一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的LAMP检测引物及试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒。
背景技术：
：非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。患猪临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，最急性和急性感染死亡率高达100％。家猪、野猪与软蜱是非洲猪瘟自然宿主，非洲猪瘟可在家猪与野猪之间直接传播，也可由软蜱叮咬传播，还可以通过病毒污染的泔水、饲料及各种猪肉制品跨国家和地区传播。发现疫情必须扑杀进行无害化处理，其广泛危害全球猪群，是我国重点防范的外来动物传染病。尚无有效的商品化预防疫苗及特效药。目前cn110093324a公开了一种可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，采用非洲猪瘟中国流行株pig/cn/hlj/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得mgfmgf360-505r缺失和cd2v与mgfmgf360-505r联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致常规方法检测非洲猪瘟病毒结果钧为阳性，无法区分野毒感染致阳性，还是疫苗接种导致阳性。实验室检测经常用到的方法包括：电镜观察，elisa，细胞转染(cft)和血清中和试验；感染组织的组织病理学；以及核酸检测，包括pcr和实时定量pcr(rflp)。然而，以上核酸检测方法虽然能够实现非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株的准确检测，但是其都是属于实验室检测手段，需要借助复杂的仪器和严苛的实验条件，并不适合养殖场和基层单位的现场检测。技术实现要素：本发明第一个方面的目的，针对非洲猪瘟病毒普通检测方法不能区分病毒感染或是疫苗接种的情形，而常规核酸检测手段不便、对仪器的依赖性比较强，不能实现现场检测的技术问题，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株的lamp检测引物组。本发明第二个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株的lamp检测试剂盒。本发明第三个方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株的lamp检测方法。本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株的lamp检测引物组，包括以下a、b两组引物，每组引物包括：一对外引物、一对内引物及一对环引物，a组：外引物：p72-f3：tactgtaacgcagcacag(seqidno:1)；p72-b3：cgataaatttccatcaaagttctg(seqidno:2)；内引物：p72-fip：taacgtatccagagcaagagaatttgaaagttaatagcagatgccg(seqidno:3)；p72-bip：atgaccactgggttggtattccaatgcgattaaaacccccg(seqidno:4)；环引物：p72-lf：cactacggctgatcttgtggtat(seqidno:5)；p72-lb：ccgtggcttcaaagcaaaggtaatc(seqidno:6)；b组：外引物：mgf360-505rqs-f3：ggattatactgggaaaaccat(seqidno:7)；mgf360-505rqs-b3：gctgatattttttagccagagtt(seqidno:8)；内引物：mgf360-505rqs-fip：cagggcttcatttacgggaatgattttcgagcaggaaacaactgt(seqidno:9)；mgf360-505rqs-bip：gcagcgagacgtttcaataaaagttttctatctccttgcttccacc(seqidno:10)；环引物：mgf360-505rqs-lf：caactgtgtgcttatacagcaac(seqidno:11)；mgf360-505rqs-lb：ggcttctaccctttgtaatcaaaac(seqidno:12)。本发明的第二个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株的lamp检测试剂盒，所述试剂盒中包含本发明第一个方面所述的引物组。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括bstdna聚合酶、lamp反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述lamp反应液含有10mmdntp、10×thermopol反应缓冲液、150mmmgso4水溶液。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述阳性对照为含有非洲猪瘟病毒p72基因片段的质粒和含有非洲猪瘟病毒缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述含有非洲猪瘟病毒p72基因片段的序列如seqidno.13所示，所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如seqidno.14所示。根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中两组引物的外引物、环引物，内引物的摩尔比为1:5:10。本发明的第三个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株lamp检测方法，包括以下步骤：s1.提取待测样品dna；s2.以步骤s1中提取的核酸为模板，配置两个25μl反应体系，包括引物、dna聚合酶、lamp反应液和待测样品dna，用无菌水补齐到25μl，然后千63～68℃下反应30～60min，所述两个25μl反应体系分别含有权利要求1中所述的两组引物中的一组；s3.通过肉眼观察反应管中溶液是否变浑浊或通过琼脂糖凝胶电泳验证，确定病毒类型。根据本发明第三个方面所述的方法，步骤s3所述确定病毒类型的方法为：当两个反应管均未变浑浊，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；当两个反应管均变浑浊，则说明样品中含有mgf360-505r基因缺失株；当a组引物反应管变浑浊，b组引物反应管未变浑浊，则说明样品是野毒株并且不含mgf360-505r基因缺失株。根据本发明第三个方面所述的方法，步骤s3所述确定病毒类型的方法为：当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均无梯状条带，则说明未检测到非洲猪瘟病毒；当两个反应管的琼脂糖凝胶电泳均有梯状条带，则说明样品中含有mgf360-505r基因缺失株；当a组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳有梯状条带，b组引物反应管的琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，则说明样品是野毒株并且不含mgf360-505r基因缺失株。本发明的有益效果是：1.本发明基于lamp技术特异性高的特点，所设计的引物仅能特异性扩增非洲猪瘟病毒的基因组序列，且引物设计科学，避免了引物二聚体的形成，保证了反应的顺利进行。选取非洲猪瘟的保守基因序列p72(b646l)作为检测的目标基因，该p72(b646l)基因高度保守，可以保证检测结果的准确性，避免漏检的出现，选取的缺失片段两侧的区域特异性强，避免了假阳性出现。2.本发明提供的非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株lamp检测方法灵敏度高，最低检测极限是101拷贝阳性质粒dna，高于现有技术报道的lamp检测方法。3.本发明提供的检测方法操作简单，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需要恒温水浴即可反应，反应条件温和；而且可以通过肉眼观察浑浊、琼脂糖凝胶电泳或者添加荧光物质进行荧光检测等丰富的途径判定检测结果，适合猪场或者基层检测单位的现场检测。附图说明图1阳性质粒验证图。m：marker；1：pcr鉴定p72(b646l)片段；2：pcr鉴定缺失第27942-35500位两侧区域片段。图2lamp检测结果图。1：a组引物，以质粒p72(b646l)作为模板进行检测；2：a组引物，以质粒360qs作为模板进行检测；3：b组引物，以质粒360qs作为模板进行检测；4：b组引物，以p72(b646l)作为模板进行检测；5：检测去离子水；其中管1，管3显示浑浊。图3lamp检测结果电泳图。m：marker；1：a组引物，以质粒p72(b646l)作为模板进行检测；2：a组引物，以质粒360qs作为模板进行检测；3：b组引物，以360qs作为模板进行检测；4：b组引物，以质粒p72(b646l)作为模板进行检测；5：检测去离子水。图4质粒p72(b646l)作为模板lamp特异性试验结果电泳图。m：marker；1：非洲猪瘟病毒；2：猪瘟病毒核酸；3：猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸；4：猪圆环病毒2型病毒核酸；5：猪丹毒病毒核酸。图5质粒360qs作为模板进行检测lamp特异性试验结果电泳图。m：marker；1：非洲猪瘟病毒；2：猪瘟病毒核酸；3：猪繁殖与呼吸道综合征病毒核酸；4：猪圆环病毒2型病毒核酸；5：猪丹毒病毒核酸。图6质粒p72(b646l)作为模板进行lamp灵敏度试验结果电泳图。m：marker；1：质粒1×106拷贝/μl；2：质粒1×105拷贝/μl；3：质粒1×104拷贝/μl；4：质粒1×103拷贝/μl；5：质粒1×102拷贝/μl；6：质粒1×101拷贝/μl；7：质粒1×100拷贝/μl。图7质粒360qs作为模板进行检测lamp灵敏度试验结果电泳图。m：marker；1：质粒1×106拷贝/μl；2：质粒1×105拷贝/μl；3：质粒1×104拷贝/μl；4：质粒1×103拷贝/μl；5：质粒1×102拷贝/μl；6：质粒1×101拷贝/μl；7：质粒1×100拷贝/μl。图8质粒p72(b646l)作为模板进行lamp灵敏度试验结果图。1：质粒1×106拷贝/μl；2：质粒1×105拷贝/μl；3：质粒1×104拷贝/μl；4：质粒1×103拷贝/μl；5：质粒1×102拷贝/μl；6：质粒1×101拷贝/μl；7：质粒1×100拷贝/μl；其中管1～6显示浑浊。图9质粒360qs作为模板进行检测lamp灵敏度试验结果图。1：质粒1×106拷贝/μl；2：质粒1×105拷贝/μl；3：质粒1×104拷贝/μl；4：质粒1×103拷贝/μl；5：质粒1×102拷贝/μl；6：质粒1×101拷贝/μl；7：质粒1×100拷贝/μl；其中管1～6显示浑浊。具体实施方式以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。实施例1引物设计1.质粒根据genebank上提供的非洲猪瘟病毒基因序列(genbank:mk333180.1)，选取其中的部分片段(seqidno.11所示)，由北京擎科新业生物技术有限公司合成质粒puc57-vir，溶解稀释至1.0×106拷贝/μl。2.阳性质粒的鉴定构建阳性质粒，构建含有目的基因p72(b646l)片段的质粒dna与缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒dna，所述目的基因p72(b646l)片段的序列如seqidno.13所示,所述缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如seqidno.14所示。目的基因p72(b646l)片段：tactgtaacgcagcacagctgaaccgttctgaagaagaagaaagttaatagcagatgccgataccacaagatcagccgtagtgatagaccccacgtaatccgtgtcccaactaatataaaattctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttcaaagcaaaggtaatcatcatcgcacccggatcatcgggggttttaatcgcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatggaaatttatcg(seqidno.13)。缺失第27942-35500位两侧区域片段：ggattatactgggaaaaccatggaactattcaacgagcaggaaacaactgtgtgcttatacagcaacataccctcattcccgtaaatgaagccctgagaacagcagcagcgagacgtttcaataaaagggcttctaccctttgtaatcaaaaccatagaatatggtggaagcaaggagatagccataactctggctaaaaaatatcagc(seqidno.14)。采用外引物p72-f3、p72-b3对阳性质粒p72(b646l)进行pcr扩增，采用外引物mgf360-505rqs-f3、mgf360-505rqs-b3对阳性质粒360qs进行pcr扩增，验证质粒的正确性，所对应的片段大小分别为：287bp和209bp。结果如附图1所示。从图中可以看出，目的基因大小正确、电泳条带清晰、无杂带。3.lamp引物设计和筛选根据genebank公布的非洲猪瘟毒株基因序列，通过http：//primerexplorer.jp设计引物，由北京擎科新业生物技术有限公司合成，引物序列如下表1所示：表1非洲猪瘟病毒野毒株与mgf360-505r基因缺失株lamp检测引物组其中，a组：外引物：p72-f3：tactgtaacgcagcacag(seqidno:1)；p72-b3：cgataaatttccatcaaagttctg(seqidno:2)；内引物：p72-fip：taacgtatccagagcaagagaatttgaaagttaatagcagatgccg(seqidno:3)；p72-bip：atgaccactgggttggtattccaatgcgattaaaacccccg(seqidno:4)；环引物：p72-lf：cactacggctgatcttgtggtat(seqidno:5)；p72-lb：ccgtggcttcaaagcaaaggtaatc(seqidno:6)；b组：外引物：mgf360-505rqs-f3：ggattatactgggaaaaccat(seqidno:7)；mgf360-505rqs-b3：gctgatattttttagccagagtt(seqidno:8)；内引物：mgf360-505rqs-fip：cagggcttcatttacgggaatgattttcgagcaggaaacaactgt(seqidno:9)；mgf360-505rqs-bip：gcagcgagacgtttcaataaaagttttctatctccttgcttccacc(seqidno:10)；环引物：mgf360-505rqs-lf：caactgtgtgcttatacagcaac(seqidno:11)；mgf360-505rqs-lb：ggcttctaccctttgtaatcaaaac(seqidno:12)。实施例2lamp反应体系的建立确定lamp检测的25μl反应体系中各组分的含量及比例，将其置于恒温容器中进行扩增。通过肉眼观察白色浑浊和凝胶电泳相结合，判断检测结果。其中25μl反应体系如表2所示。表225μllamp反应体系名称用量bstdna聚合酶1.0μl10×bstbuffer2.5μldntp2.5μlmg2+/mn2+混合物2.0μl引物6.0μldna模板2.0μlddh2o9.0μl总量25.0μl将浓度为103拷贝的阳性质粒作为检测对象，经试验确定lamp反应温度为65℃，最佳反应时间为50min。结果表明在65℃的条件下反应50分钟，从结果中可以看出，a组引物(针对p72基因)，以质粒p72(b646l)作为模板时呈现白色浑浊(见附图2-1所示)，以质粒360qs作为模板时反应液澄清(见附图2-2所示)。b组引物(针对mgf360-505r基因缺失)，以质粒360qs作为模板进行检测时呈现白色浑浊(见附图2-3所示)，以质粒p72(b646l)作为模板进行检测时反应液澄清(见附图2-4所示)。阴性对照，加入去离子水，反应液显示澄清(见附图2-5所示)。且经电泳验证，阳性结果(出现白色浑浊或沉淀)检测结果出现梯状条(见附图3)。实验结果表明，该反应体系可以直观用肉眼鉴别样本是否是非洲猪瘟病毒阳性，以及是否是mgf360-505r基因缺失毒株。实施例3特异性试验使用常规方法提取非洲猪瘟病毒核酸，猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪圆环2型病毒核酸、猪丹毒病毒核酸提取物作为模板，采用实施例1中lamp检测引物，按照实施例2中反应体系及反应条件分别进行检测，检测引物的特异性。结果见下表表3、附图4表3lamp的特异性测定统计实验结果表明，用该试剂盒检测猪瘟病毒核酸、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸、猪圆环2型病毒核酸、猪丹毒病毒核酸提取物，结果全为阴性。第一套引物检测已知非洲猪瘟病毒核酸，结果为阳性；第二套引物检测360qs质粒，结果为阳性。实施例4灵敏度试验非洲猪瘟病毒阳性冻干质粒p72(b646l)与质粒360qs分溶解稀释到1×106个拷贝数，而后，将稀释到1×106拷贝/μl的质粒做10-0～10-6梯度稀释，分别对不同拷贝数的阳性质粒样本进行lamp扩增和pcr扩增。结果显示，从10-1～10-5倍稀释的质粒溶液中均可扩增到预期的阳性，可测的质粒最低浓度为101拷贝/μl(见附图5、6)，而pcr检测的灵敏度为103拷贝/μl，相比而言，lamp检测的灵敏度提高了100倍。对上述样品检测的灵敏度结果见表4。表4lamp检测实验样品的灵敏度检测结果统计实施例5灵敏度比较试验发明人在研究过程中，对于引物进行了大量的优化工作，特别是环引物，研究发现，环引物对于lamp检测的灵敏度具有重要的影响，以下表5为比较试验的对照组方案，实验组为实施例1中两套引物。表5灵敏度比较试验设置采用实施例2中反应体系及反应条件，在相同的条件下进行对比实验，检测结果见下表6。表6lamp检测实验样品的敏感性检测结果质粒拷贝数106105104103102101100第一套引物阳性阳性阳性阳性阳性阳性阴性对照组1阳性阳性阳性阴性阴性阴性阴性对照组2阳性阳性阳性阳性阴性阴性阴性第二套引物阳性阳性阳性阳性阳性阳性阴性对照组3阳性阳性阳性阴性阴性阴性阴性对照组4阳性阳性阳性阴性阴性阴性阴性结果可见，实施例1中设计的引物，对构建的阳性质粒的灵敏度为10拷贝/μl，其可测到的最小质粒数为101拷贝/μl。相比对照组的引物，本发明实施例1的引物组具有更高的灵敏度，对于猪场净化具有更重要的意义。实施例6lamp检测试剂盒的构建试剂盒包含实施例1中提供的引物组、bstdna聚合酶、lamp反应液、甜菜碱、阳性对照和阴性对照。其中a、b两组引物的外引物、环引物、内引物的摩尔比为1:5:10。lamp反应液含有10mmdntp、10×thermopol反应缓冲液、150mmmgso4水溶液。阳性对照为含有目的基因p72(b646l)片段的质粒dna与缺失第27942-35500位两侧区域片段的质粒dna，目的基因p72(b646l)片段的序列如seqidno.13所示,缺失第27942-35500位两侧区域片段的序列如seqidno.14所示。阴性对照为去离子水。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。sequencelisting<110>华南农业大学肇庆大华农生物药品有限公司<120>一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的lamp检测引物及试剂盒<130><160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1tactgtaacgcagcacag18<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<400>2cgataaatttccatcaaagttctg24<210>3<211>46<212>dna<213>人工序列<400>3taacgtatccagagcaagagaatttgaaagttaatagcagatgccg46<210>4<211>41<212>dna<213>人工序列<400>4atgaccactgggttggtattccaatgcgattaaaacccccg41<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5cactacggctgatcttgtggtat23<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6ccgtggcttcaaagcaaaggtaatc25<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7ggattatactgggaaaaccat21<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8gctgatattttttagccagagtt23<210>9<211>45<212>dna<213>人工序列<400>9cagggcttcatttacgggaatgattttcgagcaggaaacaactgt45<210>10<211>46<212>dna<213>人工序列<400>10gcagcgagacgtttcaataaaagttttctatctccttgcttccacc46<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11caactgtgtgcttatacagcaac23<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<400>12ggcttctaccctttgtaatcaaaac25<210>13<211>287<212>dna<213>人工序列<400>13tactgtaacgcagcacagctgaaccgttctgaagaagaagaaagttaatagcagatgccg60ataccacaagatcagccgtagtgatagaccccacgtaatccgtgtcccaactaatataaa120attctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttca180aagcaaaggtaatcatcatcgcacccggatcatcgggggttttaatcgcattgcctccgt240agtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatggaaatttatcg287<210>14<211>209<212>dna<213>人工序列<400>14ggattatactgggaaaaccatggaactattcaacgagcaggaaacaactgtgtgcttata60cagcaacataccctcattcccgtaaatgaagccctgagaacagcagcagcgagacgtttc120aataaaagggcttctaccctttgtaatcaaaaccatagaatatggtggaagcaaggagat180agccataactctggctaaaaaatatcagc209<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列<400>15aatgggtcttccaaaaggatctac24当前第1页1 2 3