一株生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的铜绿假单胞菌及其应用的制作方法

本发明属生物技术领域，具体涉及到一种铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）的分离，以及该菌在催化5-羟甲基糠醛生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的应用。

背景技术：

随着石油资源的日益匮乏和全球变暖的加剧，近年来，人们逐渐将目光转移到生物基能源和平台化合的开发和利用。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethy1furfural，hmf）是一种重要的生物基平台化合物，位于美国能源部宣布的“top10+4”平台化合物之列，化学性质比较活泼，可以制备多种衍生物（greenchem,2017,19,4544）。5-羟甲基糠醛经过选择性还原可以制备5-羟甲基-2呋喃甲酸（5-hydroxymethylfuroicacid，hmfca），5-羟甲基-2呋喃甲酸是重要的药物中间体，广泛应用于各种生物可降解材料的制备，也是合成各种聚酯材料和白细胞介素抑制剂的重要合成砌块（greenchem,2014,16,2762），具有重要的应用价值。

目前，5-羟甲基糠醛制备5-羟甲基-2呋喃甲酸的主要方法是通过化学法来实现（chemrev,2013,113,1499）。但化学方法常需使用化学计量的氧化剂或催化计量的重金属催化剂，对环境污染很大。此外，化学法易导致活性羟基或醛基的过度氧化，产生副产物，影响后续分离纯化；并且通常以毒性较大的吡啶、dmso等做为溶剂。近年来，生物催化法作为一种绿色的方法引起了广泛地重视，具有反应条件温和，操作简单，产物选择性高等特点（chemrev,2013,114,1871）。但是，5-羟甲基糠醛是一种微生物抑制物，可在5-羟甲基糠醛中生长的微生物较少，而针对利用5-羟甲基糠醛制备5-羟甲基-2呋喃甲酸的研究还没有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可在5-羟甲基糠醛生长的铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1。

本发明的又一目的是提供一种利用该菌株生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，该方法具有反应时间短，条件温和，对环境无污染，产物选择性高的优点。

本发明的再一目的是提供一种所述菌发酵制备5-羟甲基糠醛的应用，该应用方法操作简单，产量高。

本发明的目的采用下述技术方案实现。

本发明提供一株铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1，保藏编号为cctccno：m2019537，该微生物具有5-羟甲基糠醛耐受性，可在含有5-羟甲基糠醛的培养基中生长发酵。

本发明还提供一种利用铜绿假单胞菌pc-1转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，该方法属于生物催化法，选择性高、操作简单、反应条件温和、用时短且无污染。

所述方法具体包括，将铜绿假单胞菌pc-1接种于含有5-羟甲基糠醛的培养基中培养，获得5-羟甲基-2呋喃甲酸。其中接种量为2.5-20mg/ml，培养基的ph为5.5-8.0、5-羟甲基糠醛的浓度为50-200mm，培养温度为15-45℃，在上述条件下，铜绿假单胞菌pc-1可高效转化5-羟甲基糠醛，5-羟甲基-2呋喃甲酸选择性好。

优选的技术方案中，培养基中5-羟甲基糠醛的浓度为95-105mm。

优选的技术方案中，菌株接种量为9.5-10.5mg/ml。

优选的技术方案中，转化ph为6.8-7.2。

优选的技术方案中，培养温度为32-37℃。

优选的技术方案中，培养过程中，每隔5-7小时向培养基中补加5-羟甲基糠醛，每升培养基中每次补加5-羟甲基糠醛90-110mmol。

有益效果：

1）本发明提供的铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1具有5-羟甲基糠醛耐受性，不光可在含有5-羟甲基糠的培养基中生长，还可催化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸。

2）本发明转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸的方法，具有操作简单，条件温和，转化率高，副产物低，反应时间短等特点。现有技术中均无法达到此效果。通过批次补料或者流加补料的方式获得高产的5-羟甲基-2呋喃甲酸，具有很好的应用前景。

附图说明

图1显示铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1的转化时间对5-羟甲基糠醛（hmf）转换率与5-羟甲基-2呋喃甲酸（hmfca）的产率的影响。

图2显示不同5-羟甲基糠醛浓度对铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosapc-1菌株生长的影响。

图3显示不同ph对5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产率的影响。

图4显示不同温度对5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产率的影响。

图5显示铜绿假单胞菌pc-1接种量对5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产率的影响

图6显示流加补料过程中5-羟甲基糠醛转化率与5-羟甲基-2呋喃甲酸产量的变化。

铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1，已经保藏。分类命名为pseudomonasaeruginosapc-1，保藏日期为2019年07月11日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：cctccno.m2019537。

具体实施方式

材料：

筛选固体培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，nacl2g/l，5-羟甲基糠醛50mm，琼脂3g/l。

增菌培养液：酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，nacl2g/l。

液体培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨5g/l，nacl5g/l，ph7.0。

上述三种培养基中的溶剂均为水。

高效液相检测方法：将反应液通过dionexp680使用kromasil100-5c18柱（4.6mm×250mm）在240nm处检测

实施例一

本实施例说明铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1的分离和鉴定

以高浓度5-羟甲基糠醛为筛选压力从南京、苏州药厂周边土壤等样品中筛选获得铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1。

（1）将土样用去离子水溶解后，将上清液涂布至筛选固体培养基进行培养，培养温度为35℃，培养时间为24～48h。此方法可筛选到耐高浓度5-羟甲基糠醛微生物。

（2）将步骤（1）获得的菌株挑到增菌培养液中进行富集培养，培养温度为35℃，培养12～14h后获得种子液。

（3）将步骤（2）获得的种子液按照0.5mg/ml接种量接种于含有100mm5-羟甲基糠醛的液体培养基中进行转化检测。转化温度为35℃，转化时间为7h，转速为150rpm，通过高效液相检测5-羟甲基糠醛转化为5-羟甲基-2呋喃甲酸转化能力。结果如图1所示，培养转化6h后，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率在85%以上。

通过上述方法，发明人获得了一株具有高效转化5-羟甲基糠醛为5-羟甲基-2呋喃甲酸菌株pc-1。该菌株的16srdna如seqidno.1所示，经过16srdna序列分析，表明该菌株与多株pseudomonasaeruginosa菌的同源性为99%，故属于铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）菌属，并命名为铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1。

经鉴定，铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1的生物学特征为革兰氏阴性菌株，无芽孢，菌落呈淡黄色，轻微隆起，圆形，边缘整齐，湿润、粘稠、易挑起；显微镜观察菌体为杆菌，有的微弯，专性好氧，最适生长温度为25℃～42℃。其生理生化特性表现在：过氧化氢酶反应、氧化酶反应、硝酸还原反应结果为阳性，有动力，氧化葡萄糖、木糖产酸，可利用木糖、蔗糖、甘露糖，不能利用乳糖，淀粉。

实施例二

本实施例说明5-羟甲基糠醛浓度对铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosapc-1生长量及5-羟甲基糠醛的转化率的影响。

按实施例一的方法获得种子液。分别于5瓶装有等体积的液体培养基中加入不同浓度的5-羟甲基糠醛（50mm、75mm、100mm、150mm、200mm），同时以1瓶不加入5-羟甲基糠醛作为对照，混匀后每瓶均按5mg/ml接种量接种，150rpm、35℃培养12h后，用分光光度计测量铜绿假单胞菌pc-1浓度，结果如图2所示，随着5-羟甲基糠醛浓度的增加，菌体的生长逐渐受到抑制。当5-羟甲基糠醛的初始浓度不高于100mm时，培养12h菌体生长量受到的影响较小，当5-羟甲基糠醛的初始浓度高于100mm时，菌体生长受到抑制，几乎停止生长。通过高效液相测定测定5-羟甲基糠醛转化为5-羟甲基-2呋喃甲酸转化能力。当5-羟甲基糠醛的初始浓度为50mm和100mm时，转化率均为100%，当浓度为100mm时，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率最高，达85.4%。因此，选择100mm作为5-羟甲基糠醛的初始添加浓度。

实施例三

本实施例说明不同ph对5-羟甲基-2呋喃甲酸产率与5-羟甲基糠醛转化率的影响

按实施例一的方法获得种子液后，分别以10mg/ml的接种量接种于不同ph（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）含有100mm5-羟甲基糠醛的液体培养基中，150rpm培养35℃、6h后，分别取样进行高效液相检测。结果如图3所示，当ph7.0时，5-羟甲基糠醛转化率达到100%，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率最高，达到89.2%，为最优反应条件。

实施例四

本实施例说明不同温度对5-羟甲基-2呋喃甲酸产率与5-羟甲基糠醛转化率的影响

按实施例一的方法获得种子液后，分别以10mg/ml的接种量接种于ph7.0的含有100mm5-羟甲基糠醛的液体培养基中，分别放置于不同温度（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）的摇床中进行培养、150rpm、反应6h后，分别取样进行高效液相检测。结果如图4所示，当温度达到35℃时，5-羟甲基糠醛转化率达到100%，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率最高，达到90.6%，为最优反应条件。

实施例五

本实施例说明铜绿假单胞菌pc-1接种量对5-羟甲基-2呋喃甲酸产率与5-羟甲基糠醛转化率的影响

按实施例一的方法获得种子液后，按不同接种量（2.5、5、10、15、20mg/ml）分别接种于液体培养基中，并加入100mm的5-羟甲基糠醛，150rpm培养35℃、6h后，分别取样进行高效液相检测。结果如图5所示，随着接种量的变化，5-羟甲基糠醛的转化率和5-羟甲基-2呋喃甲酸产率在10mg/ml都达到最大。当超过10mg/ml后,5-羟甲基糠醛的转化率和5-羟甲基-2呋喃甲酸产率皆下降。因此，选择10mg/ml为最佳的菌株接种量。此条件下，5-羟甲基糠醛的转化率均为100%，5-羟甲基-2呋喃甲酸产率为91.5%。

实施例六

本实施例说明一种利用铜绿假单胞菌pc-1转化5-羟甲基糠醛生产5-羟甲基-2呋喃甲酸在工业上的应用

由图1得知，当5-羟甲基糠醛消耗量逐渐加大时，产物5-羟甲基-2呋喃甲酸浓度逐渐趋于饱和，因此为提高产量，以流加补料方式进行发酵生产。

按照实施例一的方法获得种子液，以10mg/ml接种量接种于含有100mm5-羟甲基糠醛的液体培养液中（5l发酵罐装液量2.5l），以150rpm，35℃培养。以高效液相色谱检测5-羟甲基糠醛转化率和5-羟甲基-2呋喃甲酸产量变化，每隔6h向体系中添加250mmol5-羟甲基糠醛，培养54h后，5-羟甲基糠醛总转化率达到89.8%，产量为808.88mm，产量呈直线增长（图6）。

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<110>南京科技职业学院

扬州大学附属医院

南京钟鼎生物科技有限公司

<120>一株生产5-羟甲基-2呋喃甲酸的铜绿假单胞菌及其应用

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<213>铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）pc-1

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