混菌二次发酵技术及其在L-丙氨酸工业化生产中的应用的制作方法

本发明涉及一种混菌二次发酵技术及其应用，属于微生物发酵工程领域。

背景技术：

混菌发酵技术具备纯种发酵难以做到的优点，它可以充分利用培养基和设备，在同一发酵罐中经过同一工艺过程，实现发酵，可提高目的产品的质和量或获得两种以上产品。但是混合菌发酵的反应机制较为复杂，尤其是不同种属的菌种培养条件差异大，难以统一，因此工业化生产应用较少，目前主要应用于传统固体发酵，如白酒等。此外，利用混菌发酵制备的发酵液进行催化转化，涉及酶的催化条件的统一，所以，综合发酵的难度，在生物转化领域的应用难度更高。如能统一二者，将成为发酵工程的一个新亮点。

本发明在前期研究基础上，利用诱变获得的工业化高产菌株为出发菌株，深入研究，通过对大肠杆菌cgmcc9850所产生的l-天冬氨酸酶的ph耐受性及ph适用范围研究发现，经过多次诱变获得的该菌株，ph适用范围更广，为催化条件统一提供了条件。故此，本发明对大肠杆菌cgmcc9850和睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083的培养基组成进行优化，并通过二次接种、分段发酵、阶段补料等工艺优化，在培养角度实现混菌发酵，成功获得的同时高表达l-天冬氨酸酶和l-天冬氨酸-β-脱羧酶，二者的酶活力均满足生物转化要求，即实现了发酵过程统一。

在l-丙氨酸生产中，生物发酵酶催化法为主要方法，以单菌发酵法获得发酵为酶源催化底物l-天冬氨酸，通过l-天冬氨酸-β-脱羧酶催化脱羧，获得l-丙氨酸。程池等构建同时表达l-天冬氨酸酶和l-天冬氨酸-β-脱羧酶的基因工程菌催化反应富马酸，单菌发酵催化，首次实现以富马酸为底物催化生产l-丙氨酸(cn105018405)，但该方法使用基因工程菌发酵，对于食品工业产业化项目存在限制，目前无法对接产业化。本发明通过采用混菌技术二次阶段发酵，通过工艺优化解决上述产业化问题，具有显著的产业化优势。

采用本发明进行工业化生产，可以显著提升生产效率，并且不经过l-天冬氨酸生产和纯化过程，节省人力、设备和分离纯化成本，具有显著的经济效益。

附图说明

附图1为cgmccno.9850菌株催化ph范围。

技术实现要素：

本发明涉及一种混菌二次发酵技术及其在l-丙氨酸工业化生产中的应用。

具体内容为：(1)分别以种子培养基培养菌大肠杆菌cgmcc9850和睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083；(2)配置混菌一次发酵培养基，配方为(g/l)蛋白胨5-10，玉米浆干粉10-20，谷氨酸钠6-10，硫酸镁0.1-0.3，磷酸氢二钾0.5-1.5，以naoh调ph至6.5-7.5；(3)接种睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083，36℃培养6-10h；(4)接种大肠杆菌cgmcc9850后，补加富马酸10g/l，以氨水调ph至6-7，继续培养8-15h，获得发酵液。

经过优化，最佳的混菌一次发酵培养基配方为(g/l)蛋白胨8.5玉米浆干粉15，谷氨酸钠8.0硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1.0，以naoh调ph至7.0。二次发酵最佳补料浓度为：富马酸10g/l，氨水调节ph至6.5。一次发酵最佳时间为8h，二次发酵最佳时间为12h。在最佳条件下进行混菌二次发酵，发酵液l-天冬氨酸酶的酶活力达4900u/ml，天冬氨酸脱羧酶活力达26000u/ml。以此高酶活力的发酵液为酶源，有效ph范围为6.0-8.0，催化富马酸和氨水，可实现双酶催化，一步获得l-丙氨酸，摩尔转化率达98.6％，催化时间为8h，催化效率提升300％。

具体实施方式

实施例1l-天冬氨酸酶催化的ph范围

将前期筛选诱变获得的菌种大肠杆菌cgmcc9850进行发酵培养，发酵培养基为(g/l)：玉米浆干粉13.0，硫酸镁0.2，磷酸二氢钾1.0，氯化钠1.5，富马酸5.0，葡萄糖5.0，氨水调ph至6.5-7.0，收集发酵液，分别测定ph5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下的酶活力，结果如附图1所示，根据测定的酶活力及对应的ph值，绘制拟合曲线，可见在ph6.0-8.0范围内，大肠杆菌cgmcc9850的l-天冬氨酸酶活力无显著性差异，该ph范围与睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083同步，为混菌发酵和联合催化奠定了基础。

实施例2发酵培养基优化

选择发酵关键因素碳源、氮源和诱导物，以单因素分析结合正交实验法，分别筛选葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、富马酸、谷氨酸、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆干粉、酵母粉、水解棉籽蛋白等碳源、氮源和诱导物，以菌体生长和酶活力综合评定，结果表明，最佳氮源为蛋白胨和玉米浆干粉，最佳碳源为谷氨酸钠和富马酸，进一步优化浓度，获得一次发酵培养基配方范围为(g/l)：蛋白胨5-10，玉米浆干粉10-20，谷氨酸钠6-10，硫酸镁0.1-0.3，磷酸氢二钾0.5-1.5，以naoh调ph至6.5-7.5，二次接种发酵补料为终浓度8-15g/l富马酸，以氨水调ph至6.5。最佳的混菌发酵培养基配方为(g/l)蛋白胨8.5玉米浆干粉15，谷氨酸钠8.0硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1.0，以naoh调ph至7.0。补加富马酸的最佳量为10g/l，氨水调节ph至6.5。初次发酵36℃6-12h，二次发酵36℃10-16h。

实施例350l罐发酵和20t罐发酵

以上述优化的最佳培养基分别在50l和20t发酵罐进行中试和试生产，分段二次发酵，一次发酵睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083，36℃培养8h后接种大肠杆菌cgmcc9850，继续发酵12h，发酵终点时，两株菌的活力最高，分别达26000u/ml和4900u/ml以上。由于l-天冬氨酸酶活力足够高，且作为联产限速步骤，所以尽管混菌发酵时l-天冬氨酸-β-脱羧酶活力略低于单菌发酵，但对生产效率无影响。

实施例4l-丙氨酸一步生产

以上述培养液为酶源，向其中加入终浓度为20％富马酸后，以氨水调节ph至6.0-8.0，42℃催化反应8h，富马酸转化率达99.5％，l-天冬氨酸转化率达99.1％，综合转化率达98.6％。回收l-丙氨酸检测，产品符合国家相关标准。该转化生产过程为一步完成，生产效率提升高达300％，显著高于单菌生产，获得相同产量的产品时间仅为原生产周期的1/4。

技术特征：

1.混菌二次发酵技术及其在l-丙氨酸工业化生产中的应用，其特征在于该方法涉及两株不同属的菌种在同一发酵条件下实现发酵共同发酵，且高表达酶，能够在相同的催化条件下实现l-丙氨酸的生产。

2.根据权利要求1所述，其特征在于经过诱变的发酵菌种菌大肠杆菌(escherichiacoli)cgmcc9850和睾丸酮丛毛单胞菌(comamonastestosteroni)cgmcc6083具备催化条件统一性。

3.根据权利要求1所述，其特征在于发酵培养基经过优化后，两株菌可实现同步生长，混菌发酵，关键过程为：

(1)分别以种子培养基培养菌大肠杆菌cgmcc9850和睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083；

(2)配置混菌一次发酵培养基，配方为(g/l)蛋白胨5-10，玉米浆干粉10-20，谷氨酸钠6-10，硫酸镁0.1-0.3，磷酸氢二钾0.5-1.5，以naoh调ph至6.5-7.5；

(3)接种睾丸酮丛毛单胞菌cgmcc6083，36℃培养6-10h；

(4)接种大肠杆菌cgmcc9850后，补加富马酸10g/l，以氨水调ph至6-7，继续培养8-15h，获得发酵液。

4.根据权利要求3所述，其特征在于最佳的混菌一次发酵培养基配方为(g/l)蛋白胨8.5玉米浆干粉15，谷氨酸钠8.0硫酸镁0.2，磷酸氢二钾1.0，以naoh调ph至7.0。二次发酵最佳补料浓度为：富马酸10g/l，氨水调节ph至6.5。

5.根据权利要求3所述，其特征为一次发酵最佳时间为8h，二次发酵最佳时间为12h。

6.根据权利要求3所述，其特征在于混菌二次发酵后，发酵液l-天冬氨酸酶的酶活力达4900u/ml，天冬氨酸脱羧酶活力达26000u/ml。

7.根据权利要求5所述，获得的高酶活力的发酵液，其特征在于在ph6.0-8.0范围内，l-天冬氨酸酶酶活力均可达4800u/ml。

8.根据权利要求5所述，其特征在于以二次发酵的发酵液作为酶源，催化富马酸和氨水，可实现双酶催化，一步获得l-丙氨酸，摩尔转化率达98.6％，催化时间为8h，催化效率提升300％。

技术总结
本发明公开了一种混菌二次发酵技术及其在L‑丙氨酸工业化生产中的应用，属于微生物发酵工程领域。以大肠杆菌和睾丸酮丛毛单胞菌为出发菌株，优化混菌发酵培养基组成和发酵工艺，成功建立了混菌二次发酵方法，在最佳的发酵条件下，发酵液L‑天冬氨酸酶的酶活力达4900U/mL，酶的pH耐受性及适用范围为6.0‑8.0，天冬氨酸脱羧酶活力达26000U/mL，以此发酵液为酶源，催化富马酸和氨水，可实现双酶催化，一步获得L‑丙氨酸，摩尔转化率达98.6％，催化时间为8h，催化效率提升300％。具有产业化应用价值。

技术研发人员：张奇;姜国政;崔颖;杨奕;马秀亮
受保护的技术使用者：北京城市学院;烟台恒源生物股份有限公司
技术研发日：2019.12.16
技术公布日：2020.05.12