用于生产和纯化生产短杆菌肽S的方法与流程

本申请是申请日为2017年05月19日的题为“米氏硫胺素芽孢杆菌菌株及其用途”的中国专利申请号201780033122.2的分案申请。

本发明涉及生物技术并可以用于通过使用米氏硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillusmigulanus)的生产菌株(产生菌，生产菌，产生菌株，producingstrain)vkpmb-10212而生产短杆菌肽s活性物质。所获得的突变菌株能够高产率生产短杆菌肽物质。

背景技术：

已知包括在合成介质(基质，培养基，media)上深层培养短芽孢杆菌(bacillusbrevis)生产菌株而生产短杆菌肽s的方法[v.v.korshunovphysiologyofmetabolismofbacillusbrevissubsp.g.-b.inassociationwithbiosynthesisofgramicidins.-candidate'sdissertation,1962,moscow,msu,v.v.korshunov,n.s.egorovsyntheticmediumforbacillusbrevisculturingandgrammidinproducing.mikrobiologiia,1962；31:3,515-519,v.n.shaposhnikov,i.l.rabotnova,a.b.silaevet.al.methodforproducingcrystallinegramicidins.-inventor'scertificateno.187243,1963,m.b.kupletskayaeffectofaerationongrammidindevelopmentandproductionbycultureofbacillusbrevisvar.g.-b.mikrobiologiia,1965；34:5,905-909,g.g.zharikovanaturalvariabilityofsporebacteriaandbiosynthesisofpolypeptideantibiotics.-doct.diss.,1972,moscow,msu,a.i.berezovskaya,a.n.vypiyach,n.s.egorovet.al.bacillusbrevisstrain101-gramicidins-producing.-inventor'scertificateno.686463,1978,methodforsubmergedculturingbacillusbrevisstrain101forproducinggramicidins,-ru2447143,11/24/2008]。

已知包括培养最具生产力的短芽孢杆菌菌株的生产短杆菌肽s的周期性方法。[t.p.udalovafeaturesofbacillusbrevisvar.g.-bgrowthanddevelopmentassociatedwithbiosynthesisofgramicidins.-cand.diss.,1979,moscow,msu]，其用于当培养短芽孢杆菌菌株101时合成产物[t.p.yudinaphysiologicalandbiochemicalfeaturesofgrammidin-producingbacillusbrevissubsp.g.-b.andvariantsthereof.-cand.diss.,2002,moscow,msu]，其特征在于将单负荷的营养介质(基质，培养基，medium)置于反应器中，接种接种物(接种体，inoculum)，在通气和搅拌的同时培养27小时直至达到6.0和更低的ph。

本发明的目的是建立用于生产工业上高产率的短杆菌肽的更有效的方法以及提供可用于该方法的微生物。通过提供米氏硫胺素芽孢杆菌的新型菌株vkpmb-10212实现了该目的。

技术实现要素：

在一种实施方式中，本发明涉及米氏硫胺素芽孢杆菌细菌菌株vkpmb-10212。

在一种优选的实施方式中，本发明涉及生产短杆菌肽的米氏硫胺素芽孢杆菌细菌菌株vkpmb-10212。

在另一种实施方式中，本发明涉及米氏硫胺素芽孢杆菌细菌菌株vkpmb-10212用于短杆菌肽生产的用途。

培养物的通用和特定名称是米氏硫胺素芽孢杆菌。

登记号：vkpmb-10212。

方法：作为突变体创建菌株。

通过rncimfsui"gosniigenetika"(moscow)鉴定培养物，使用16srna分析法对于菌株号101的鉴定报告的日期是在2009年3月16日。附上保存凭证。保存日期：03/03/2009。保藏单位代码：vkpm-俄罗斯国家工业微生物保藏中心。保藏单位地址：1，多罗泽尼波罗泽德，1，莫斯科，117545，俄罗斯。

菌株的培养和形态学特征：4至8μm长、0.6至0.7μm宽的杆，菌株产生具有0.8至1.0μm的椭圆形肋状物的孢子。它是需氧的。它不液化明胶。它不水解淀粉。它利用胺和铵形式的氮。当在40±1℃的温度下在gauze和brazhnikova琼胶生长介质上培养40-48小时时，它形成圆形的集落，在琼胶表面上突出的，具有限定孔的漏斗状的或点状的中心。集群是米色的、不透明的并具有糊状稠度。可以使用接种回路(环，loop)将它们从琼胶表面容易地除去。集群的形状和尺寸根据介质组成、接种密度和其它因素大幅度改变。在培养过程期间，它可以分离为具有不同的形态和减少的抗生素产量的变体。

菌株的应用领域：抗生素的工业生产。

通过菌株合成的产品：短杆菌肽s盐酸盐(晶体)。

当在摇瓶中在液体“常规实验室”介质中培养72小时时，菌株活性(生产力(生产率，productivity))、其它生产性能产生2±0.3g/l短杆菌肽s，对应于0.2±0.02g短杆菌肽s/g生物质。当在最佳条件下在发酵槽中生长时，短杆菌肽s的具体生长可以最高达0.4g短杆菌肽s/g生物质。到2009年1月27日为止，琼胶介质上保持活跃状态的菌株的平均生产力是2,073g/l短杆菌肽s；有关的杂质含量是15.3％。

用于菌株活性确定的方法包括以下技术：用乙醇从培养液体中提取短杆菌肽s，随后通过高效液相色谱技术确定短杆菌肽s浓度。

用于菌株长期存储的方法、条件和介质组成：在狗尾草属植物上存储孢子，存储植物细胞和孢子处于冻干状态(具有10至20％牛奶)。

用于菌株延长的方法、条件和介质组成：在40℃下在gauze和brazhnikova琼脂介质(基于胺氮的50vol.％或28mg％的酵母水，1％蛋白胨，0.5％nacl，3％琼脂-琼脂，ph7.0)上生长48-72小时。在40℃下在0.75l摇瓶(具有0.1l介质)中在定轨振荡器(220rpm的转速，1m振幅)上在液体半合成“常规实验室”介质(每1升介质：20ml蒸馏的丙三醇、8ml的食品级乳酸40％，9.9gk2hpo4，5gnacl，0.2gmgso4·7h2o，8.12g草酸铵，最高达5mg％的酵母自溶产物)上培养。

最佳条件和发酵介质组成：“发酵常规”介质(30ml丙三醇、24.6ml乳酸40％、2gk2hpo4，5gnacl；0.2gmgso4·7h2o，12g草酸铵，最高达10mg％的酵母自溶产物，最高达20mg％的酪蛋白水解产物、2ml的laprol、杀菌之后的ph在7.02和7.2之间)。通风将是每小时1.25m³o2/m³介质；压力将是0.5atmg；搅拌强度应该提供发酵开始时0.2-0.3mmolo2/l·min的氧气质量传递至发酵最后0.4-1.0mmolo2/l·min，这取决于实现的生物质(0.035至0.045mmolo2/g生物质·min)。恒化器将是在6.4至7.2的ph下。培养将持续16至48小时，这取决于发酵方法。菌株的dna包含hindiii限制位点。

菌株不是动物致病的、植物致病的。

附图说明

图1.编码测试菌株101中的16srna基因的dna片段的限制性内切酶酶切分析。

1.用hindiii限制性内切酶处理的编码测试菌株101的16srna基因的dna片段。

2.标记物1kbdna梯带(10000，8000，6000，5000，4000，3500，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250bp，从下到上)

3.没有用hindiii限制性内切酶处理的编码测试菌株101的16srna基因的dna片段。

图2.基于分析数据，构造具有同源菌株的系统树。

具体实施方式

实施例1.使用16srna测定鉴定物种菌株101

工作计划

i.筛选培养物直到单个集群并获得用于16srna测定的生物质

п.分离dna

iii.选择pcr引物和方案

用于16srdna生产的保守引物：

8f-agagtttgatcctggctcag

926r-ccgtcaattcctttragttt

1492r-ggttacccttgttacgactt

反应方案：

1.95℃持续3min。

2.35个循环

95℃持续30sec。

57℃持续30sec。

72℃持续1min，30sec。

3.72℃持续5min。

iv.16srdna测序、序列比较和家族树结构

在自动测序仪ae3000上进行测序。

对于序列分析，使用专门的种族发生的计算机程序。

结果再现的稳定性。至少三次重复进行pcr反应。

用于样品pcr电泳的条件。

1.0％琼脂凝胶，5v/cm电场下电泳。

v.编码16srna基因的dna片段的限制性内切酶酶切分析

a)16srdna可变区的测序。

测序16srdna可变区提供了用于菌株101的以下组装的核苷酸序列：

atgaaggttttcgatcgtaaagttctgttgttagggaagaaccgccggggatgacctccc

cggtctgacggttncctaaacgagaaagcccccggctaatctacggtgcccagcagccgc

ggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcgg

cttcttaagtcaggtgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggccacttgaaactggga

agcttgagtgcaggagaggagagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatg

tggaggaacacccgtggcgaaggcggctctctggcctgtaactgacgctgaggcgcgaaa

gcgtggggagcgaacaggattagatacccctggtagtccacgccgtaaacgttgagtgct

aggtgttggggactccaatcctcagtgctcgcagctaacgcaat

aagcactccgcctggg

b)测序结果和家族树结构的分析

针对genbank和rdp-ii数据库的初步筛选示出了测试菌株属于以下系统群：细菌；厚壁菌；芽孢杆菌；类芽孢杆菌(paenibacillaceae)；解硫胺素芽孢杆菌群；解硫胺素芽孢杆菌属，与物种米氏硫胺素芽孢杆菌和硫胺素芽孢杆菌(aneurinibacillusaneurinilyticus)同源98％。

将序列与从genbank数据库可获得的细菌的最相关物种的对应序列进行排列。

图解示出由位于rdbii(核糖体数据库项目ii)网址的计算机程序处理的序列结果，其用于确定微生物之间的亲属关系以及建造系统树。

表1.距离矩阵

表2.序列描述

针对16srrnardpii数据库的进一步分析示出与相同的细菌物种的同源现象，以及最相关的物种是米氏硫胺素芽孢杆菌和硫胺素芽孢杆菌。

基于分析数据，构造具有同源菌株的系统树(图2)。

微生物至特定类型的相关性标准是至少97％同族关系。使用该标准，测试菌株可以被称为米氏硫胺素芽孢杆菌或硫胺素芽孢杆菌物种。

对于更精确的鉴定，使用编码16srna基因的dna片段的限制性内切酶酶切分析。

报告米氏硫胺素芽孢杆菌中的该dna片段包含hindiii限制位点，而硫胺素芽孢杆菌不包含该限制位点。

对编码测试菌株101中的16srna基因的dna片段进行限制性内切酶酶切分析。图1示出了分析结果。

用hindiii限制性内切酶处理dna片段之后存在620bp和870bp片段表示hindiii位点包含在来自测试菌株101的dna片段中。该标准允许将测试菌株101称为米氏硫胺素芽孢杆菌物种。

实施例2。用于生产短杆菌肽s的方法

使用发酵技术生产短杆菌肽s。该方法由以下四个步骤组成：在实验室中处理米氏硫胺素芽孢杆菌的生产菌株vkpmb-10212，制备疫苗材料，在实验室发酵槽中培养接种物，在主要的发酵槽中提供短杆菌肽s的生物合成。

基于米氏硫胺素芽孢杆菌的生产菌株vkpmb-10212的形态和稳定性选择发酵的主要参数。用于在恒温箱中在琼脂介质上培养的生产菌株的时间是从48至120小时的范围，并且与在皮氏培养皿上培养相比允许更大体积的接种物。在-20℃和-80℃之间的温度下，将细菌悬浮液存储在15％的保护性丙三醇溶液中。

在实验室发酵槽中在琼脂介质上且在不存在其它微生物的情况下进行接种物的初步制备。

然后将按发酵介质的体积计1至2.5％的量的接种物转移到下一发酵槽中，发酵介质由柠檬酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾、1:1比值的d-和l-乳酸、酵母提取粉末、酪蛋白粉末、消泡剂j647组成。用于发酵过程的最佳参数是从10至20的光密度，从5.5至7.5的ph，不存在其它微生物。发酵过程花费48至120小时。

下一个生产阶段涉及在主要发酵槽中发酵接种物。接种物体积是8至17％的发酵介质，其由柠檬酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾、1:1比值的d-和l-乳酸、酵母提取粉末、酪蛋白粉末、消泡剂struktolj647组成。通过添加氨溶液控制6.5至7.0范围内的最佳ph值。通过添加丙三醇、硫酸铵和玉米淀粉溶液保持最佳的营养浓度。发酵过程花费48至120小时。

使用超滤方法用陶瓷过滤器单元过滤生产的生物质，用去离子水洗涤生物质以除去生物质中的杂质。在180℃下在喷雾干燥器中干燥浓缩的生物质。在40℃下用丙酮洗涤干燥的生物质以除去有色的杂质。通过氮气排空来除去丙酮，随后再用丙酮冲洗一次，以及在45℃下真空干燥。

进一步地，用乙醇萃取短杆菌肽s，用稀盐酸(hcl：乙醇＝1：2)调节ph至3.0-4.0。重复进行萃取，用加压氮气除去萃取物。在乙醇分离之后，在约47℃下在真空下干燥生物质。

将干燥的生物质溶解在水中，以及用活性碳脱色，随后在压滤机上过滤，用乙醇冲洗以降低吸附在碳上导致的产物损失。

将获得的萃取物转移到结晶器中，用去离子水稀释，添加浓缩的氯化钠溶液并加热至55至65℃的温度。澄清之后，将溶液冷却到不高于5℃的温度。将获得的晶体在离心机中分离，以及在至多65℃的温度下在真空下干燥，进一步轴磨，通过400和200μm筛网筛选，并包装在放置于铝容器中的聚乙烯袋中。