一种工业用酶液的热处理澄清方法与流程

本发明属于工业用酶制剂生产技术领域，具体涉及一种工业用酶液的热处理澄清方法，适用于大规模制备工业用酶液的澄清工艺。

背景技术：

酶是由活细胞产生的、催化特定生物化学反应的一种生物催化剂。酶制剂是酶经过提纯、加工后的具有催化功能的生物制品，主要用于催化生产过程中的各种化学反应，具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点，其应用领域遍布食品、纺织、饲料、洗剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等方面。

酶制剂产业是知识密集型高技术产业，是生物工程领域的重要组成部分。工业用酶制剂(gb/t20370—201x)是酶制剂产业中重要的一员，目前工业化生产的工业用酶制剂主要是以霉菌和细菌为主，其次由酵母、放线菌生产。当代工业用酶主要从微生物中分离，因其具有如下优点：1、生长速度快；2、培养所占空间小；3、方便的遗传操纵性；4、培养基成本低，可以广泛应用于工业生产；5、微生物分泌的酶性质更加广泛；6、微生物分泌酶多为是胞外酶，并且操作工艺简单。

酶制剂技术领域经多年研究发展，从技术上总结了工业用酶制剂的分离纯化方法有：有机溶剂沉淀法、盐析法、等电点法、变性沉淀法、单宁法、葡聚糖凝胶deae-纤维素法、双水相萃取纯化法等。但上述大部分的分离纯化方法仅适用于实验室内小规模工业用酶制剂的制备，操作繁琐且工业化成本较高。

目前，国内的工业用酶制剂的生产多为采用发酵生产工艺，该发酵生产工艺通常依次分为以下几个步骤：菌种培养、发酵、发酵液预处理及酶液的分离纯化，最终依据用途得到液体酶制剂、粒装酶制剂或是粗制酶制剂。其中，发酵液预处理通常为将发酵罐中的发酵液在进行细胞破碎后加入絮凝剂进行絮凝处理，再离心过滤出液体部分。上述发酵液预处理过程通常是为了得到澄清的酶液，一方面是因为发酵液在细胞破碎后较为粘稠和浑浊，很难将其直接与反应物混合均匀，因此无法直接应用于工业生产上进行催化；另一方面是为了方便后续进一步处理，如真空浓缩等工艺。

但目前工业用酶制剂工业化生产所需的絮凝剂普遍为化学絮凝剂，如pei(聚乙烯亚胺)等，但此类化学絮凝剂尤其是pei通常具有很强的毒性，其使用过程中需要工人注意防护，同时因为其絮凝后的固废含有大量絮凝剂残留，因此不能作为一般生物垃圾处理，甚至不能掩埋处理，否则会对环境造成极大的污染，其唯一可行的处理方法是焚烧，这不仅不环保，也给企业造成很大的负担。

例如，中国授权发明专利“一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法”(申请号：201410843158.5)，公开了一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法，该方法包括以下步骤：(1)将大肠杆菌发酵液用陶瓷膜浓缩后，用磷酸盐缓冲液透析，高压破碎后，得细胞破碎液；(2)在细胞破碎液中加入由硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺组成的混合絮凝剂，在室温下絮凝；加入硅藻土，离心收集上清液；(3)在上清液中加入复合硫酸盐后加热；冷却至室温后，加入硅藻土，离心收集上清液；(4)用聚丙烯晴材质的中空纤维膜浓缩，用磷酸盐缓冲液透析，得浓缩酶液；(5)在浓缩酶液中加入固定化载体，酶与载体充分结合后抽滤，即得。该授权发明专利中就是采用了硫酸铝、硫酸亚铁和中性聚丙烯酰胺组成的混合絮凝剂，其中，硫酸铝对人体眼睛、粘膜有一定的刺激作用，且容易污染水体；硫酸亚特对呼吸道有刺激性，吸入引起咳嗽和气短，误服严重者可致死，且对环境有危害，对水体可造成污染；聚乙烯亚胺具有很强的毒性，且对环境有危害。

中国发明申请专利“一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法”(申请号：201910689377.5)公开了一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，属于生物技术领域。具体涉及一种重组产朊假丝酵母尿酸酶的纯化方法，即将表达重组蛋白的细胞上清依次经过聚乙烯亚胺絮凝、硫酸铵盐析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、层析脱盐、冷冻干燥得到高纯度重组产朊假丝酵母尿酸酶。本发明具有生产周期短、目的产物纯度高、部分产品质量指标得到了有效改进，整个工艺过程具有易于控制和规模化放大生产等特点。该发明申请首先使用了聚乙烯亚胺作为絮凝剂絮凝处理，再通过硫酸铵进行盐析等方式纯化目标蛋白。其中，硫酸铵对眼睛、粘膜和皮肤有刺激作用，且同样具有一定的环境危害。

由于上述絮凝剂的使用主要是针对发酵液在细胞破碎处理后的澄清及初步纯化分离，因此，若具有一种工艺简单、成本较低且不会对操作人员产生健康危害，并具有环保优势的澄清方法，将非常有利于工业用酶制剂的工业化生产，具有极佳的推广价值。

技术实现要素：

本发明为了解决上述背景技术中的问题，提供一种工业用酶液的热处理澄清方法，该方法具有工艺简单、成本较低且具有环保优势，澄清后酶液中目的蛋白的酶活损失不大于10％，且浊度低于500ntu并能够通过0.2μm的过滤膜。

为实现上述目的，本发明是采用由以下技术措施构成的技术方案来实现的。

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择在50～90℃下半衰期t50为>1min的目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为下述两种方式任一：

a.收集细胞破碎液置于反应釜中，调整温度至60～70℃，恒温加热并保持搅拌15～120min；

b.将细胞破碎液匀速通过一段加热管道，所述加热管道内温度为70～90℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该加热管道内的通过时间为5～600s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为目的蛋白的工业用酶澄清液。

通常而言，上述工业用酶澄清液可直接用于工业生产中的催化反应，或是按照现有发酵生产工艺进一步后处理(例如酶促反应)得到不同规格的工业用酶制剂产品。

其中，步骤(1)所述选择在50～90℃下半衰期t50为>1min的目的蛋白，通常为选择其目的蛋白本身符合上述热稳定性，或是通过定向进化技术所得到的目的蛋白，为了更好地说明本发明，并提供一种优选地实施方式，所述目的蛋白为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶。

其中，步骤(1)所述将发酵液进行细胞破碎处理，具体工艺可参考现有发酵生产工艺，为了更好地说明本发明，并提供一种优选的实施方式，上述细胞破碎处理为通过均质机将发酵液进行细胞破碎处理，或是先将发酵液离心处理，收集菌体后回溶至缓冲液，再通过均质机进行细胞破碎处理。

其中，步骤(2)热处理澄清方式a中，通常为根据细胞破碎液容积大小选择合适规格的反应釜，并在恒温加热过程中搅拌速度不低于200r/min，以保证反应釜内细胞破碎液不会出现局部过热的现象。

其中，步骤(2)热处理澄清方式b中，所述加热管道通常选择能够保持管道内恒温加热的结构或方式方法，为了更好的保持恒温加热，优选水浴加热管道。

为了更好地说明本发明，并提供一种优选地实施方式，所述水浴加热管道为具有内外管结构的套管，且在外管内通入恒温循环热水；

或是，所述水浴加热管道为放置于水浴加热槽内的管道，水浴加热槽内通入恒温循环热水，通常而言，所述管道可为任意形状，优选蛇形管结构以增加管道在水浴加热槽内的总长度。

值得注意的是，本发明没有对步骤(2)中所述加热管道的长度及细胞破碎液的流速进行限制，通常而言，加热管道的长度和细胞破碎液的流速在满足能够使得细胞破碎液在5～600s内通过加热管道即可。

此外，因为加热管道内非目的蛋白的其他杂质蛋白质容易因蛋白质变性絮凝析出，因此所述加热管道的直径以不小于4mm为宜。

值得说明的是，为了使得步骤(2)中所述热处理澄清的效果更佳，通常优选采用热处理澄清方式b，因为方式a在工业化生产中，需要在一定时间内澄清的细胞破碎液处理量通常在吨级左右，因此与之匹配的反应釜在恒温加热过程中，温度的局部过热或过冷现象是无法避免的，这也反映在了方式a中的恒温加热控制为较为保守的60～70℃。而方式b采用加热管道的形式避免了局部温度过热或过冷的现象，从而恒温加热能够控制到70～90℃，进一步提高了酶液的澄清效果。

其中，步骤(3)所述离心处理，在工业化生产中，通常为采用能够进行连续离心的设备，例如碟式离心机或管式离心机。

按照本发明上述的技术手段，最终所得工业用酶澄清液，浊度不高于500ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失不大于10％。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明所提供的热处理澄清方法，具有工艺简单、成本较低且具有环保优势，不会产生有毒有害固废料，澄清后酶液中目的蛋白的酶活损失不大于10％，且浊度低于500ntu并能够通过0.2μm的过滤膜。

2、本发明方法严格选择热处理澄清过程中的恒温加热温度及加热时间，从而最大程度保留目的蛋白的酶活性，并能够保障足够的澄清效果。

3、本发明方法因为采用了加热处理，发酵液中绝大部分大肠杆菌在热处理的过程中已死亡，不会造成环境污染。

4、本发明率先在工业用酶制剂制备工艺上采用热处理澄清方法，打破了传统工业用酶制剂仅通过化学絮凝剂进行澄清处理的技术偏见，在本领域具有指导意义，具有极佳的推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中加热管道的结构示意图。

图2为本发明实施例1-7在热处理澄清前后蛋白电泳对比图，其中1为标准蛋白分子量梯度，2为实施例1、2脱氢酶在热处理澄清前，3为实施例1在热处理澄清后，4为实施例2在热处理澄清后，5为实施例3、4脱氢酶在热处理澄清前，6为实施例3脱氢酶在热处理澄清后，7为实施例4脱氢酶在热处理澄清后，8为实施例5、6酮还原酶在热处理澄清前，9为实施例5酮还原酶在热处理澄清后，10为实施例6酮还原酶在热处理澄清后，11为实施例7磷酸激酶在热处理澄清前，12为实施例7磷酸激酶在热处理澄清后。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明。值得指出的是，给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员根据本发明的内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍应属于本发明保护范围。

下述浊度的检测采用浊度检测国标：gb13200-91。

实施例1

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择脱氢酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

如图1所示，将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽100内的蛇形管200(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，在水浴加热槽100内通入恒温循环热水101，控制该蛇形管200内温度为85℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该蛇形管200内的通过时间为25s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为脱氢酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为50ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为4％。

实施例2

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择脱氢酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的u型管道(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，控制u型管道内温度为80℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该u型管道内的通过时间为30s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为脱氢酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为56ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为4％。

实施例3

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择脱氢酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的w型管道(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，控制w型管道内温度为90℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该w型管道内的通过时间为24s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为脱氢酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为30ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为6％。

实施例4

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择脱氢酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的直管加热管道(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，控制直管加热管道内温度为85℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该直管加热管道内的通过时间为28s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为脱氢酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为50ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为5％。

实施例5

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择酮还原酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的加热管道(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，控制加热管道内温度为84℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该加热管道内的通过时间为35s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为酮还原酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为44ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为2％。

实施例6

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择酮还原酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的加热管道(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，控制加热管道内温度为90℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该加热管道内的通过时间为15s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为酮还原酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为32ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为10％。

实施例7

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择磷酸激酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的加热管道(管道直径为5.5mm，总长度为1.4m)，控制加热管道内温度为82℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该加热管道内的通过时间为30s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为磷酸激酶的工业用酶澄清液。

经检测，所得工业用酶澄清液的浊度为55ntu，能够通过0.2μm的过滤膜且不会发生堵塞现象，酶活损失约为6％。

如图2所示，可以明显看出，实施例1～7在经过热处理澄清后，细胞破碎液中的目的蛋白完全保留，而其他杂蛋白得到了很好的去除效果。

实施例8

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择醛缩酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的加热管道(管道直径为10mm，总长度为5m)，控制加热管道内温度为70℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该加热管道内的通过时间为480s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为醛缩酶的工业用酶澄清液。

实施例9

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择转氨酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

将细胞破碎液匀速通过一段放置于水浴加热槽内的加热管道(管道直径为20mm，总长度为7m)，控制加热管道内温度为75℃，并通过控制细胞破碎液的流速使得其在该加热管道内的通过时间为600s；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为转氨酶的工业用酶澄清液。

实施例10

一种工业用酶液的热处理澄清方法，包括以下步骤：

(1)选择目的蛋白培养发酵：

选择脱氨酶为目的蛋白，按照现有发酵生产工艺发酵得到发酵液，再将发酵液通过均质机进行细胞破碎处理，即得细胞破碎液；

(2)热处理澄清：

将步骤(1)所得细胞破碎液进行热处理澄清，所述热处理澄清为：

收集细胞破碎液置于反应釜中，调整温度至65℃，恒温加热并保持搅拌30min，搅拌速度为200r/min；

(3)后处理：

将步骤(2)热处理澄清后的液体进行离心处理，并收集清液，即为脱氨酶的工业用酶澄清液。