一种蟾毒色胺及其季铵盐的合成方法和在制备镇痛、抗炎药物中的应用与流程

本发明涉及化学合成领域，具体而言，本发明涉及一种蟾毒色胺及其季铵盐的合成方法，以及其制备在镇痛、抗炎药物中的应用。
背景技术：
：五羟色胺的n，n-甲基化产物(蟾毒色胺)的具有式(1)的结构，其季铵盐具有式(2)的结构。蟾毒色胺其作为5-羟色胺的n,n-二甲基化产物，因最初在蟾蜍中发现，故名蟾毒色胺，存在于青蛙和蟾蜍皮，蘑菇，高级植物和哺乳动物中；在精神分裂症患者的大脑，血浆和尿液中也有存在的报道。蟾酥中存在有蟾毒色胺和其季铵盐，由于以往的色谱分离纯化研究中往往使用强酸(比如，三氟乙酸)以及碱性溶剂等，因此已经发生酸根置换，故蟾毒色胺季铵盐在中药蟾酥中原有的酸根形式尚不清楚。考虑动盐类药物的不同酸根、不同碱基存在形式能够影响到药物的体内生物利用度、药效强度及安全性。亦未见有文献对蟾毒色胺季铵盐的盐酸盐活性进行报道。本发明以小鼠为模型，结合热痛和机械痛行为学评价与磷脂组学对蟾毒色胺和蟾毒色胺季铵盐的盐酸盐，进行了抗炎镇痛作用研究，为该类成分镇痛及抗炎作用提供实验依据。关于蟾酥色胺类物质的化学合成制备方法，探究其合成的条件，使得能安全，高效，环保合成蟾毒色胺及其季铵盐显得尤为重要。早在2007年chinpiaochen课题组就对蟾毒色胺进行了合成，该课题组设计了一条一共七步的合成路线(wang,y.-y.,&chen,c.(2007).synthesisofadeuterium-labelledstandardofbufotenine(5-ho-dmt).journaloflabelledcompoundsandradiopharmaceuticals,50(14),1262–1265.)。该条路线以3-甲基-4-硝基苯为原料，经过了一系列的反应得到了重要中间体5-苄氧基吲哚，在经过取代，还原，脱保护等反应得到了蟾毒色胺。整条路线以23.9％的理论总产率实现了对蟾毒色胺的合成，但部分试剂有剧毒(水合肼)，不符合绿色化学理念，因此该合成路线并不适用于工业化生产。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种蟾毒色胺及其季铵盐的高效合成方法。本发明以5-苄氧基吲哚起始原料合成蟾毒色胺及其季铵盐。制备方法步骤少而简单，操作安全方便，条件温和，成本低，反应效率高，易于纯化，产品纯度高，适合工业化生产。本发明提供的一种蟾毒色胺的制备方法，具体包括以下步骤：a、在有机溶剂中，以5-苄氧基吲哚(s-0)为起始原料，在草酰卤化物的酰化作用下生成2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-2-氧代乙酰卤化物(s-1)，其中x为卤素；b、在溶剂中，在碱的存在下，将上述生成的2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-2-氧代乙酰卤化物与二甲胺或其盐混合，反应得到2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-2)；c、在有机溶剂中，在氢化催化剂存在下，将上述生成的2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺催化氢化以脱去苄基得到2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-3)；d、上述生成的2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺在还原剂的作用下将邻位羰基还原成亚甲基，得到3-(2-(二甲氨基)乙基)-1h-吲哚-5-醇(s-4，即蟾毒色胺)。本发明还提供的一种蟾毒色胺季铵盐的制备方法，其经由上述方法制备蟾毒色胺，并进一步进行步骤e：e、在有机溶剂中，上述生成的3-(2-(二甲氨基)乙基)-1h-吲哚-5-醇与甲基化试剂反应得到2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n，n-三甲基乙-1-胺氯化物。在上述步骤a中，s-1中x优选为氯或溴；草酰卤化物选自草酰氯、草酰溴，优选为草酰氯，其中s-0与草酰卤化物的摩尔比为1:1～1:5，优选1:1～1:3。有机溶剂为无水有机溶剂，选自c1-6醇、c1-6醚或环醚、c1-6酯、c1-6酮、c1-6卤代烷烃、c1-6烷基腈、dmf中的一种或几种，优选乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，乙醚，四氢呋喃，dmf，乙醇，乙腈，丙酮溶液中的一种或几种，更优选乙酸乙酯、乙醚，四氢呋喃。反应时间为0.25～3h，优选0.5～1h。温度为0-80℃，优选10-50℃，更优选20-40℃，最优选室温。在上述步骤b中，所述碱选自碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碱金属或碱土金属的碳酸盐、碱金属或碱土金属的c1-6醇盐、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、n、n-二甲基氨基吡啶的一种或几种；优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸钙、甲醇钠、乙醇钠、甲醇镁、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、n、n-二甲基氨基吡啶的一种或几种；更优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸钙、甲醇钠、乙醇钠及其混合物；特别优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙及其混合物。其中s-1与碱的摩尔比为1:1～15，优选1:1～10，更优选1:1～8。s-1与二甲胺或其盐的摩尔比为1:1～8，优选1:1～5，其中二甲胺盐选自二甲胺无机盐，优选盐酸盐，溴酸盐，硫酸盐，磷酸盐。溶剂选自极性溶剂，优选水、c1-6醇、c1-6酮、c1-6醚、dmf、dmso；更优选水、c1-6醇；特别优选水、甲醇、乙醇；最优选水。反应时间为0.2～3h，优选0.5～1h。温度为0-60℃，优选10-50℃，更优选20-40℃，最优选室温。上述步骤c中，所述氢化催化剂选自钯催化剂和铂催化剂，优选负载形式的钯催化剂；更优选pd/c、pd(oh)2/c、pdo/c、混合的pdo-pd(oh)2/c、pdo/al2o3、混合的pdo-pd(oh)2/al2o3、pdo/sio2、混合的pdo-pd(oh)2/sio2、pd/caco3；特别优选pd/c、pd(oh)2/c、pdo/c；最优选pd/c；其中钯的负载量为0.5％至25％、优选0.5％至25％、更优选1％至20％、最优选在5至15％范围内；催化剂与s-2的质量比为1:4～50，优选1:5～20，更优选1:5～10。催化氢化在氢气存在下进行，氢气的压力从常压到10mpa。催化氢化反应的温度为0-80℃，优选10-50℃，更优选20-40℃。所述有机溶剂选自c1-6醇、c1-6醚或环醚、c1-6酯、c1-6酮、c1-6卤代烷烃、c1-6烷基腈、dmf中的一种或几种，优选乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，乙醚，四氢呋喃，dmf，乙醇，乙腈，丙酮溶液中的一种或几种；更优选乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，乙醚，四氢呋喃，dmf，乙醇，乙腈，丙酮溶液中的两种或两种以上；特别优选乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，乙醚，四氢呋喃，dmf，乙醇，乙腈，丙酮溶液中的两种，最优选甲醇与四氢呋喃的混合溶剂，其中两种溶剂比例为0.1:1-10，优选为0.5:1-5，更优选为0.5:1-2，最优选为0.5:1，1:1,1:2。上述步骤d中，所述还原剂为包含金属氢化物的组，金属氢化物选自硼氢化钠，氢化铝锂，二异丁基氢化铝，三仲丁基硼氢化锂，双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠、氰基硼氢化钠、三烷氧基氢化铝；优选硼氢化钠，氢化铝锂，二异丁基氢化铝，三仲丁基硼氢化锂；更优选硼氢化钠，氢化铝锂。还原剂与s-3的摩尔比为1-25:1，优选5-20:1，更优选6-15:1。可在溶剂的存在下进行还原反应，所述溶剂选自c1-6醇、c1-6醚或环醚、c1-6酯、c1-6烷基腈或甲苯中一种或多种；优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、乙醚或四氢呋喃中一种或多种，更优选甲醇、乙醇或四氢呋喃。反应温度为-20℃至80℃，优选-10℃至50℃，更优选0℃至40℃。步骤d任选在氮气或氩气氛围下进行。优选地，还原剂在0℃下溶解在溶剂中，并滴加至含s-3溶剂中，使反应体系加热回流，保持3-8小时，之后再25℃-40℃下搅拌8-16小时。上述步骤e中，所述甲基化试剂选自碘甲烷、溴甲烷、氯甲烷、三氟甲磺酸甲酯、硫酸二甲酯；优选碘甲烷、溴甲烷；更优选碘甲烷。甲基化试剂与s-4的摩尔比为1-30:1，优选5-25:1，更优选10-15:1。所述有机溶剂选自c1-6醇、c1-6酯、c1-6酮、c1-6醚或环醚、c1-6烷基腈、dmf、或dmso中一种或多种，优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，甲基叔丁基醚、乙醚、乙腈或或四氢呋喃中一种或多种，更优选甲醇、乙醇。反应温度为0-60℃，优选10-50℃，更优选20-40℃。步骤e任选在避光条件下进行；步骤e任选在反应完全后加入氯化银，以进行置换，得到蟾毒色胺季铵盐(s-5)。本发明所述蟾毒色胺季铵盐可以为蟾毒色胺甲基化所形成的盐，其中酸部分选自：氯离子，硫酸根离子、磷酸根离子、抗坏血酸根、甲磺酸根、苹果酸根、丁二酸根、戊二酸根、己二酸根、庚二酸根、辛二酸根等。在药理活性测试方面，本发明通过大量实验表明蟾毒色胺季铵盐具有强烈镇痛作用。通过对多种色胺成分的筛选比较，发现蟾毒色胺季铵盐镇痛效果最强，其镇痛强度是蟾毒色胺的3倍；且在蟾酥中其它色胺成分无效的剂量下，蟾毒色胺季铵盐依然有显著镇痛效果。而且蟾毒色胺季铵盐与低剂量吗啡具有协同镇痛作用。蟾毒色胺季铵盐除了能够调节花生四烯酸aa来源环氧酶cox来源疼痛介质，其对脂氧酶lox、细胞色素cyp、亚油酸la和dha来源的疼痛介质也具有调节作用，完全不同于非甾烯抗炎镇痛药的机制。因此，本发明还涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的蟾毒色胺或蟾毒色胺季铵盐以及药学上可接受的辅料。本发明还涉及一种药物组合物，其包含蟾毒色胺或蟾毒色胺季铵盐与盐酸吗啡等阿片类药物。本发明还涉及蟾毒色胺或蟾毒色胺季铵盐在制备镇痛或抗炎的药物中的应用。优选的，上述蟾毒色胺季铵盐为2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n，n-三甲基乙-1-胺氯化物。有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：本发明和现有技术相比，本发明步骤简单，操作安全方便，反应效率高，易于纯化分离，条件温和，成本低，蟾毒色胺及其季铵盐的反应总收率分别大于65％，60％，合成产品纯度高(>99.0％),适用于工业化生产。本发明通过大量实验对蟾毒色胺、五羟色胺和蟾毒色胺季铵盐镇痛作用进行分析研究，发现蟾毒色胺季铵盐镇痛效果最强，在其它色胺类成分无效剂量下，蟾毒色胺季铵盐依然有显著镇痛效果。而且蟾毒色胺季铵盐与吗啡具有协同镇痛作用。附图说明图1为本发明所述的蟾毒色胺及其季铵盐结构示意图。图2为本发明所述的蟾毒色胺及其季铵盐合成方法的反应流程图。图3为蟾毒色胺对小鼠后足热痛阈值影响的曲线图。图4为蟾毒色胺对小鼠右后足机械痛阈值影响的曲线图。图5为蟾毒色胺对福尔马林致痛模型小鼠行为学影响图的曲线图。图6为蟾毒色胺季铵盐对小鼠后足热痛阈值影响的曲线图。图7为蟾毒色胺季铵盐对小鼠右后足机械痛阈值影响的曲线图图8为蟾毒色胺季铵盐对福尔马林致痛模型小鼠行为学影响图的曲线图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例12-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-2-氧代乙酰氯(s-1)的制备在室温下，取100ml圆底烧瓶，依次加入2.7ml无水乙醚，草酰氯(175μl,2.0mmol),充分搅拌均匀后，取5-苄氧基吲哚(220mg,1.0mmol)加入到烧瓶中，充分搅拌30分钟后，反应液抽滤，用乙醚反复冲洗滤饼，约得302.9mg的红褐色固体沉淀物即为s-1粗产物，收率95％。2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-2)的制备在室温下，取100ml圆底烧瓶，依次加入氢氧化钾(360mg,6.38mmol)与4.15ml水和二甲胺盐酸盐(350mg,4.25mmol)与，混合均匀后，取s-1(310mg,1.0mmol)缓慢加入混合溶液中，搅拌40分钟后，抽滤，无水乙醚冲洗，得白色固体，即为s-2粗产物，干燥后直接硅胶拌样，柱层析分离，以纯乙酸乙酯为洗脱剂，得到s-2的纯品，约287.1mg,为白色固体状，收率90％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.96(s,1h),7.99(d,j＝2.1hz,1h),7.91(d,j＝3.2hz,1h),7.52(d,j＝7.4hz,1h),7.42(t,j＝7.5hz,1h),7.35(dd,j＝13.1,8.1hz,1h),7.05(dd,j＝8.8,2.5hz,1h),5.18(s,2h),3.12(s,2h),3.10(s,2h).2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-3)的制备在室温下，取三颈烧瓶，按甲醇:四氢呋喃＝1：2的比例配制溶液，各取600μl,加入s-2(50mg,0.155mol),pd/c(10％，5mg),充入氢气常温常压下反应18小时，反应完全后，用硅藻土抽滤，出去催化剂，用乙酸乙酯反复冲洗，滤液用无水硫酸钠进行干燥后，硅胶拌样进行柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝20：1作洗脱剂，得到s-3的纯品，约33.5mg,为油状物，收率93％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ12.07(s,1h),9.17(s,1h),7.96(d,j＝3.2hz,1h),7.50(s,1h),7.32(d,j＝8.7hz,1h),6.76(dd,j＝8.7,2.3hz,1h),2.98(s,3h),2.91(s,3h).2-(2-(二甲氨基)乙基)-1h-吲哚-5-醇(s-4；蟾毒色胺)的制备在0℃下，取s-3(35mg,0.11mmol)溶解在装有四氢呋喃(2ml)的圆底烧瓶中，另取硼氢化钠(42mg,1.1mmol)与四氢呋喃(1.5ml)均匀混合后，缓慢逐滴加入到烧瓶中，以氮气保护下冷却回流5小时，再在40℃下搅拌8小时，反应结束后冰浴进行冷却，加氢氧化钠淬灭反应，再搅拌30分钟后进行萃取，用乙酸乙酯反复提取三次，取有机层，用无水硫酸钠进行干燥后硅胶拌样，柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝10：1作洗脱剂，得到s-4(蟾毒色胺)的纯品，约25.9mg,为黄褐色油状物，收率84％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ10.49(s,1h),8.65(s,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.04(d,j＝2.1hz,1h),6.81(d,j＝2.2hz,1h),6.59(dd,j＝8.6,2.3hz,1h),2.80–2.71(m,2h),2.62–2.54(m,2h),2.29(s,7h).2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n，n-三甲基乙-1-胺氯化物(s-5)的制备在室温避光条件下，取s-4(50mg,0.25mmol)在装有甲醇(5ml)的圆底烧瓶中，取碘甲烷(1.9ml,3.0mmol)加入混合均匀后，反应48h反应完全后，抽滤，甲醇反复冲洗，取滤渣，溶解于装有甲醇的圆底烧瓶中，加入过量的agcl，避光条件下反应，反应完全后，抽滤，取滤渣，硅胶拌样，柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝5：1作洗脱剂，得到s-5的纯品，约48.3mg,为紫褐色油状物，收率90％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ10.49(s,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.04(d,j＝2.1hz,1h),6.81(d,j＝2.2hz,1h),6.59(dd,j＝8.6,2.3hz,1h),2.80–2.71(m,2h),2.62–2.55(m,2h),2.29(s,6h).实施例22-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-2-氧代乙酰氯(s-1)的制备在室温下，取100ml圆底烧瓶，依次加入2.7ml无水乙醚，草酰氯(175μl,2.0mmol),充分搅拌均匀后，取5-苄氧基吲哚(220mg,1.0mmol)加入到烧瓶中，充分搅拌30分钟后，反应液抽滤，用乙醚反复冲洗滤饼，约得299.8mg的红褐色固体沉淀物即为s-1粗产物，收率94％。2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-2)的制备在室温下，取100ml圆底烧瓶，依次加入氢氧化钠(170mg,4.25mmol)与4.15ml水和二甲胺盐酸盐(350mg,4.25mmol)与，混合均匀后，取s-1(310mg,1.0mmol)缓慢加入混合溶液中，搅拌40分钟后，抽滤，无水乙醚冲洗，得白色固体，即为s-2粗产物，干燥后直接硅胶拌样，柱层析分离，以纯乙酸乙酯为洗脱剂，得到s-2的纯品，约290.2mg,为白色固体状，收率91％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.96(s,1h),7.99(d,j＝2.1hz,1h),7.91(d,j＝3.2hz,1h),7.52(d,j＝7.4hz,1h),7.42(t,j＝7.5hz,1h),7.35(dd,j＝13.1,8.1hz,1h),7.05(dd,j＝8.8,2.5hz,1h),5.18(s,2h),3.12(s,2h),3.10(s,2h)。2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-3)的制备在室温下，取三颈烧瓶，按甲醇:四氢呋喃＝1：1的比例配制溶液，各取700ml,加入s-2(50mg,0.155mol),pd/c(10％，5mg),充入氢气常温常压下反应22小时，反应完全后，用硅藻土抽滤，出去催化剂，用乙酸乙酯反复冲洗，滤液用无水硫酸钠进行干燥后，硅胶拌样进行柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝20：1作洗脱剂，得到s-3的纯品，约34.1mg,为油状物，收率94％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ12.07(s,1h),9.17(s,1h),7.96(d,j＝3.2hz,1h),7.50(s,1h),7.32(d,j＝8.7hz,1h),6.76(dd,j＝8.7,2.3hz,1h),2.98(s,3h),2.91(s,3h).2-(2-(二甲氨基)乙基)-1h-吲哚-5-醇(s-4；蟾毒色胺)的制备在0℃下，取s-3(35mg,0.11mmol)溶解在装有四氢呋喃(2ml)的圆底烧瓶中，另取氢化铝锂(37mg,1.1mmol)与四氢呋喃(1.5ml)均匀混合后，缓慢逐滴加入到烧瓶中，以氮气保护下冷却回流4小时，再在40℃下搅拌10小时，反应结束后冰浴进行冷却，加氢氧化钠淬灭反应，再搅拌30分钟后进行萃取，用乙酸乙酯反复提取三次，取有机层，用无水硫酸钠进行干燥后硅胶拌样，柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝10:1作洗脱剂，得到s-4(蟾毒色胺)的纯品，约26.2mg,为黄褐色油状物，收率85％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ10.49(s,1h),8.65(s,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.04(d,j＝2.1hz,1h),6.81(d,j＝2.2hz,1h),6.59(dd,j＝8.6,2.3hz,1h),2.80–2.71(m,2h),2.62–2.54(m,2h),2.29(s,7h).2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n，n-三甲基乙-1-胺氯化物(s-5)的制备在室温避光条件下，取s-4(50mg,0.25mmol)在装有甲醇(5ml)的圆底烧瓶中，取碘甲烷(2.2ml,3.5mmol)加入混合均匀后，反应48h反应完全后，抽滤，甲醇反复冲洗，取滤渣，溶解于装有甲醇的圆底烧瓶中，加入过量的agcl，避光条件下反应，反应完全后，抽滤，取滤渣，硅胶拌样，柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝5：1作洗脱剂，得到s-5的纯品，约40.8mg,为紫褐色油状物，收率91％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ10.49(s,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.04(d,j＝2.1hz,1h),6.81(d,j＝2.2hz,1h),6.59(dd,j＝8.6,2.3hz,1h),2.80–2.71(m,2h),2.62–2.55(m,2h),2.29(s,6h).实施例32-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-2-氧代乙酰氯(s-1)的制备在室温下，取100ml圆底烧瓶，依次加入2.7ml无水乙醚，草酰氯(175μl,2.0mmol),充分搅拌均匀后，取5-苄氧基吲哚(220mg,1.0mmol)加入到烧瓶中，充分搅拌40分钟后，反应液抽滤，用乙醚反复冲洗滤饼，约得293.1mg的红褐色固体沉淀物即为s-1粗产物，收率95％。2-(5-(苄氧基)-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-2)的制备在室温下，取100ml圆底烧瓶，依次加入氢氧化钠(255mg,6.38mmol)与4.15ml水和二甲胺盐酸盐(350mg,4.25mmol)与，混合均匀后，取s-1(310mg,1.0mmol)缓慢加入混合溶液中，搅拌40分钟后，抽滤，无水乙醚冲洗，得白色固体，即为s-2粗产物，干燥后直接硅胶拌样，柱层析分离，以纯乙酸乙酯为洗脱剂，得到s-2的纯品，约293.5mg,为白色固体状，收率92％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.96(s,1h),7.99(d,j＝2.1hz,1h),7.91(d,j＝3.2hz,1h),7.52(d,j＝7.4hz,1h),7.42(t,j＝7.5hz,1h),7.35(dd,j＝13.1,8.1hz,1h),7.05(dd,j＝8.8,2.5hz,1h),5.18(s,2h),3.12(s,2h),3.10(s,2h).2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n-二甲基-2-氧代乙酰胺(s-3)的制备在室温下，取三颈烧瓶，按甲醇:四氢呋喃＝2：1的比例配制溶液，各取700μl,加入s-2(50mg,0.155mol),pd/c(10％，5mg),充入氢气常温常压下反应20小时，反应完全后，用硅藻土抽滤，出去催化剂，用乙酸乙酯反复冲洗，滤液用无水硫酸钠进行干燥后，硅胶拌样进行柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝20：1作洗脱剂，得到s-3的纯品，约33.1mg,为油状物，收率92％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ12.07(s,1h),9.17(s,1h),7.96(d,j＝3.2hz,1h),7.50(s,1h),7.32(d,j＝8.7hz,1h),6.76(dd,j＝8.7,2.3hz,1h),2.98(s,3h),2.91(s,3h).2-(2-(二甲氨基)乙基)-1h-吲哚-5-醇(s-4；蟾毒色胺)的制备在0℃下，取s-3(35mg,0.11mmol)溶解在装有四氢呋喃(2ml)的圆底烧瓶中，另取氢化铝锂(55.5mg,1.65mmol)与四氢呋喃(2.0ml)均匀混合后，缓慢逐滴加入到烧瓶中，以氮气保护下冷却回流5小时，再在40℃下搅拌10小时，反应结束后冰浴进行冷却，加氢氧化钠淬灭反应，再搅拌1小时后进行萃取，用乙酸乙酯反复提取三次，取有机层，用无水硫酸钠进行干燥后硅胶拌样，柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝10：1作洗脱剂，得到s-4(蟾毒色胺)的纯品，约23.7mg,为黄褐色油状物，收率84％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ10.49(s,1h),8.65(s,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.04(d,j＝2.1hz,1h),6.81(d,j＝2.2hz,1h),6.59(dd,j＝8.6,2.3hz,1h),2.80–2.71(m,2h),2.62–2.54(m,2h),2.29(s,7h).2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n，n-三甲基乙-1-胺氯化物(s-5)的制备在室温避光条件下，取s-4(50mg,0.25mmol)在装有甲醇(5ml)的圆底烧瓶中，取碘甲烷(1.9ml,3.0mmol)加入混合均匀后，反应48h反应完全后，抽滤，甲醇反复冲洗，取滤渣，溶解于装有甲醇的圆底烧瓶中，加入过量的agcl，避光条件下反应，反应完全后，抽滤，取滤渣，硅胶拌样，柱层析分离，以二氯甲烷：甲醇＝5：1作洗脱剂，得到s-5的纯品，约48.8mg,为紫褐色油状物，收率91％。结构解析式为：1hnmr(500mhz,dmso)δ10.49(s,1h),7.12(d,j＝8.6hz,1h),7.04(d,j＝2.1hz,1h),6.81(d,j＝2.2hz,1h),6.59(dd,j＝8.6,2.3hz,1h),2.80–2.71(m,2h),2.62–2.55(m,2h),2.29(s,6h).活性测定实施例除非另有说明，本发明活性测定过程中所用蟾毒色胺季铵盐为2-(5-羟基-1h-吲哚-3-基)-n，n，n-三甲基乙-1-胺氯化物。实施例41.热板法对蟾毒色胺镇痛作用评价1.1材料和方法1.1.1动物：健康spf级成年icr小鼠，雌性，体重18-22g，年龄6-8周，由南京市青龙山实验动物养殖场提供。实验前，所有小鼠均在本实验室动物房适应性饲养3-4天，室温维持在20℃-25℃，相对湿度在40％-60％，实验期间动物分笼饲养，光暗周期12h/12h，自由进食与饮水，食物为标准颗粒状饲料。实验方法严格遵守国家研究院批准的实验动物护理和使用健康指南。1.1.2器材：数控超级恒温槽，电子天平，1ml注射器，笼具；1.1.3药物：蟾毒色胺，注射时用0.9％氯化钠稀释，配制0.5mg/ml，1.5mg/ml溶液；盐酸吗啡注射液，注射时用0.9％氯化钠稀释，配制成0.025mg/ml的溶液；0.9％氯化钠溶液。1.2实验方法1.2.1预选动物预选30s内有痛反应的小鼠。将小鼠置于热板仪内，温度设定55±0.5℃，测定小鼠的痛阈值，测2次，每隔5min测量1次，以小鼠舔后足作为观察指标。若小鼠30s内不舔后足、逃避、跳跃者弃去另换。以小鼠用药前初次舔足时间为痛阈值。1.2.2分组及给药取预选合格的小鼠，分为生理盐水组，盐酸吗啡注射液组，蟾毒色胺组(高，低剂量)，每组12只。然后各组小鼠按0.1ml/10g腹腔注射(i.p.)给药，给药信息见下表1。2.2.3热阈值测量方法药物干预前,将热板温度调节为55℃，稳定一小时，给药后30min、60min、90min、120min将小鼠放在热板仪内，观察第一次舔足反应时间，即热痛阈值(painthresholdinhot-platetest,hppt),若小鼠60s内无痛反应，立即取出，按60s计算。痛阈值增加百分率＝(给药后痛阈值-给药前痛阈值)/给药前痛阈值×100％2.2.4统计学处理本实验数据采用统计分析软件excel2016和graphpadprism8软件进行统计分析和作图。数据以mean±sem的方式呈现，t检验用于两个独立样本的计量资料。p<0.05说明差异具有统计学意义。表1不同组别小鼠给药信息表组别n干预药物剂量人体等效剂量生理盐水组12生理盐水--盐酸吗啡组12盐酸吗啡0.25mg/kg0.002mg/kg蟾毒色胺低剂量组12蟾毒色胺5mg/kg0.41mg/kg蟾毒色胺高剂量组12蟾毒色胺15mg/kg1.22mg/kg2.3实验结果与讨论2.3.1蟾毒色胺对小鼠后足热痛阈值的影响蟾毒色胺对小鼠后足热痛阈值的影响结果见下表2以及图2。结果表明，与生理盐水组相比，蟾毒色胺高剂量组(15mg/kg)给药后痛阈值明显提高(p＜0.05)，表现出一定的镇痛作用，与给药前相比，60分钟镇痛效果达到最高，痛阈值提高率为34.92％。蟾毒色胺低剂量组(5mg/kg)未表现出镇痛作用。表2蟾毒色胺对小鼠后足热痛阈值的影响(n＝10-12)注：**p≤0.01，与生理盐水组比，有极显著差异；*p≤0.05，与生理盐水组比，有显著差异。##p≤0.01，与用药前比，有极显著差异；#p≤0.05，与用药前比，有显著差异。2.福尔马林致痛模型对蟾毒色胺镇痛作用评价2.1材料和方法2.1.1动物：健康spf级成年icr小鼠，雌雄各半，体重18-22g，年龄6-8周，由南京市青龙山实验动物养殖场提供。实验前，所有小鼠均在本实验室动物房适应性饲养3-4天，室温维持在20℃-25℃，相对湿度在40％-60％，实验期间动物分笼饲养，光暗周期12h/12h，自由进食与饮水，食物为标准颗粒状饲料。实验方法严格按照国家研究院批准的实验动物护理和使用健康指南。2.1.2器材：vonfrey纤维丝刺激针，笼具，电子天平，1ml注射器，录像设备等；2.1.3药物：蟾蜍色胺，注射时用0.9％氯化钠稀释，配制0.5mg/ml，1.5mg/ml溶液；盐酸吗啡注射液，注射时用0.9％氯化钠稀释，配制成0.025mg/ml的溶液；0.9％氯化钠溶液。2.2实验方法2.2.1分组及给药选取健康icr的小鼠，按体重随机分为模型组，盐酸吗啡注射液组，蟾毒色胺组(高，低剂量)。然后各组小鼠按0.1ml/10g腹腔注射(i.p.)给药，给药信息见表3。给药后15min后沿小鼠右足皮下(s.c.)给予20μl2.5％福尔马林(0.925％甲醛)溶液，进行机械痛阈值测定，观察动物行为学表现。2.2.2机械痛阈检测方法采用vonfrey纤维丝测定小鼠右后足对机械性刺激缩足反应的阈值，即机械缩足阈值(pawwithdrawalmechanicalthresholds,pwmt)，小鼠放置于距实验台面高约30cm的鼠笼内，适应5-10min后处于安静状态。测定时，从低到高使用代表不同刺激力的纤维丝依次垂直刺激小鼠右后足，缓慢有力至纤维丝弯曲成角，持续1.5-2s，结束刺激。观察到小鼠出现嘶吼、舔足、甩尾及弹腿任一行为均记为该力度阳性，然后选择低于此力度的下一型号纤维丝继续刺激，直到小力度纤维丝刺激阴性为止，将最后一个小力度纤维丝的上一个值记为其机械缩足阈值，记下此时使用的纤维丝所代表的刺激力。若为阴性则选择大于该力度的纤维丝进行刺激，直到呈现阳性，且将此时的力度值记为其痛阈值。分别记录小鼠给与福尔马林后15min，30min，45min，60min，75min和90min机械痛阈值。2.2.3疼痛行为学观察观察小鼠右足给予2.5％的福尔马林溶液的疼痛行为学表现。将右足给予2.5％福尔马林溶液的小鼠放置于笼具内，底面平坦，观察刺激后小鼠右脚离开笼具底面时间(舔足、缩足和提足总时长)，总共观察45min，每5min记录一次抬脚总时长。表3不同组别小鼠给药信息表组别n干预药物剂量人体等效剂量模型组10生理盐水--盐酸吗啡组10盐酸吗啡0.25mg/kg0.002mg/kg蟾毒色胺低剂量组10蟾毒色胺5mg/kg0.41mg/kg蟾毒色胺高剂量组10蟾毒色胺15mg/kg1.22mg/kg2.3实验结果2.3.1蟾毒色胺对小鼠右后足机械痛阈值的影响蟾毒色胺对小鼠右后足机械痛阈值的影响结果见下表4以及图3，结果表明给予福尔马林90分钟内，与模型组相比，蟾毒色胺低剂量组(5mg/kg)小鼠右足机械痛阈值略有增加(p＜0.05)，蟾毒色胺高剂量组(15mg/kg)小鼠右足机械痛阈值显著增加(p＜0.01)，60分钟达最大机械痛阈值，分别为(1.32±1.23)g与(2.1±1.38)g。表4蟾毒色胺对小鼠右后足机械痛阈值的影响(x±sem，n＝10)注：**p≤0.01，与模型组比，有极显著差异；*p≤0.05，与模型组比，有显著差异。2.3.2蟾毒色胺对福尔马林致痛模型小鼠行为学的影响福尔马林足肿胀疼痛模型痛觉反应表现为两相性反应，一相(0-5分钟；第一阶段)属于周围伤害性感受器被福尔马林直接刺激所致，二相(15-45分钟；第二阶段)属于中枢神经元敏化过程，中间有一个相对较短的静止期(5-10分钟)。本实验中将福尔马林的伤害性行为量化为45分钟内舔或咬住注射足时长(分为9个周期，每个5分钟)。蟾毒色胺类化合物对福尔马林致痛模型小鼠行为学结果见下表5、图4。结果表明给予福尔马林45分钟内，与生理盐水组相比，蟾毒色胺低高剂量组(5mg/kg和15mg/kg)显著抑制小鼠舔或咬住注射足(p＜0.01)。表5蟾毒色胺对福尔马林痛敏模型小鼠行为学的影响(x±sem，n＝6)注：**p≤0.01，与模型组比，有极显著差异；*p≤0.05，与模型组比，有显著差异。实施例51.热板法对蟾毒色胺季铵盐镇痛作用评价1.1材料和方法同前1.2实验方法同前表6不同组别小鼠给药信息表组别n剂量人体等效剂量生理盐水组12--盐酸吗啡组120.25mg/kg0.002mg/kg蟾毒色胺季铵盐低剂量组125mg/kg0.41mg/kg蟾毒色胺季铵盐高剂量组1215mg/kg1.22mg/kg1.3.实验结果与讨论蟾毒色胺季铵盐对小鼠后足热痛阈值的影响蟾毒色胺季铵盐对小鼠后足热痛阈值的影响结果见下表7以及图6。结果表明，与生理盐水组相比，蟾毒色胺季铵盐低高剂量组(5mg/kg和15mg/kg)给药后痛阈值明显提高(p＜0.05)，表现出一定的镇痛作用，与给药前相比，60分钟镇痛效果达到最高，痛阈值提高率分别为29.61％及60.62％(p＜0.01)。表7蟾毒色胺季铵盐对小鼠后足热痛阈值的影响(n＝10-12)注：**p≤0.01，与生理盐水组比，有极显著差异；*p≤0.05，与生理盐水组比，有显著差异。##p≤0.01，与用药前比，有极显著差异；#p≤0.05，与用药前比，有显著差异。2.福尔马林致痛模型对蟾毒色胺季铵盐镇痛作用评价2.1材料和方法同前表8不同组别小鼠给药信息表组别n剂量人体等效剂量模型组10--盐酸吗啡组100.25mg/kg0.002mg/kg蟾毒色胺季铵盐低剂量组105mg/kg0.41mg/kg蟾毒色胺季铵盐高剂量组1015mg/kg1.22mg/kg2.2实验结果蟾毒色胺季铵盐对小鼠右后足机械痛阈值的影响蟾毒色胺季铵盐对小鼠右后足机械痛阈值的影响结果见下表9以及图7，结果表明给予福尔马林90分钟内，与模型组相比，蟾毒色胺季铵盐低高剂量组(5mg/kg和15mg/kg)小鼠右足机械痛阈值显著增加(p＜0.01＝，60分钟达最大机械痛阈值，分别为(2.24±1.45)g与(9.04±3.13)g(p＜0.05，p＜0.010)。表9蟾毒色胺季铵盐对小鼠右后足机械痛阈值的影响(x±sem，n＝10)注：**p≤0.01，与模型组比，有极显著差异；*p≤0.05，与模型组比，有显著差异。2.3蟾毒色胺季铵盐对福尔马林致痛模型小鼠行为学的影响福尔马林足肿胀疼痛模型痛觉反应表现为两相性反应，一相(0-5分钟；第一阶段)属于周围伤害性感受器被福尔马林直接刺激所致，二相(15-45分钟；第二阶段)属于中枢神经元敏化过程，中间有一个相对较短的静止期(5-10分钟)。本实验中将福尔马林的伤害性行为量化为45分钟内舔或咬住注射足时长(分为9个周期，每个5分钟)。蟾毒色胺季铵盐对福尔马林致痛模型小鼠行为学结果见下表10以及图8。结果表明给予福尔马林45分钟内，与生理盐水组相比，蟾毒色胺季铵盐低高剂量组(5mg/kg和15mg/kg)显著抑制小鼠舔或咬住注射足(p＜0.01)。表10蟾毒色胺季铵盐对福尔马林痛敏模型小鼠行为学的影响(x±sem，n＝6)注：**p≤0.01，与模型组比，有极显著差异；*p≤0.05，与模型组比，有显著差异。3.蟾毒色胺季铵盐对福尔马林致痛模型小鼠足部炎症介质的影响3.1材料和方法3.1.1试剂正己烷(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，乙酸乙酯(南京化学试剂有限公司，分析纯)，氯化钠(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，乙腈(美国tedia试剂公司，色谱纯)，甲醇(美国tedia试剂公司，色谱纯)，异丙醇(德国merck公司，色谱纯)，甲酸(美国sigma公司，色谱纯)，arachidonicacid(购自cayman)。3.1.2仪器absciexqtrap5500质谱仪(美国ab公司)，shimadzulc-20adxr超高效液相色谱仪(日本岛津公司)，eped超纯水仪(南京易普易达科技发展有限公司)，fa2004n分析天平(上海精密科学仪器有限公司)，zls-1真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司)，kh3200b超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，shz-d(iii)循环水式真空泵(河南省予华仪器有限公司)，xw-80a涡旋混匀仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，d3024r低温高速离心机(美国scilogex公司)，ims-20制冰机(常熟市雪科电器有限公司)。3.2实验方法3.2.1试剂的配制0.9％生理盐水的配制：精密称取nacl0.9g，加超纯水100ml，玻璃棒搅匀，4℃放置30min以上。提取液的配制：以v/v＝1:1配制含正己烷和乙酸乙酯的提取液，-80℃保存30min以上。复溶液的配制：精密吸取4.5ml乙腈、5ml异丙醇加超纯水0.5ml配制成10ml异丙醇-乙腈-水溶液。取母液浓度为10mg/ml的aa-d8溶液使用上述溶液稀释，配制成含200ng/mlaa-d8的异丙醇-乙腈-水溶液(复溶液)。3.2.2样本处理取小鼠右后足置于冰袋上，用剪刀将足部剪碎，移入玻璃匀浆器中，加入4倍足重量的预冷的0.9％生理盐水，将玻璃匀浆器插入冰盒中研磨，直至呈匀浆状态。将匀浆后的组织全部转移到玻璃试管中，加入8倍足重的预冷的提取液，涡旋混匀1min，冰水浴超声提取两次，每次20min，取上层液体于4000r/min条件下离心15min，取上清在37℃浓缩挥干，下层沉淀再次加入8倍足重的预冷的提取液，重复上述操作，离心所得上清液与对应管样本合并，再次浓缩挥干。精密吸取500μl复溶液复溶，过膜，并于4℃，14000r/min离心30min，取上清进样。3.2.3色谱条件色谱柱为xbridgec18色谱柱(4.6mm×100mm，3.5μm)，体积流量0.7ml/min，进样量10μl，柱温50℃。流动相a(水：乙腈：甲酸＝70：30：0.02)，流动相b(乙腈：异丙醇＝50：50)，梯度洗脱程序：0～3min，25％b；3～11min，45％b；11～13min，60％b；13～18min，75％b；18～18.5min，90％b；20～21min，0％b；21～25min，0％b。质谱条件：电喷雾离子源(esi)；扫描模式：阴离子模式，质谱参数cur＝10psi，gsi＝30psi，gs2＝30psi，is＝-4500v，cad＝high，temp＝525，ihe＝on，xp＝-10v。3.2.4数据处理采用ab公司的analyst5.2软件导出样本数据，用软件graphpadprism8分析，用excel进行t检验统计处理，结果数据采用表示，p＜0.05表示具有显著意义，p＜0.01具有极显著意义。具体计算公式为：n＝ax/ai/mx*v*20(ax:样本中各物质峰面积，ai：内标aa-d8峰面积，mx：样本质量，v：样本体积，500μl：内标浓度20ng/ml),各物质以相对含量(ng/g)表示。3.3实验结果外界致病因子入侵时，机体会释放不同类型的炎症介质，影响体内内源性代谢物的稳态，使促炎和抗炎类炎症磷脂介质的平衡失调，导致炎症。花生四烯酸类内源性代谢物的含量变化可很好的反映机体炎症变化倾向。蟾毒色胺季铵盐对福尔马林致痛模型小鼠足部炎症介质的影响见下表11。实验结果表明，与空白组相比，模型组小鼠右足炎症介质有显著提高，包括dhkpgf2α，20-ethylpgf2a，1a,1b-dihomo-pge1，dhkpge2，8-hetre，11,12-eet，8,9-eet，13-hpode，13-hdohe，arachidonicacid等，而给予蟾毒色胺季铵盐后，这些炎症介质被显著下调，空白组(486.04±11.64ng/g)20-ethylpgf2a在模型组(541.86±11.26ng/g)的上调给予低高剂量的蟾毒色胺季铵盐后分别降至457.15±11.83ng/g和386.38±13.84ng/g(p＜0.01)；空白组(46.89±3.43ng/g)13-hpode在模型组(48.54±3.61ng/g)的上调给予低高剂量的蟾毒色胺季铵盐后分别降至44.67±3.47ng/g和24.67±2.77ng/g(p＜0.01)，这些炎症的下调表明蟾毒色胺季铵盐对机体炎症反应有一定的抑制作用。表11给予蟾毒色胺季铵盐小鼠右足炎症物质相对含量(n＝6，ng/g)注：**p≤0.01，与模型组相比，有极显著差异；*p≤0.05，与模型组相比，有显著差异。##p≤0.01，与生理盐水组相比，有极显著差异；#p≤0.05，与生理盐水组相比，有显著差异。(仅针对模型组)实施例6比较蟾毒色胺、蟾毒色胺季铵盐、五羟色胺的中枢镇痛作用1.1材料和方法同前1.2实验结果结果表明，与用药前组相比，给药后1小时，蟾毒色胺季铵盐(5mg/kg)给药后痛阈值明显提高(p＜0.05)，表现出一定的镇痛作用；在下述相同的测试剂量下，蟾毒色胺和五羟色胺均没有镇痛效果。表12比较蟾毒色胺、蟾毒色胺季铵盐、五羟色胺的中枢镇痛作用(n＝10-12)注：*p≤0.05，与用药前组比，有显著差异。实施例7蟾毒色胺季铵盐与吗啡联用的协同镇痛作用1.1材料和方法同前1.2实验结果与讨论蟾毒色胺季铵盐与吗啡联用对小鼠后足热痛阈值的影响盐酸吗啡(0.075mg/kg)和蟾毒色胺季铵盐(5,10mg/kg)剂量下，腹腔给药半小时，测试显示三组药物不能延长小鼠后足对热板的痛阈。蟾毒色胺季铵盐(5,10mg/kg)组小鼠痛阈延长值仅为2.9％和13.5％，说明在上述选定剂量下单独使用下列药物给药后30min时不能产生镇痛作用。但是当上述剂量的药物联合使用(吗啡+蟾毒色胺季铵盐)后，与给药前相比，小鼠痛阈延长值显著增加到30.4％和48.6％(p＜0.05)，联用组产生显著镇痛效果。说明蟾毒色胺季铵盐与吗啡联用具有协同增效作用。表13蟾毒色胺季铵盐与吗啡联用的中枢镇痛作用(n＝10-12)以上实施方式仅为本发明的较佳实施例，只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本
发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3