本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高地芽孢杆菌j54及其应用。
背景技术：
烟草特有的亚硝胺（tsnas），是烟草及烟制品中最主要的有害物之一，它是在烟草晒制、处理、发酵和燃烧过程中产生的一类致癌物质，对吸烟者的健康存在严重影响。tsnas主要有4-(n-亚硝基甲基氮)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk),n-亚硝基去甲基烟碱(nnn),n亚硝基新烟草碱(nat)和n-亚硝基假木贼碱(nab)，是已确定的tsnas中含量最高的4种。其中，致癌性最强的是nnk和nnn。改变烟草类型、烟草组织、栽培方式、调制方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸还原酶及亚硝化酶的活性等因素可以调控烟草中tsnas的形成量。但目前关于tsnas降解的方法比较少。因此，为了提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害，分离、筛选一株抗逆性好，能实现烟草特有亚硝胺定向降解的菌株，同时结合烟叶调制和制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，选择适宜的施用方法，为降低烟草中tsnas的含量提供了重要的技术手段。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一株高地芽孢杆菌j54；第二目的在于提供所述的高地芽孢杆菌j54的获取方法；第三目的在于提供所述的高地芽孢杆菌j54的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，一株高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis），命名为j54，经鉴定为高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）的一个株系，是从烟草叶片中分离得到，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc，地址为：武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072），其保藏编号为cctccno:m2019667。
本发明的第二目的是这样实现的，包括分离、筛选及纯化与验证工序，具体包括：
a、分离：将采集的烟草叶片用无菌水清洗，并进行表面消毒，剪碎置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理30min，过滤除去烟草叶片，滤液经真空抽滤，将菌体收集到滤膜上，然后超声波洗脱菌体细胞。收集菌体均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的nim培养基上挑取单菌落分离。
培养条件为：30℃，时间48~72h；
分离培养基成分以g/l计为：na2hpo46g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl0.5g/l,mgso40.12g/l,cacl20.1g/l,nicotine0.5g/l,琼脂15g/l；
b、筛选：将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；
培养条件为：26℃，时间48h；
筛选培养基成分以g/l计为：na2hpo46g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl0.5g/l,mgso40.12g/l,cacl20.1g/l,琼脂15g/l、nnk0.1g/l；
c、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，选取长势旺盛的单菌落，即高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54；
培养条件为：30℃，时间48~72h；
纯化培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l、琼脂15.0g/l，ph7.4；
本发明所述高地芽胞杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：
a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：30℃，时间48h；
斜面培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l、琼脂15.0g/l，ph7.4；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为1v/v%，摇瓶装液量为10-15v/v%，得到发酵菌剂；
培养条件为：37℃，时间12h；
种子培养液成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l，ph7.4；
b、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中nnn、nnk、nab和nat的有效降解。
本发明所述高地芽胞杆菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点：
1、本发明所述高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54是一种烟草特有亚硝胺的高效降解菌，对调制或制丝过程烟叶中nnn、nnk、nab和nat四种主要tsnas的总降解率可达5.2~46.6%。
2、本发明所述高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54大量存在于烟株中，易于分离、培养。同时，使用便捷，工艺简单，成本低廉，对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和普及应用。
3、本发明所述高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54能在含有<90g/lnacl，ph4.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶烘烤、调制、制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为cctccno:m2019667。
所述菌株为革兰氏阳性，杆状，大小为0.6μm～1.0μm×2.0μm～5.0μm，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动。生长温度25～45℃，ph生长适宜范围为ph4～9，nacl耐受性<9％；明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、v.p试验、均为阳性，氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验为阴性，能够利用肌醇、d-山梨醇、甘露糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、d-棉籽糖、麦芽糖、鼠李糖产酸。
所述菌株可在以nnk为唯一碳源的培养基中生长。
所述nnk指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(4-(n-nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone)
所述菌株对调制或制丝过程烟叶中nnn、nnk、nab和nat四种主要tsnas的总降解率可达5.2~46.6%。
一种所述高地芽胞杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
a、分离：将采集的烟草叶片用无菌水清洗，并进行表面消毒，剪碎置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理30min，过滤除去烟草叶片，滤液经真空抽滤，将菌体收集到滤膜上，然后超声波洗脱菌体细胞。收集菌体均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的nim培养基上挑取单菌落分离。
培养条件为30℃，时间48~72h；
分离培养基成分以g/l计为：na2hpo46g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl0.5g/l,mgso40.12g/l,cacl20.1g/l,nicotine0.5g/l,agar15g/l；
b、筛选：将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，划线挑取长势旺盛的单一菌落；
培养条件为：26℃，时间48h；
筛选培养基成分以g/l计为：na2hpo46g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl0.5g/l,mgso40.12g/l,cacl20.1g/l,agar15g/l，nnk0.1g/l；
c、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54菌株；
培养条件为：30℃，时间48-72h；
纯化培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l、琼脂15.0，ph7.4；
步骤a所述的烟草叶片优选为烤烟k326的叶片。
步骤a所述的表面消毒为将烟叶5g用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3min，然后在75%酒精中浸泡30sec，最后用无菌水冲洗3次。
步骤a所述的剪碎是指用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2-3cm的小段。
步骤a所述的磷酸钾缓冲液为0.1m磷酸钾缓冲液(ph7.2)45ml。
步骤a所述的过滤是指用4层纱布过滤。
步骤a所述的滤膜指的是孔径0.2μm滤膜。
步骤a所述的收集菌体的方法为13000rpm离心20min收集菌体，溶于1ml无菌水中。
步骤a所述的尼古丁指的是n-甲基-2[α(β,γ)]-吡啶基四氢吡咯。
步骤b及步骤c所述的nnk指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮。
步骤b所述的筛选培养基优选由不加葡萄糖的m9培养基加入终浓度为0.1g/lnnk制成。
一种所述高地芽胞杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：
a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：30℃，时间48h；
斜面培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l、琼脂15.0g/l，ph7.4；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为1v/v%，摇瓶装液量为10-15v/v%，得到发酵菌剂；
培养条件为：30℃，时间48h；
种子培养液成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l，ph7.4；
b、接种：在烟叶调制过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；
c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中nnn、nnk、nab和nat的有效降解。
步骤a所述的发酵，摇瓶转速为140~160rpm。
步骤a所述的培养条件优选为30℃，时间48h。
步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1×109~1×1010个/ml。
步骤b所述的接种也可以在烟叶调制前进行。
步骤b及步骤c所述的烟叶包括白肋烟、烤烟或晒烟中的任一种。
步骤b所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，具体为烤烟的烘烤过程和晾晒烟的晾晒过程。
步骤b所述的制丝指的是将烟叶原料加工成适合烟支卷制工艺要求的烟丝的加工过程。
步骤c所述的降解，对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30~40%，并于25~35℃的条件下保持5-7天的降解时间。
步骤c所述的降解，喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4~7天的降解时间后，烟叶或烟丝中nnn、nnk、nab和nat的总降解率为5.2~46.6%。
下面通过实施例加以说明：
实施例1
——高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54的获取与鉴定
（1）高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54的获取
a、分离：烤烟k326的叶片样品采自云南省玉溪市。将采集的烟草叶片5g用无菌水清洗，并进行表面消毒，剪碎置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理30min，过滤除去烟草叶片，滤液经真空抽滤，将菌体收集到滤膜上，然后超声波洗脱菌体细胞。收集菌体均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的nim培养基上挑取单菌落分离。
培养条件为30℃，时间48-72h；
分离培养基成分以g/l计为：na2hpo46g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl0.5g/l,mgso40.12g/l,cacl20.1g/l,nicotine0.5g/l,agar15g/l；
b、筛选：培养条件为：26℃，时间48h；
筛选培养基成分以g/l计为：na2hpo46g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl0.5g/l,mgso40.12g/l,cacl20.1g/l,agar15g/l，nnk0.1g/l；
c、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，定名为高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54；
培养条件为：30℃，时间48-72h；
纯化培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l、琼脂15.0g/l，ph7.4；
（2）高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54的鉴定
对上述选育的菌株j54，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：采用ctab法(delsaletal.,1988)小量提取细菌j54基因组dna。pcr扩增选用引物f27/r1492，常规条件扩增，16srdna的序列扩增采用通用引物，上游引物：5'-agagtttgatcatggctcag-3'；下游引物：5'-acggttaccttgttacgactt-3'，pcr产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳后，对所需产物进行切胶回收纯化，将pcr产物与载体pmd18-t连接，从转化的平板上挑取白色菌落，送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
以上实验结果记录如下：
1、形态特征：该菌株于30℃培养，在显微镜下，大小为0.6μm～1.0μm×2.0μm～5.0μm，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动。革兰氏染色为阳性。
2、培养特征：该菌株于30℃在lb平板培养基上培养24h，菌落呈圆形，直径2～3mm，白色不透明，边缘光滑，向上突起，有轻微褶皱，容易挑起，为好氧菌。
3、生理生化特征：该菌株生理生化反应呈阳性的是：明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、v.p试验；生理生化反应呈阴性的反应为：氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验。
4、稳定性特征：该菌株可在含有<90g/lnacl，ph4～9的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，最适宜生长温度为26~37℃，最适宜ph值为7.0~7.5。
5、16srdna序列分析：通过序列比对和生理生化特性将j54菌株鉴定为高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）。
本发明所述的菌株其16srdna序列见序列表。
（3）高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株j54为高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）的一个株系，命名为j54。于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc，地址为：武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编430072），其保藏编号为cctccno:m2019667。
实施例2
——高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54对烟叶烘烤过程中tsnas的降解实验
实验方法：
a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为：30℃，时间48h；
斜面培养基成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l、琼脂15.0g/l，ph7.4；
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为1v/v%，摇瓶装液量为12v/v%，得到发酵菌剂；
培养条件为：30℃，时间48h；
种子培养液成分以g/l计为：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl5g/l，ph7.4；
所得发酵菌剂的有效活菌数为1.1×109个/ml。
b、接种：在烟叶烘烤前，将发酵菌剂按照烟叶重量的4%进行喷施，ck则喷施等量的无菌水；
c、降解：烘烤结束后取样测定tsnas，
tsnas含量检测：准确称取1.00g烟叶样品置于50ml锥形瓶中,然后加入0.1ml2000ng/ml的内标溶液和30ml100mmol/l的乙酸铵溶液,，用振荡器以130rpm振荡30min，然后用0.22μm水相针式过滤器过滤到2ml的色谱瓶中进行lc-ms/ms分析。
实验结果：由表1数据可知，菌株j54对烘烤后烟叶中的tsnas降解效果良好。喷施菌剂的烟叶样品tsnas含量较对照降低了26.6%。其中，nnk、nnn和nat的含量分别降低了25%、25.7%和28.9%。
表1菌株j54对烟草浸提液中tsnas的降解效果
实施例3
——高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54对调制期烟叶中tsnas的降解实验
实验方法：
a、发酵：方法同实施例2
所得发酵菌剂的有效活菌数为1.2×109个/ml。
b、接种：在烟叶调制过程中，采用整株砍收，半叶法进行烟叶调制实验。一半叶片为菌剂喷施处理，另一半采用无菌水喷施作为对照（ck）。在调制前，将发酵菌剂按照烟叶重量的4%进行喷施。
c、降解：将喷施过发酵菌剂的烟叶和对照烟叶置于培养箱内，在30℃，相对湿度为80%的条件下，晾制45天结束后，取样中部叶测定tsnas。
tsnas含量检测：方法同实施例2
实验结果：由表2数据可知，菌株j54能使烟叶中的tsnas含量明显下降，总体下降幅度为46.6%，对四种tsnas均有降解效果。其中，nnn、nab和nat的含量分别降低了60.79%、43.55%和40.94%。
表2菌株j54对调制烟叶中tsnas的降解效果
实施例4
——高地芽胞杆菌（bacillusaltitudinis）j54对烟丝中tsnas的降解实验
实验方法：
a、发酵：方法同实施例2。
所得发酵菌剂的有效活菌数为0.8×1010个/ml。
b、接种：取制丝线上的烟丝，充分混合均匀后分成处理和对照（ck）两组，处理组将发酵菌剂按照烟丝重量的4%进行喷施，对照组喷施等量的无菌水。
c、降解：将喷施过发酵菌剂的烟丝和对照烟丝的水分含量调整到35%，放置于培养箱内在27-30℃，相对湿度为80％的条件下，降解7天。
tsnas含量检测：同实施例2。
实验结果：由表3数据可知，菌株j54能使烟丝中的tsnas含量明显下降，总体下降幅度为5.2%，对四种tsnas均有降解效果。其中，nnk、nab和nnn的含量分别降低了9.5%、7.5%和6.0%。
表3菌株j54对烟丝中tsnas的降解效果
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<120>一种高地芽孢杆菌j54及其应用
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