本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产透明质酸的方法，尤其涉及一种发酵生产高分子医药级透明质酸的方法及其应用。
背景技术：
透明质酸(hyaluroilicacid，简称ha)又名玻璃酸，是一种大分子粘多糖，由葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖胺通过β-1,3和β-1,4糖苷键反复交替连接而成的一种链状高分子聚合物中。基于透明质酸高粘度、润滑性、保水性、良好的生物相容性及特殊的生理作用，透明质酸在医药、美容、保健食品等领域具有广泛的应用。不同用途的ha对分子量有不同要求，中等分子量(分子量范围1,000-1,800kda)的ha主要用于化妆品，而高分子量(分子量范围1,800-2,200kda)的ha可用于眼科粘性手术、治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少手术后组织黏连中具有很高的应用价值。
透明质酸生产方法有动物器官提取法和细菌发酵法。采用提取法从动物脏器中提取ha时，由于原料有限，生产成本居高不下，造成商品价格昂贵，限制了它在医药和化妆品中的广泛应用。细菌发酵法与动物组织提取法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中的ha以游离形式存在、易于分离纯化、成本低、易于形成规模化工业生产、无动物来源致病病毒污染的危险等优点，近年来随着发酵法生产ha技术的完善，发酵法大有完全取代提取法的趋势，但是由于细菌自身代谢与产物表达之间的不平衡，严重制约了透明质酸的产量以及分子量。
cn101935678a中公开了一种生产透明质酸发酵液的方法，所述方法在培养基中添加了微量元素液，该微量元素液由氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜组成，并使用注射用水配制种子培养基和发酵培养基，解决了细菌发酵生产透明质酸的过程中由于营养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量的下降的问题，然而，此发明中透明质酸的产量为6-7g/l，产量依然较低。
cn109536550a公开了一种透明质酸钠的制备方法，通过对发酵工艺的合理规划，以及对发酵培养基的优化配制后，提高了透明质酸钠的产量，并且实现了对透明质酸钠的分子量进行控制，扩大透明质酸钠的应用领域。此发明在发酵时采用分批补料的方法补充碳源，分别在不同时间补加五次碳源，所得透明质酸的产量较高，但是此方法的缺点在于多次补加碳源，发酵周期较长，且容易导致发酵液被杂菌污染，影响透明质酸的质量，同时所得透明质酸的分子量较低。
因此，需要提供一种产量较高且透明质酸的分子量较高的发酵方法来制备透明质酸，以满足市场需求。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种发酵生产透明质酸的方法及其应用。所述方法操作简单，能够缩短发酵周期，增加透明质酸的产量，且所得透明质酸分子量较高。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种发酵生产透明质酸的方法，包括如下步骤：兽疫链球菌经活化和扩培后发酵，并在所述发酵过程中补加一次碳源，得到透明质酸发酵液，纯化后得到透明质酸。
在发酵过程中，初始葡萄糖浓度过高，会对菌种生长造成抑制生长，使发酵周期延长，葡萄糖浓度过低会影响透明质酸的产量，本发明提供的发酵方法，在发酵过程中仅添加一次碳源，不仅缩短了发酵周期，还避免了多次补加碳源带来的染菌风险，有利于菌体正常的生长及代谢，解决了由于兽疫链球菌自身代谢与产物表达之间的不平衡而引起的透明质酸产量及分子量偏小的问题。
优选地，所述透明质酸发酵液中透明质酸的含量为10-15.5g/l，例如可以是10g/l、10.2g/l、10.5g/l、11g/l、11.5g/l、12g/l、13g/l、14g/l、14.5g/l、15g/l或15.5g/l等。
优选地，所述透明质酸的分子量为2200-4500kda，例如可以是2200kda、2500kda、2800kda、3000kda、3500kda、4000kda或4500kda等。
本发明得到的透明质酸产量较高，基本可达10-15.5g/l，且产物的分子量较高，可作为医药级高分子量原料，进一步开发成骨科注射液、滴眼液、眼科手术粘弹剂、注射美容填充产品、手术防粘连产品，应用范围较广且附加值较高。
作为本发明优选的技术方案，所述碳源为葡萄糖。
优选地，每升发酵液中补加的碳源质量为10-20g，例如可以是10g、11g、12g、13g、14g、15g、16g、17g、18g、19g或20g等。
优选地，所述补加碳源的时间为扩培后将菌种转接至发酵培养基后第4-18小时，例如可以是第4小时、第5小时、第6小时、第8小时、第10小时、第12小时、第14小时、第16小时或第18小时，优选为第16小时。
优选地，所述发酵时使用的发酵培养基包括50-100g/l(例如可以是50g/l、55g/l、60g/l、65g/l、70g/l、75g/l、80g/l、85g/l、90g/l、95g/l或100g/l等)葡萄糖、5-10g/l(例如可以是5g/l、5.5g/l、6g/l、6.5g/l、7g/l、7.5g/l、8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l或10g/l等)酵母粉、10-20g/l(例如可以是10g/l、12g/l、14g/l、15g/l、16g/l、18g/l、19g/l或20g/l等)蛋白胨、0.5-2g/l(例如可以是0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l或2g/l等)硫酸镁、0.5-2g/l(例如可以是0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l或2g/l等)磷酸二氢钾、10-20g/l(例如可以是10g/l、12g/l、14g/l、15g/l、16g/l、18g/l、19g/l或20g/l等)谷氨酸钠和1-5g/l(例如可以是1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l、4g/l、4.5g/l或5g/l等)精氨酸盐酸盐。
优选地，扩培后将菌种转接至发酵培养基的转接量为3-5％，例如可以是3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.8％或5％等。
优选地，所述发酵时搅拌速度为100-500rpm，例如可以是100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm、400rpm、450rpm或500rpm等。
优选地，所述发酵温度为33-37℃，例如可以是33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等。
优选地，所述发酵时间为20-24h，例如可以是20h、20.5h、21h、21.5h、22h、22.5h、23h、23.5h或24h等。
优选地，所述发酵时的通气量为1-3vvm，例如可以是1vvm、1.2vvm、1.5vvm、2vvm、2.2vvm、2.5vvm、2.6vvm、2.8vvm或3vvm等。
作为本发明优选的技术方案，所述发酵过程中还包括使用ph调节剂调节发酵液ph的步骤。
优选地，所述ph调节剂为氢氧化钠。
优选地，所述发酵液的ph维持在7.0-8.0之间，例如可以是7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、7.9或8.0等。
作为本发明优选的技术方案，所述方法中活化时的温度33-37℃，例如可以是33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等；时间为10-14h，例如可以是10h、10.5h、11h、11.5h、12h、12.5h、13h或13.5h等。
优选地，所述活化时使用的培养基为摇瓶种子培养基。
优选地，所述摇瓶种子培养基包括1-10g/l(例如可以是1g/l、2g/l、4g/l、5g/l、6g/l、8g/l、9g/l或10g/l等)葡萄糖、5-10g/l(例如可以是5g/l、5.5g/l、6g/l、6.5g/l、7g/l、7.5g/l、8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l或10g/l等)酵母粉、10-20g/l(例如可以是10g/l、12g/l、14g/l、15g/l、16g/l、18g/l、19g/l或20g/l等)蛋白胨、0.5-2g/l(例如可以是0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l或2g/l等)硫酸镁和0.5-2g/l(例如可以是0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l或2g/l等)磷酸二氢钾。
作为本发明优选的技术方案，所述方法中扩培时的温度为33-37℃，例如可以是33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃或37℃等；时间为8-12小时，例如可以是8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h或12h等。
在兽疫链球菌种子培养和发酵培养阶段之间，添加了种子罐扩培步骤，使菌种快速适应了发酵培养基所提供的营养环境，使其进入发酵阶段，能够快速利用发酵培养中的营养用于生长，缩短了发酵周期。
优选地，所述扩培时使用的培养基为种子罐种子培养基。
优选地，所述种子罐种子培养基包括1-10g/l(例如可以是1g/l、2g/l、4g/l、5g/l、6g/l、8g/l、9g/l或10g/l等)葡萄糖、5-10g/l(例如可以是5g/l、5.5g/l、6g/l、6.5g/l、7g/l、7.5g/l、8g/l、8.5g/l、9g/l、9.5g/l或10g/l等)酵母粉、10-20g/l(例如可以是10g/l、12g/l、14g/l、15g/l、16g/l、18g/l、19g/l或20g/l等)蛋白胨、0.5-2g/l(例如可以是0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l或2g/l等)硫酸镁、0.5-2g/l(例如可以是0.5g/l、0.8g/l、1g/l、1.2g/l、1.5g/l、1.8g/l或2g/l等)磷酸二氢钾和10-20g/l(例如可以是10g/l、12g/l、14g/l、15g/l、16g/l、18g/l、19g/l或20g/l等)谷氨酸钠。
优选地，纯化所述透明质酸发酵液使用的方法为乙醇沉淀法。
乙醇沉淀法是分离各种多糖常用的一种方法，可以是透明质酸有效脱水、脱色，从而提高透明质酸的产品品质，为了使透明质酸完全沉淀，溶液中应有足够的离子强度，常添加1％左右的nacl或naac以达到适宜的离子浓度，乙醇添加量一般为发酵液体积的2倍。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
(1)将兽疫链球菌接入摇瓶种子培养基，33-37℃下培养10-14小时，转接至种子罐种子培养基，33-37℃下培养8-12小时；
(2)将种子罐种子培养基中的兽疫链球菌以3-5％的接种量转接至发酵培养基中，发酵温度为33-37℃，100-500rpm搅拌，通气量为1-3vvm并维持发酵液ph为7.0-8.0；
(3)将菌种转接至发酵培养基后第4-16小时添加一次碳源，所述发酵时间共20-24小时，发酵结束后得到透明质酸发酵液，并用乙醇沉淀法纯化后得到透明质酸。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的方法在制备医药级透明质酸和/或透明质酸盐中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的发酵产透明质酸的方法能够维持发酵液中的葡萄糖浓度，有利于菌体正常的生长及代谢，不仅缩短了发酵周期，还避免了多次补加碳源带来的染菌风险，解决了由于兽疫链球菌自身代谢与产物表达之间的不平衡而引起的透明质酸产量及分子量偏小的问题；
(2)使用此方法制备得到的透明质酸产量较高，透明质酸发酵液中透明质酸的含量可达15.5g/l，且分子量较大，高分子量的透明质酸应用价值较高，同时该方法操作简单，发酵周期短，生产效率高，利于工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中，所用种子固体培养基的配方为：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l，琼脂20g；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
以下实施例中，所用摇瓶种子培养基的配方为：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
以下实施例中，所用种子罐种子培养基的配方为：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l，谷氨酸钠为20g/l；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
以下实施例中，所用发酵培养基的配方为：葡萄糖浓度为90g/l，酵母粉浓度为10g/l，蛋白胨浓度为20g/l，硫酸镁浓度为0.5g/l，磷酸二氢钾浓度为2g/l，谷氨酸钠为20g/l，精氨酸盐酸5g/l；培养基配置后灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。
实施例1
本实施例提供一种发酵产透明质酸的方法，包括如下步骤：
1、以兽疫链球菌为发酵菌株，将兽疫链球菌接种至种子固体培养基上进行培养，于33℃培养16h；
2、将兽疫链球菌接种至摇瓶种子培养基培养，于33℃振荡培养12h，得到兽疫链球菌摇瓶种子培养液；
3、将兽疫链球菌摇瓶种子培养液接种至种子罐培养基培养，培养温度为33℃，用30％的氢氧化钠调节培养液ph，使其维持在ph7.5，培养12h得到兽疫链球菌种子罐种子培养液；
4、兽疫链球菌种子罐种子培养液接种至50l发酵罐中，发酵罐中含有30l发酵培养基中，接种量为5％，接种后在搅拌转速为250rpm；，温度为33℃，ph值为7.5，通气量为1vvm条件下，培养4小时，每升发酵液补入10g葡萄糖，继续培养，发酵过程中用30％氢氧化钠调节发酵液的ph值，使ph值保持在7.5±0.5，发酵24小时后，得到透明质酸发酵液30l；
5、在所得发酵液中200gnacl，再加入58l的乙醇使透明质酸钠析出得到透明质酸钠，根据透明质酸钠的产量换算出透明质酸的量，同时采用平氏粘度计测出特性粘度，再换算出相对分子量大小，所得透明质酸的产量为10.2g/l，透明质酸的分子量为2200kda。
实施例2
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第8小时，每升发酵液补入10g葡萄糖；所得透明质酸的产量为10.6g/l，所述透明质酸的分子量为2400kda。
实施例3
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第12小时，每升发酵液补入10g葡萄糖；所得透明质酸的产量为10.7g/l，所述透明质酸的分子量为3000kda。
实施例4
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入10g葡萄糖；所得透明质酸的产量为12.4g/l，所述透明质酸的分子量为3600kda。
实施例5
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第18小时，每升发酵液补入10g葡萄糖；所得透明质酸的产量为11.2g/l，所述透明质酸的分子量为3400kda。
实施例6
与实施例1相同，区别在于，本实施例中使用500l发酵罐，发酵培养基的体积为300l，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入10g葡萄糖；所得透明质酸的产量为12.8g/l，所述透明质酸的分子量为3800kda。
实施例7
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入5g葡萄糖；所得透明质酸的产量为9.3g/l，所述透明质酸的分子量为3200kda。
实施例8
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入8g葡萄糖；所得透明质酸的产量为10.6g/l，所述透明质酸的分子量为3400kda。
实施例9
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入15g葡萄糖；所得透明质酸的产量为14.2g/l，所述透明质酸的分子量为4000kda。
实施例10
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入20g葡萄糖；所得透明质酸的产量为15.5g/l，所述透明质酸的分子量为4200kda。
实施例11
与实施例1相同，区别在于，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入25g葡萄糖；所得透明质酸的产量为15.0g/l，所述透明质酸的分子量为4200kda。
实施例12
与实施例1相同，区别在于，本实施例中使用500l发酵罐，发酵培养基的体积为300l，在转接至发酵培养基后第16小时，每升发酵液补入15g葡萄糖；所得透明质酸的产量为14.4g/l，所述透明质酸的分子量为4500kda。
对比例1
以兽疫链球菌为发酵菌株生产透明质发酵液的方法，其步骤为：
1、将兽疫链球菌接种至种子固体培养上进行培养，于33℃培养16小时；
2、配置摇瓶种子培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
将兽疫链球菌接种至种子培养基培养，于33℃振荡培养12小时，得到兽疫链球菌种子培养液。
3、配制种子罐种子培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l，谷氨酸钠为20g/l，灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
将兽疫链球菌接种至种子罐培养基培养，种子培养条件为温度33℃，用30％的氢氧化钠调节ph6.0-8.0，培养8-12小时得到兽疫链球菌种子培养液。
4、配置发酵罐培养基
葡萄糖浓度为100g/l，酵母粉浓度为10g/l，蛋白胨浓度为20g/l，硫酸镁浓度为0.5g/l，磷酸二氢钾浓度为2g/l，谷氨酸钠为20g/l；精氨酸盐酸5g/l，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。
将兽疫链球菌种子培养液接种至发酵培养液，接种后在搅拌转速为200rpm，温度为33℃，ph值为7.5，通气量为1vvm条件下，发酵过程中用30％氢氧化钠调节发酵液的ph值，使ph值保持在7.5±0.5，培养24小时后，得到透明质酸发酵液；
5、在所得发酵液中200gnacl，再加入58l的乙醇使透明质酸钠析出得到透明质酸钠，换算后可知所得透明质酸的产量为8.1g/l，透明质酸的分子量为1800kda。
对比例2
1、将兽疫链球菌接种至种子固体培养上进行培养，于33℃培养16小时；
2、配置摇瓶种子培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l；培养基配置后灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
将兽疫链球菌接种至种子培养基培养，于33℃振荡培养12小时，得到兽疫链球菌种子培养液。
3、配制种子罐种子培养基：葡萄糖10g/l，酵母粉浓度为5g/l，蛋白胨浓度为10g/l，硫酸镁浓度为1g/l，磷酸二氢钾浓度为1g/l，谷氨酸钠为20g/l，灭菌温度115℃，灭菌时间为20分钟。
将兽疫链球菌接种至种子罐培养基培养，种子培养条件为温度33℃，用30％的氢氧化钠调节ph8.0，培养8-12小时得到兽疫链球菌种子培养液。
4、配置发酵罐培养基
葡萄糖浓度为90g/l，酵母粉浓度为10g/l，蛋白胨浓度为20g/l，硫酸镁浓度为0.5g/l，磷酸二氢钾浓度为2g/l，谷氨酸钠为20g/l；精氨酸盐酸5g/l，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。
将兽疫链球菌种子培养液接种至发酵培养液，接种后在搅拌转速为200rpm，温度为33℃，ph值为7.5，通气量为1vvm条件下，培养4小时，每升发酵液补入2g葡萄糖，第8小时每升发酵液补入2g葡萄糖和16小时再每升发酵液补入6g葡萄糖；发酵过程中用30％氢氧化钠调节发酵液的ph值，使ph值保持在7.5±0.5，培养24小时后，得到透明质酸发酵液；
5、在所得发酵液中286gnacl，再加入72l的乙醇使透明质酸钠析出得到透明质酸钠，换算后可知所得透明质酸的产量为12.1g/l，透明质酸的分子量为3500kda。
以上实施例1-12与对比例1-2中葡萄糖添加时间，加入量以及所得的透明质酸产量与透明质酸分子量如表1所示。
表1
根据表1的数据，由实施例4与对比例1-2比较可知，相比于对比例1中直接提高发酵培养基中碳源含量而不补加碳源，对比例2多次补加等量的碳源，实施例4所得到的透明质酸产量较高，分子量较大；由实施例4与实施例6，实施例9与实施例12比较可知，500l罐和50l罐在搅拌形式上有差异，500l罐搅拌更充分，通气和溶氧状态更好，有利于菌体生长，能够提高透明质酸的产量和分子量；但是在进行放大实验时，当葡萄糖的添加量进一步提高，500l罐和50l罐所得到的透明质酸产量与分子量越来越相近；由实施例4与实施例5比较可知，添加碳源的最佳时间点在第16小时，第18小时添加出现产量降低，分子量不再增加的现象；由实施例4与实施例7-11比较可知，透明质酸的产量会随着碳源补充量的增加而增加，补充量越高，透明质酸的产量越高，分子量越大，但是当碳源补充量超过20g/l时，例如实施例11中添加量为25g/l，透明质酸的产量已经不再上升，说明碳源浓度超过一定范围时，会限制透明质酸的产量。
综上可知，使用本发明通过的发酵方法，不仅能够维持发酵液中的葡萄糖浓度，缩短了发酵周期，还避免了多次补加碳源带来的染菌风险，有利于菌体正常的生长及代谢，解决了由于兽疫链球菌自身代谢与产物表达之间的不平衡问题，所得到的透明质酸产量高且分子量较大。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。