatctgcccgatagagggg120gataaccactggaaacggtggctaataccgcataacgtcgcaagacaaagagggggacct180tcgggcctctcactatcggatgaacccagatgggattagctagtaggcggggtaatggcc240cacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagac300acggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagctga360tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggag420gaaggcgatggggttaataaccctgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggcta480actccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggc540gtaaagcgcacgcaggcggtctgttaagtcagatgtgaaatccccgggcttaacctggga600actgcatttgaaactggcaggcttgagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagc660ggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaaga720ctgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacg780ccgtaaacgatgtcgacttggaggttgttcccttgaggagtggcttccggagctaacgcg840ttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctact960cttgacatccagcgaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaacgctgagacaggt1020gctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080aacccttatcctttgttgccagcgattcggtcgggaactcaaaggagactgccggtgata1140aaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacaca1200cgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcacaaa1260gtgcgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactccgtgaagtcggaatcgctagta1320atcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtachcaccgcccgtcac1380accatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccac1440tttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaagg1476当前第1页1 2 3