一株对橙带蓝尺蛾幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一株对橙带蓝尺蛾幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用。

背景技术：

罗汉松（podocarpusmacrophyllus）和竹柏（podocarpusnagi）是我国园林绿化、庭园景观的重要树种，尤其是罗汉松经济价值大，我国每年均要从境外大量引种。橙带蓝尺蛾（milioniabasaliswalker）属鳞翅目（lepidoptera）尺蛾科（geometridae）蓝尺蛾属（milioniawalker1854），是近年来在我国南方地区罗汉松和竹柏上发生的一种重要食叶害虫，严重发生时，将寄主植物的叶片取食殆尽，只剩光秃的枝干，在我国广西、广东、海南、台湾、福建等地区以及国外的日本有发生和严重危害报道。目前，该虫的防治还没有有效手段，多以爆发时喷施化学农药为主。因此，研究该虫的防治技术，尤其是生物防治技术十分必要。

绿僵菌是一种应用较为广泛的虫生真菌，寄主谱广，能寄生200多种昆虫，以及螨类和线虫等。绿僵菌具有适应性强、在土壤中和林间能长期宿存、易规模化生产、对人畜无毒害以及对环境友好等优点，在农林害虫的生物防治中发挥了重要作用。获得对靶标害虫具有高致病力的菌株是真菌杀虫剂应用的基础，优良的菌株不仅要具有良好生长性状，可规模化生产，也要对靶标害虫具有较强的致病力。经检索，目前还未有关于利用绿僵菌防治橙带蓝尺蛾的报道。基于此，为提供橙带蓝尺蛾的生物防治资源，本发明筛选出了对橙带蓝尺蛾幼虫具有较强致病力的优良金龟子绿僵菌菌株，为生产上提供优良菌株和菌剂，对高效防治橙带蓝尺蛾、减轻其带来的危害，同时减少化学农药使用量具有积极的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株对橙带蓝尺蛾幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株金龟子绿僵菌，其分类命名为金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516菌株，已于2019年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：cgmccno.18123。

该金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma2011516菌株，具有以下特征：

该菌株在pda培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径23mm，15天达62mm。菌落初期为白色，质地绒毛状至棉絮状；逐渐扩大，其上产生暗绿色分生孢子并成环状分布，粉末状。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，脱落后聚集成孢子团，大小为（4.5~6.8μm）×（1.8-2.9μm）。最佳生长温度范围为25~30℃。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供用于防治橙带蓝尺蛾幼虫的菌株和菌剂。

本发明所提供的菌剂具体为分生孢子悬浮液。其中孢子悬浮液的浓度为10⁷孢子/ml。

本发明所提供菌剂的有效成分是上述金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516的分生孢子。

本发明所提供的菌剂中的分生孢子悬浮液的制备方法为：将金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516菌株在无菌条件下接入sdy液体培养基中25±1℃振荡培养72h，再转接入ppda平板培养9～10天，待产孢充分后保存备用。从平板上刮取一定量孢子置于灭过菌的0.3‰吐温-80溶液中，配制成1×10⁷孢子/ml的孢悬液。

本发明所提供的所述菌剂可用于防治橙带蓝尺蛾幼虫。

本发明提供的金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516菌株具有如下有益效果：

该菌株的生产性状好，产孢能力强，同时对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力强，采用浓度为10⁷孢子/ml的孢子悬浮液浸渍法接种15天后，橙带蓝尺蛾幼虫死亡率为96.7%，其致死中时（lt50）为5.01天。利用该菌株生产的菌剂，能显著降低橙带蓝尺蛾幼虫林间种群数量。同时该菌株能在土壤中长期宿存，对在土壤中化蛹的橙带蓝尺蛾蛹有显著的控制作用。该菌株的菌剂环保高效，具有持续控制效果，可大幅减少化学农药的使用量，具有良好的应用前景。

菌种名称：金龟子绿僵菌

拉丁学名：metarhiziumanisopliae

菌株编号：fjma201516

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：cgmcc

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年8月26日

保藏中心登记入册编号：cgmccno.18123

附图说明：

图1为金龟子绿僵菌fjma201516菌株在ppda培养基上25±1℃下培养15天的菌落形态图。

图2为健康橙带蓝尺蛾幼虫及其被金龟子绿僵菌fjma201516感染症状。a橙带蓝尺蛾健康幼虫；b:被金龟子绿僵菌fjma201516菌感染状。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中的ppda培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写，其具体配方为每1000ml水中含有马铃薯200g（切块煮熟后过滤，取滤液），葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g。

实施例1金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516的鉴定

形态学鉴定：

将分离纯化的金龟子绿僵菌fjma201516菌株在直径为90mm的平板ppda培养基上于25±1℃条件下培养，4~5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；8~10天后挑取成熟分生孢子制片在显微镜下观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征。该菌株菌落初期为白色，质地棉絮状，4~5天后菌落上产生暗绿色分生孢子并成环状分布。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.2μm~3.3μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.4~6.7μm×1.8-3.0μm。

菌株的its序列扩增、序列测定及分子鉴定

利用金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516菌株的菌丝体提取总dna，然后以所提取的dna为模板，以真菌its区通用引物its4和its5（由上海生工生物工程股份有限公司合成）进行pcr扩增，2×taqpcrmastermix（含染料）12.5µl；引物its4/its5(10µmol/l)各1µl；ddh2o9.5µl；模板dna1µl。pcr反应程序：95℃预变性4min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃延伸7min，用无菌水代替模板作阴性对照。pcr产物经过电泳条带检测后确认样品dna-its区域pcr扩增产物符合测序要求后，将pcr扩增产物进行连接、转化之后，送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行序列测定。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（ncbi）基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。

扩增引物序列：

its4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'。

its5：5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3'。

本发明金龟子绿僵菌菌株的its的序列如seqidno.1所示，序列长度555bp。通过ncbi/blast比对后发现与金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）mh855048.1和fj545320.1同源性最高，分别为100%和99.82%，确认该菌株为金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）。

金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516菌株已于2019年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc），保藏编号为cgmccno.18123。

实施例2金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516的生物学特性

将金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516点接于ppda平板培养基中央，置于25±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个平板（重复），共观察15天。同时记录开始产孢时间，第15天（产孢基本结束）用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含30ml的0.3‰吐温-80无菌水的三角瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。每个平板重复测定3次，取其平均值作为1个重复的孢子数。

表1金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516生物学特性

由表1可见，金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516菌落生长较快，5天菌落直径为23mm，15天菌落直径达62mm，生长3天后菌落上开始出现绿色孢子，产孢量为1.33×10⁸孢子/cm²。

实施例3

金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力测定

试虫收集与饲养：

试虫为橙带蓝尺蛾幼虫，2019年5月12日采集于尤溪县罗汉松苗圃，该苗圃罗汉松被橙带蓝尺蛾严重危害。幼虫采集后即带回实验室，置于养虫笼中，以新鲜罗汉松叶作为饲料饲养。1天后挑选活动正常，3~4龄的幼虫放置于昆虫饲养盒中，每饲养盒放置15头，用于绿僵菌致病力测定。

致病力测定与分析

从ppda平板上刮取一定量金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516孢子置于灭菌的0.3‰吐温-80溶液中，配制成10⁷孢子/ml的孢子悬浮液；使用喷雾法接种，即将配制好的孢悬液均匀喷在幼虫体表，对照以无菌水进行喷雾。接种15头幼虫为1个重复，每重复接种量为1ml孢子悬浮液，设置4个重复，即共接种60头试虫。处理完毕待虫体稍干后，以新鲜罗汉松枝叶进行饲养。接种后每天观察试虫的死亡情况，每2天更换一次饲养枝叶，以轻触试虫虫体无任何反应为死亡标准，死亡后的试虫及时移出养虫盒，置于灭过菌的培养皿进行保湿培养，观察虫体是否有菌丝长出及产孢，确定是否被绿僵菌感染。

同时，以接种对油茶象幼虫的致病力高的金龟子绿僵菌fjma201101（发明专利：201510055121.0）和对老挝拟棘天牛具有致病力的金龟子绿僵菌菌株fjma200902（发明专利：201510559073.9）作为对照，比对不同菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力。

数据统计分析使用dps数据处理系统软件处理，根据观察结果统计接种后15天的幼虫死亡率和感染率。采用dps自带的死亡率-时间机率值分析模块计算绿僵菌对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力，即以时间（d）的对数值为x，将死亡率转换为机率值，并以机率值为y，模拟出致病力回归方程，计算致死中时（lt50）。

采用10⁷孢子/ml的孢子悬浮液接种橙带蓝尺蛾幼虫15天后，其中接种fjma201516菌株的橙带蓝尺蛾幼虫死亡率达96.7%，死亡高峰在3~7天。接种金龟子绿僵菌和fjma201101和fjma200902菌株的橙带蓝尺蛾幼虫15天的死亡率分别为83.3%和85%，比接种fjma201516菌株的低。空白对照组15天后死亡率为10%。实验组幼虫大部分为绿僵菌侵染致死，空白对照组未出现感染。孢子悬浮液浸渍法接种后，金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516对橙带蓝尺蛾幼虫的致死中时为5.01天。金龟子绿僵菌fjma201101和fjma200902菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力分别为7.83和7.12天，显著比接种fjma201516的致死中时长。接种试验结果同时显示出，金龟子绿僵菌fjma201516对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力较金龟子绿僵菌fjma201101（发明专利：201510055121.0）和金龟子绿僵菌菌株fjma200902（发明专利：201510559073.9）强。

表2橙带蓝尺蛾幼虫接种不同金龟子绿僵菌菌株孢子悬浮液后累计死亡率

表3不同金龟子绿僵菌菌株对橙带蓝尺蛾幼虫的致病力分析

实施例4

金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516孢子悬浮液对橙带蓝尺蛾幼虫的林间防治效果

在以麦麸、大米以及谷壳（按体积比1：1：1）为主要成分的固体培养基上固体发酵而得到的的金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）fjma201516孢子，通过稀释法配制成10⁷孢子/ml的孢子悬浮液，配制溶剂为0.3‰吐温-80溶液，为保证效果，该菌剂为现配现用。配制好后，直接使用常规机动喷雾器进行林间喷雾，以喷湿叶面为准，对准有橙带蓝尺蛾幼虫发生的叶面与叶背进行全方位喷雾，在阴天气温不超过30℃时进行喷雾。喷雾后，在林间选取橙带蓝尺蛾幼虫的进行套笼观察，每个套笼里保证橙带蓝尺蛾幼虫不少于30头，共套5个套笼。分别于5天和15天观察幼虫死亡情况。

林间防治效果（表4）表明，通过金龟子绿僵菌fjma201516孢子悬浮液（浓度为10⁷孢子/ml）喷雾后，林间橙带蓝尺蛾幼虫虫口密度随着时间大幅降低，其中5天虫口减退率25.61%，而15天平均虫口减退率达91.60%，林间防治效果良好。而在林间观察防治效果时发现，其实5天后橙带蓝尺蛾幼虫的活力显著降低，取食量明显减少，虽防治效果通过害虫死亡来统计，但实际上防治效果比观测值更好。

表4金龟子绿僵菌fjma201516孢子悬浮液喷雾对橙带蓝尺蛾幼虫的防治效果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要说明的是，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>福建省林业科学研究院

<120>一株对橙带蓝尺蛾幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用

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