本发明涉及对于煤工尘肺的生物相关联的生物标志物的检测。进一步的，本发明公开了一种煤工尘肺的生物标志物及其应用，并已鉴定煤工尘肺与mir-138表达降低之间的联系，所述生物标志物还可用于以下目的。
背景技术：
煤工尘肺是职业病中最常见的一类呼吸系统疾病，是由于在职业活动中长期吸入生产性粉尘(灰尘)，并在肺内潴留而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病(《尘肺病诊断标准》(gbz70-2009))。煤工尘肺是我国职业病防治工作的重点和难点。
长期以来，对煤工尘肺的诊断主要采取询问职业病史并结合影像学的方式。一旦确诊，病人肺纤维化进程已无法逆转。造成这种现状的主要原因是煤工尘肺发病机制研究不甚清楚。关于煤工尘肺的发病机制，研究人员曾提出过多种学说，如机械刺激学说、化学中毒学说、硅酸聚合学说、表面活性学说、免疫学说等[1,2]。近年来趋向于综合作用学说。该学说认为，当粉尘进入肺内后，引起肺泡的防御反应，巨噬细胞吞噬粉尘成为尘细胞；粉尘的毒性作用逐步导致尘细胞死亡(凋亡、自噬、坏死均涉及到)。游离出的粉尘被新的巨噬细胞吞噬，重复上述过程，最终导致肺组织损伤、破坏和再修复。尘细胞死亡时释放出致纤维化因子和脂蛋白。致纤维化因子刺激成纤维细胞产生大量的胶原纤维。作为抗原，脂蛋白刺激免疫细胞产生相应的抗体，抗原和抗体反应形成免疫复合物，沉积在胶原纤维构成的网状组织上，发生玻璃样变化，而逐渐形成结节。
近些年来，国内研究者开展了大量相关研究。综合分析来看，大体包括以下几个方面。
第一，探索将一些新的检测手段用于煤工尘肺病的临床诊断，如高分辨率ct、双能能谱ct定量等。第二，探究煤工尘肺病的发病机制。研究者对煤工尘肺病发病机制的探索涵盖的层次较广，主要包括核酸层面(microrna、microrna基因多态性、fas凋亡信号通路基因标签单核苷酸多态性等)、蛋白层面(巨噬细胞膜离子通道、结缔组织细胞因子、转化生长因子-β、炎性因子、肿瘤坏死因子、载脂蛋白apoa-1等)、受体配体&信号通路层面(受体酪氨酸tam/生长停滞特异性基因产物6(tam/gas6)、pi3k介导的细胞自噬、内源性溶血磷脂酸及其受体等)和细胞层面(树突状细胞、循环纤维细胞(类干细胞特性)、骨髓间充质干细胞移植、免疫系统组分-breg、tregs和th17等)。第三，探讨对煤工尘肺病进行预防、预测以及治疗的方法。最有效的预防方法之一是控制工作场所粉尘浓度。构建神经网络模型，是对煤工尘肺病进行预测的常用方法之一。例如，刘红波等人根据某煤业集团接尘矿工的接尘特征，构建bayesian正规化法神经网络模型，用于预测接尘矿工未来煤工尘肺(coalworkers’pneumoconiosis，cwp)发病危险性，进而合理、有效地控制和治疗cwp。探讨治疗方法的研究主要包括短肽(ac-sdkp)、阻断信号通路(wnt/β-catenin)、药物(芪丹颗粒剂)等方面。第四，还有一些研究者关注了另一特殊类型煤工尘肺-沙漠煤工尘肺。
在现有认识水平下，寻找煤工尘肺早期诊断的有效方法是一个颇具挑战的研究方向。文献调研结果表明，现有相关研究大多关注单一层面生物标志物(如炎症细胞因子和抗氧化酶及脂质过氧化物等)在煤工尘肺患者体内的异常表达。例如，杨雯等人的研究发现，cwp患者血清白介素18(il-18)抗体及类风湿因子(rf)均存在高表达，且在一定范围内随x射线胸片表现分期的增高表达升高；但是两者间不存在相关性，提示il-18抗体及rf可能通过不同的作用机制参与cwp发生发展。cui等人的研究表明，血浆中较高水平的hsp70和较低水平的hsp27可能与煤矿工人群体患慢性阻塞性肺病的风险增加有关。需要强调的是,这些标志物并不是煤工尘肺特异性损伤的指标，尚未有任何生物标志物真正用于早期煤工尘肺的临床诊断。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种煤工尘肺的生物标志物及其应用，并已鉴定煤工尘肺与mir-138表达降低之间的联系，所述生物标志物还可用于以下目的，比如：通过检测样品中的生物标志物的表达水平，并将其与参比表达水平进行比较，以获得比较结果；依据比较结果指示或评估煤工尘肺发病阶段。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于检测生物标志物的表达水平的用品在制备用于指示对象中的煤工尘肺的试剂中的应用，其中所述生物标志物是mir-138，并且其中所述试剂用于包括如下步骤的方法：
检测所述对象中mir-138的表达水平；
将所述对象中mir-138的表达水平与mir-138的参比表达水平相比较；和
基于所述比较来指示所述对象中的煤工尘肺；
其中，所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平以指示所述对象中的煤工尘肺。
优选的是，在获自所述对象的检测样品中检测所述生物标志物的表达水平。
优选的是，所述检测样品是人类来源的，所述检测样品为所述对象的外周静脉血单核细胞。
优选的是，所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平的26％以上时指示所述对象为煤工尘肺，其中，所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平的26％～44％以上时指示所述对象为煤工尘肺壹期；所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平的68％以上时指示所述对象为煤工尘肺贰期。
优选的是，所述煤工尘肺包括煤工尘肺壹期和煤工尘肺贰期。
优选的是，用于检测生物标志物的表达水平的用品还用于检测编码mir-138的基因的表达水平。
优选的是，所述对象中编码mir-138的基因的表达水平低于编码mir-138的基因的参比表达水平以指示所述对象中的煤工尘肺。
本发明至少包括以下有益效果：
在本发明中，煤工尘肺壹期和煤工尘肺贰期病人外周静脉血单核细胞中mir-138表达水平呈逐渐降低趋势，且随着煤工尘肺病人的病情加重，mir-138表达水平呈明显的阶梯式降低趋势。因此，本申请对检测样品中mir-138的表达水平的检测结果可以为煤工尘肺早期辅助诊断提供更可靠和灵敏的数据依据，有助于医护人员更好的为患者确诊是否为煤工尘肺，以及评估煤工尘肺级别。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种用于检测生物标志物的表达水平的用品在制备用于指示对象中的煤工尘肺的试剂中的应用，其中所述生物标志物是mir-138，并且其中所述试剂用于包括如下步骤的方法：
检测所述对象中mir-138的表达水平；
将所述对象中mir-138的表达水平与mir-138的参比表达水平相比较；和
基于所述比较来指示所述对象中的煤工尘肺；
其中，所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平以指示所述对象中的煤工尘肺。
一个优选方案中，在获自所述对象的检测样品中检测所述生物标志物的表达水平。
一个优选方案中，所述检测样品是人类来源的，所述检测样品为所述对象的外周静脉血单核细胞。
一个优选方案中，所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平的26％以上时指示所述对象为煤工尘肺。
一个优选方案中，所述煤工尘肺包括煤工尘肺壹期和煤工尘肺贰期，其中，所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平的26％～44％以上时指示所述对象为煤工尘肺壹期；所述对象中mir-138的表达水平低于mir-138的参比表达水平的68％以上时指示所述对象为煤工尘肺贰期。
一个优选方案中，用于检测生物标志物的表达水平的用品还用于检测编码mir-138的基因的表达水平。
一个优选方案中，所述对象中编码mir-138的基因的表达水平低于编码mir-138的基因的参比表达水平以指示所述对象中的煤工尘肺。
下面，本发明人将对已确诊的煤工尘肺病人作为实验组和接尘环境中的工作人员作为对照组进行分别的取样检测，用于验证被检测对象的外周静脉血单核细胞中mir-138的表达水平的变化确实如本发明所述。
研究对象来源于2016年10月～2016年12月宁夏某职业病医院的cwp患者和煤矿体检人群。病例组即cwp组人群，接尘组为从事煤矿接尘相关作业的人群。cwp组纳入及排除标准：①职业史明确；②根据我国《职业性尘肺病的诊断》(gbz70-2015)，由具有职业病诊断资质的医疗机构组成的煤工尘肺诊断专家组诊断；③病例均为男性；④未罹患除cwp外的其它重大肺部疾病；⑤研究对象全部知情同意，愿意配合调查。接尘组纳入及排除标准：①从事煤矿接尘相关作业，未被职业病医疗诊断机构确诊为cwp；②均为男性；③无重大肺部疾病；④研究对象知情配合。
设计《宁夏煤矿尘肺病流行病学调查问卷》，调查cwp组和接尘组的姓名、性别、出生年月、工作经历及起止时间、日工作时间、慢性呼吸道症状、既往病史、现患病、是否接尘及接尘时间等信息。慢性呼吸道症状是指出现咳痰和咽炎等表现。
一、样本采集
取清晨空腹edta抗凝的外周静脉血5ml,淋巴细胞分离液(corning，美国)分离单核细胞(pbmcs)；利用微量样本总rna提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取pbmcs中总rna，利用mircutemirnacdna第一链合成试剂盒(天根)逆转录得到cdna。利用实时定量pcr法检测pbmcs中mir-138表达情况(mircute增强型mirna荧光定量检测试剂盒，天根)。所有操作严格按照试剂盒提供的方法进行，由专人完成。
二、荧光定量pcr法检测pbmcs中mir-138表达情况
利用qrt-pcr检测试剂盒检测mir-138表达情况，内参基因为u6(表1)。
表1研究对象外周血单核细胞中mir-138表达情况
反应条件如下：95℃10min，95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，40个循环。反应体系为20μl：cdna产物1μl，ddh2o8μl，2×mircuteplusmirnapremix10μl，正向引物(多核苷酸序列如seqidno.1所示)0.5μl，反向引物0.5μl。根据2-δδct法计算mir-138的相对表达量。
统计学分析
通过spss22.0软件进行统计分析。正态分布的资料采用均数±标准差
研究结果
√cwp患者外周血单核细胞中mir-138表达水平
单因素方差分析结果表明，与接尘组相比，cwp患者外周血单核细胞中mir-138的表达水平均显著下调。多重比较结果表明，接尘组、cwp壹期、cwp贰期之间均存在显著性差异。以mir-138的表达水平从高到低依次排序，分别为接尘组>cwp壹期>cwp贰期(如表2所示)。cwp患者外周血单核细胞中mir-138的表达水平与cwp病程的发生发展阶段表现出较好的相关性，这一结果提示，cwp患者外周血单核细胞中mir-138的表达水平可作为cwp早期辅助诊断的生物标志物。
表2mir-138表达水平比较
附
√人群基本资料
本次研究共调查69例cwp患者，67例接尘组工人。cwp组人群的年龄m±q为48±7岁，接尘组人群的年龄m±q是43±12岁。cwp组人群的工龄和接尘时间m±q分别为26.0±7.0年，22.0±8.0年。接尘组的工龄和接尘时间22.0±8.0年，19.0±17.0年。接尘组和cwp组的日工作时间的中位数没有差异(如下表3所示)。
表3接尘组和煤工尘肺组计量资料比较(m±q)
接尘组及cwp组研究对象的文化程度主要分布在初中。具体如下：接尘组的文凭构成比为初中及以下、高中、大专及以上占比分别为50.72％、27.54％、21.74％，cwp患者的文化构成比为初中及以下、高中、大专及以上比例分别为88.06％、8.96％、2.99％。慢性呼吸道症状及既往病史检出率的统计分析数据详见下表4。
表4接尘组和煤工尘肺组计数资料比较
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离说明书及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
<110>宁夏医科大学
<120>煤工尘肺生物标志物及其应用
<160>4
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<400>1
ggtgtcgtggagtcggcaa19
<210>2
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<400>2
aacttcacaacaccagctta20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<400>3
cgggtttgttttgcatttct20
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<400>4
agtcccagcatgaacagctt21