孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物、其引物及应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，涉及一类孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物、其引物及应用。

背景技术：

高胆固醇血症(hypercholesteremia)是指总胆固醇(totalcholesterol,tch)或低密度脂蛋白(ldl-c)水平升高(tch≥5.20mmol/l或ldl-c≥3.38mmol/l)，或高密度脂蛋白(hdl-c)水平降低(hdl-c≤1.04mmol/l)。高胆固醇血症是动脉粥样硬化、心血管疾病、高血压等疾病发生的重要危险因素。在中国，高胆固醇血症造成的居民死亡和疾病负担日趋严重。2013年高胆固醇血症导致了我国居民29.9万人死亡和633.2万人年伤残调整寿命年损失。近年来，随着城市化进程加快以及人民生活方式的转变，中国人群总胆固醇水平逐步升高，高胆固醇血症患病率明显增加。2000-2001年亚洲心血管病合作研究报道，我国在35-74岁人群中，高胆固醇血症发病率高达9％。传统观点认为，高胆固醇血症的发生主要与出生后环境相关，但流行病学调查及动物实验发现，孕期遭受不良环境子代或宫内发育迟缓(intrauterinegrowthretardation,iugr)者成年后高胆固醇血症易感，更易出现高血脂、冠状动脉粥样硬化等疾病。因此，胎源性成年高胆固醇血症的早期诊断意义重大，有助于心血管疾病早期预警和防治。

地塞米松作为一种合成类糖皮质激素，因其易透过胎盘而广泛应用于具有早产风险的孕妇，以期提高早产儿的存活率，降低呼吸窘迫综合征的发生风险。2014年，世界卫生组织(worldhealthorganization,who)对29个国家359个机构的孕妇妊娠期糖皮质激素用药进行了调查，结果显示，各国对孕22-36周母体给予糖皮质激素预防性治疗，使用率平均为54％，而在某些国家糖皮质激素使用率可高达91％。多项研究表明，孕期地塞米松应用可导致子代iugr，iugr儿在成年期更容易出现血胆固醇水平升高。动物试验也表明孕期地塞米松应用可直接导致子代tch/ldl-c比值升高，心血管疾病易感。然而，孕期地塞米松应用所致的胎源性成年高胆固醇血症发生的机制及毒性靶标尚未明确。

肝脏是胆固醇代谢的主要器官，主要功能包括胆固醇合成、输出和逆转运。转录因子固醇调节元件结合蛋白2(sterolregulatoryelementbindingprotein2,srebp2)活化可通过hmgcoa还原酶(hmgcoareductase,hmgcr)调控胆固醇从头合成。载脂蛋白b(apolipoproteinb,apob)反映了肝脏胆固醇向外周组织的输出；清道夫受体b1(scavengerreceptorb1,sr-b1)和ldl受体(low-densitylipoproteinreceptor,ldlr)分别介导了hdl-c和ldl-c的摄取或者逆转运。ldlr广泛分布于肝细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，可以对胆固醇的动态平衡进行调节。不少研究证实，孕期不良环境可通过组蛋白修饰改变及基因表达改变的宫内编程介导成年疾病易感。宫内编程是指胎儿在发育过程中，所处的环境异常可使其原本的发育过程发生改变，导致机体功能产生长期或永久的变化，且主要与表观遗传修饰改变有关。组蛋白修饰是一种常见的dna序列不发生改变而基因表达模式和生物表型却出现了可遗传的改变的表观遗传学修饰模式。目前尚未有研究将肝脏中ldlr的组蛋白修饰及表达改变的宫内编程与孕期地塞米松应用所致胎源性成年高胆固醇血症的风险联系在一起。

外周血相关基因表达或表观遗传学修饰改变也可作为疾病的生物标志物。有研究表明：抑郁及焦虑状态下外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)中半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)表达与海马纹状体相关变化一致，可作为的神经组织替代标志物；iugr胎儿脐血干细胞肝细胞核因子(hepatocytenuclearfactor4alpha,hnf4a)基因启动子区发生dna甲基化修饰改变是导致幼年速发型糖尿病的重要标志。目前尚未有研究将外周血ldlr启动子区组蛋白乙酰化及基因表达与胎源性成年高胆固醇血症联系在一起。

地塞米松虽然临床使用广泛，可导致胎源性成年高胆固醇血症。然而，孕期地塞米松应用所致胎源性成年高胆固醇血症的临床早期预警困难，缺乏准确和灵敏的指标，更缺乏能早期预警风险评估系统和技术，无法有效的预防孕期地塞米松应用所致胎源性成年高胆固醇血症的发生。因此，寻找一种用于孕期地塞米松应用所致胎源性成年高胆固醇血症的早期预警的检测方法是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一类孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物，在孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代高胆固醇血症易感中，所述生物标志物为外周血ldlr启动子区h3k27ac及其基因表达水平，可作为孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症的早期预警指标，具有重要的临床指导意义。

本发明目的之二在于提供一种孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物的应用，所述外周血ldlr启动子区h3k27ac及其基因表达水平应用于孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症早期预警。

本发明目的之三在于提供一类孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物的引物，所述引物包括ldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物和ldlr基因表达特异性扩增引物。

本发明目的之四在于提供一种孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物引物的应用，利用所述引物制备孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症检测试剂盒，广泛应用于临床疾病早期预警检测中。

本发明实现目的之一采用以下技术方案：

一类孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物，在孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代高胆固醇血症易感中，所述生物标志物为外周血ldlr启动子区h3k27ac及其基因表达水平。

进一步地，在孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症中，所述外周血ldlr启动子区h3k27ac及其基因表达水平降低。

本发明实现目的之二采用以下技术方案：

一种孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物的应用，所述外周血ldlr启动子区h3k27ac及其基因表达水平应用于孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症的早期预警检测。

本发明实现目的之三采用以下技术方案：

一种孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物的引物，所述引物包括ldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物和ldlr基因表达特异性扩增引物：

(1)所述ldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物包括：

大鼠ldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物，其序列如下seqidno.1和seqidno.2所示：

上游引物5′-cggtttatgtgatgctgggg-3′seqidno.1，

下游引物5′-aagcctgaggacctgagttc-3′seqidno.2；

人ldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物，其序列如下seqidno.3和seqidno.4所示：

上游引物5′-gttcacgccattctcctgc-3′seqidno.3，

下游引物5′-cacgaggtcaggagatcaaga-3′seqidno.4；

(2)所述ldlr基因表达特异性扩增引物包括：

大鼠ldlr基因表达特异性扩增引物，其序列如下seqidno.5和seqidno.6所示：

上游引物5′-ggatccatggcaacatctac-3′seqidno.5，

下游引物5′-accctttctctcggaaca-3′seqidno.6；

人ldlr基因表达特异性扩增引物，其序列如下seqidno.7和seqidno.8所示：

上游引物5′-gaacccatcaaagagtgcgg-3′seqidno.7，

下游引物5′-ccaccctccaggttcacgca-3′seqidno.8。

本发明实现目的之四采用以下技术方案：

一种孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物引物的应用，利用所述引物制备孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症的临床早期预警检测试剂盒。

所述检测标本为pbmc。

本发明通过雄性大鼠研究证实，与对照组相比，孕期地塞米松暴露(prenataldexamethasoneexposure,pde)组子代大鼠成年后高胆固醇血症易感；pde组子代大鼠胎儿期肝脏ldlr启动子区h3k27ac及基因表达降低，并持续到出生后；同时发现pde组子代大鼠胎儿期pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因表达也降低，且持续到出生后，并与肝脏中上述两指标正相关。提示，pde组子代大鼠pbmc与肝脏ldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平具有一致性，且与其成年后高胆固醇血症易感相关。同时，本发明在临床孕期地塞米松应用组男性新生儿中也检测到pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平降低，与上述动物实验结果一致。即在孕期地塞米松应用的子代大鼠及人中，pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平降低，胎源性成年高胆固醇血症的风险更高，有较好的一致性。基于上述研究结果，pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平可以作为孕期地塞米松应用所致雄性或男性子代高胆固醇血症的生物标志物，为孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症易感早期预警提供了检测指标，为其早期预防和干预提供科学依据，具有重要的临床意义。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明以pbmc的ldlr启动子区h3k27ac(组蛋白乙酰化)及其基因表达水平作为孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物，有以下优势：(1)临床适用性好：外周血生物标志物在疾病状态下可以反映脏器状态，且具有临床取材简单，可重复利用；(2)灵敏：组蛋白乙酰化修饰改变的信息远较dna序列更容易受到环境因素(如营养、缺血缺氧、环境污染)的影响；(3)早期：组蛋白修饰改变早于基因表达及疾病表型发生，在疾病发生过程中是一个较早的分子事件；(4)可遗传性：本发明提供的生物标志物在孕期不良环境下出现，并可持续至出生后多个时间点，这一点在发育与生殖研究中尤为重要，可为宫内编程胎源性成年疾病的早期预警提供指导。

此外，目前孕期地塞米松应用所致的子代胎源性成年高胆固醇血症的临床早期预警困难，缺乏准确和灵敏的指标，因此采用pbmcldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物和ldlr基因表达特异性扩增引物制备早期预警孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症检测试剂盒，检测生物标志物--pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及其基因表达水平，用于早期预警胎源性成年高胆固醇血症，具有重要的临床意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中pde组雄性子代仔鼠成年后出现高胆固醇血症；

图2为本发明实施例1中pde组雄性子代仔鼠肝脏中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达降低；

图3为本发明实施例1中pde组雄性子代仔鼠pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达降低且与肝脏上述指标显著正相关；

图4为本发明实施例1中孕期地塞米松应用组男性新生儿pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达降低与动物水平一致。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明以下实施例1中以雄性wistar大鼠为动物代表例和男性新生儿为临床代表例说明孕期地塞米松应用所致雄性或男性子代高胆固醇血症易感的生物标志物。

【实施例1】

1.实验动物及动物处理

spf级健康wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：scxk(鄂)2008-2010。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。

实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替。

从湖北省疾控中心购买健康且成年的wistar大鼠，雌性体重为209±12g，雄性体重为258±17g。每晚6时按照雌雄2:1进行合笼，次晨检查阴栓及精子涂片确定雌鼠是否成功受孕，并记为孕0天(gestationday0,gd0)。受孕大鼠随机分为2组：对照组、孕期地塞米松暴露组(pde组)(n＝12窝/组)。pde组于gd9起分别皮下注射地塞米松0.2mg/kg.d，对照组皮下注射等体积蒸馏水。孕鼠于gd20经异氟烷麻醉，处死部分孕鼠并剖宫取胎鼠，称量胎鼠体重并处死。剩余的pde组和对照组孕鼠自然分娩，每周称量子代仔鼠体重，分别于出生后8周(postnatalweek8,pw8)和出生后28周(pw28)各取一只雄鼠麻醉，用抗凝采血管取全血，并收集肝脏组织。

2.血浆分离及pbmc提取

抗凝管采血静置1小时，分层后取上层血浆分装，放入-80℃备用。pbmc的提取使用单核细胞分离液进行。向抗凝采血管中加入pbs缓冲液稀释剩余血液，轻轻吹打混匀。在洁净的15ml离心管中加入适量pbmc分离液，将稀释后的血液轻轻平铺到分离液液面上方，注意保持两液面分界面清晰。室温，水平转子400g，离心30min。离心后将出现明显的分层，小心的吸取单个核细胞层放入洁净的离心管中，加入10mlpbs洗涤细胞，水平转子400g，离心10min。弃上清，加入5mlpbs重悬细胞，水平转子400g，离心10min，重复一次。弃上清，细胞沉淀放入-80℃备用。

3.子代大鼠血浆tch、ldl-c、hdl-c检测

实验前血浆样本冰上静置解冻并充分混匀，试剂盒平衡至室温待用。采用甘油-3-磷酸氧化酶法，检测血浆tch、ldl-c、hdl-c浓度。取蒸馏水、标准品或样本0.01ml分别与1.0ml测定试剂混匀后37℃孵育10min，以蒸馏水管为空白管校零后测定其他各管od500吸光度值，并根据标准品浓度计算样本浓度(mm)。

4.基因检测

从ncbi网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)下载目的基因和管家基因的mrna序列，应用primer5.0设计上下游引物，引物序列见表1。并在ncbi网站上行核苷酸blast同源比对，确证扩增片段的特异性。将大鼠肝脏组织和人及大鼠的pbmc用于总rna提取、逆转录和定量pcr，在abiprism7500仪器上进行。每一份cdna样本均在相同的实验条件下检测目的基因和管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)，同时测定引物扩增效率。通过溶解曲线及pcr产物凝胶电泳鉴定产物的特异性。同时根据目的基因与管家基因的相对表达来进行半定量分析srebp2、hmgcr、apob、sr-b1、ldlr表达。

表1rt-pcr引物序列

5.染色质免疫共沉淀

匀浆后的肝脏组织或pbmc中加入37％的甲醛室温放置10min进行染色质交联，然后加入2.5mm的甘氨酸室温放置5min终止交联。pbs清洗收集细胞后用超声破碎仪(工作条件为30％功率，2son，1soff)，进行超声破碎5min裂解dna链。4℃环境下12,000rpm离心10min，取上清收集dna片段。分装dna上清液，分别为igg、input、h3k27ac三管。除input外各分装dna上清液中加入1mg/ml的bsa封闭proteingbeads封闭，加入总量为1μg的对应抗体(abclonal,china)，4℃孵育过夜。3000rpm离心1min，收集免疫沉淀物。清洗并离心3次免疫沉淀物，65℃水浴过夜解交联。应用dna纯化试剂盒(tiangenco.,beijing,china)纯化dna，纯化后的dna用50μl水溶解，于-20℃保存。根据大鼠ldlr启动子区dna序列设计ldlr启动子区组蛋白乙酰化(h3k27ac)特异性扩增引物，引物序列见下表2。将每个纯化后的样本针对大鼠ldlr启动子进行realtimepcr，组蛋白乙酰化结果以input为参照。

表2rt-pcr引物序列

6.人群血标本采集

从武汉大学中南医院检验科收集男性新生儿抗凝血标本。分为2组：正常对照组(n＝38)和孕期地塞米松应用组(n＝22)。孕期地塞米松应用组及对照组纳入标准：湖北省武汉市中南医院20181001至20190130分娩的产前使用一个经典疗程地塞米松治疗(每12小时肌注一次，每次6mg，共4次)的男性新生儿，及之匹配胎龄的未使用地塞米松的男性新生儿。排除先天性畸形、家族遗传性病史者。采集出生后48小时内的新生儿抗凝血进行血浆及pbmc分离(方法如前)。

7.血标本rna提取

在分离出的pbmc中加入1mltrizol于匀浆器内，冰上充分匀浆后，转至无rnase1.5mlep管中。加入200μl氯仿抽提，剧烈震荡15s，冰上静置10min，4℃12,000×rpm离心15min。小心吸取500μl上层水相移至一新无rnase1.5mlep管中，加等体积的异丙醇，颠倒混匀沉淀rna，20～30℃静置10min。4℃12,000×rpm离心10min，弃上清，加1ml75％乙醇洗涤沉淀，颠倒混匀。4℃9500×rpm离心5min，弃乙醇(重复两次)，室温放置10min晾干。加60℃温育的depc处理水20μl；紫外分光光度计测rna浓度及纯度，-80℃保存。

8.新生儿pbmc的ldlr启动子区h3k27ac水平检测

将孕期地塞米松应用组和对照组新生儿pbmc进行染色质免疫共沉淀实验，最终获得input、h3k27ac、igg不同的ip产物，并通过dna纯化试剂盒纯化样本。根据人ldlr启动子区dna序列设计人ldlr启动子区组蛋白乙酰化(h3k27ac)特异性扩增引物，引物序列见下表3。每个纯化后的样本针对人ldlr启动子区进行realtimepcr，组蛋白乙酰化结果以input为参照。

表3rt-pcr引物序列

9.统计分析

spss17和prism5.0用于数据分析。定量数据被表示为均值±标准误(mean±s.e.m.)和获得的qrt-pcr独立样本t检验分析，双变量相关采用pearson单因素相关分析。以p<0.05作为差异有统计学意义。

10.实验结果

10.1pde组雄性仔鼠成年后出现高胆固醇血症，心血管疾病风险增加

如图1所示：与对照组相比，pw8及pw28时pde组子代大鼠血tch水平升高，ldl-c水平升高(p<0.05,p<0.001,fig.1a,1c)，hdl-c均无明显差异，提示，pde组成年子代大鼠出现高胆固醇血症表型；pde组血tch/hdl-c、ldl-c/hdl-c比值均升高(p<0.05,p<0.01,fig.1b,1d)，提示，心血管疾病风险增加。

10.2pde组雄性仔鼠肝脏中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达降低

如图2所示：gd20时期(胎儿期)，与对照组相比，pde组srebp2、hmgcr、apob及sr-b1、ldlr基因mrna表达水平均降低(p<0.05,p<0.01,fig.2a)；pw8时，与对照组相比，pde组srebp2、apob的基因mrna表达明显升高(p<0.01,fig.2c)，hmgcr及sr-b1的基因mrna表达无明显变化，ldlr的基因mrna表达明显降低(p<0.01,fig.2c)；pw28时，与对照组相比，pde组srebp2、apob的基因mrna表达无明显变化，hmgcr、sr-b1和ldlr的基因mrna表达降低(p<0.05,p<0.01,fig.2e)。以上结果提示，pde组雄性子代大鼠在宫内及出生后多个时间点ldlr表达均降低。进一步检测肝脏ldlr多个位点的组蛋白乙酰化水平，发现ldlr启动子区h3k27ac水平从宫内到出生后持续性降低(p<0.05,p<0.01,fig.2b,2d,2f)。以上提示pde所致ldlr基因表达降低与ldlr启动子区h3k27ac降低有关，且两者水平降低均从宫内持续到出生后。

10.3pde组雄性仔鼠pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达降低，且与肝脏上述指标显著正相关

如图3所示：进一步检测雄性子代大鼠在不同时间点的pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平，发现pde组子代大鼠pbmc中启动子区h3k27ac水平(p<0.05,p<0.01，fig.3a,3e,3i)及ldlr基因mrna表达(p<0.05,p<0.01，fig.3b,3f,3j)显著降低。提示，pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达与肝脏改变一致。进一步，通过相关性分析，发现gd20、pw8及pw28时pbmc与肝脏组织中ldlr启动子区h3k27ac显著正相关(p<0.05,p<0.01，fig.3c,3g,3k)，且pde组比对照组相关性更好；同时以上各时期pbmc与肝脏组织中ldlr基因mrna表达显著正相关(p<0.001,p<0.01,p<0.05,fig.3d,3h,3l)，且pde组比对照组相关性更好。提示，pde所致的雄性子代高胆固醇血症中，pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达相关性良好，可作为替代生物标志物。

10.4孕期地塞米松应用组(pde组)男性新生儿pbmc中ldlr启动子区h3k27ac及基因表达与动物水平一致

如图4所示：pde组男性新生儿pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因mrna表达明显降低(p<0.01,fig.4a,4b)。与动物实验水平观察到的结果一致。提示人pbmcldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平可作为孕期地塞米松应用所致的男性子代高胆固醇血症的生物标志物。

【实施例2】外周血ldlr启动子区h3k27ac及基因其表达应用于孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症的早期预警

pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因表达水平可以作为孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症易感的预警标志物，因此，本发明实施例1中依据ldlr启动子区dna序列设计ldlr启动子区组蛋白乙酰化(h3k27ac)特异性扩增引物：大鼠—seqidno.1和seqidno.2、人—seqidno.3和seqidno.4，以及依据ldlr的mrna序列设计的ldlr基因表达特异性扩增引物：大鼠--seqidno.5和seqidno.6、人--seqidno.7和seqidno.8，能用于检测pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及ldlr的基因表达。因此临床上，可应用pbmcldlr启动子区h3k27ac特异性扩增引物和ldlr基因表达特异性扩增引物制备孕期地塞米松应用所致的雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症的临床早期预警检测试剂盒，检测人或大鼠的孕期地塞米松应用所致雄性或男性子代胎源性成年高胆固醇血症易感的生物标志物----pbmc的ldlr启动子区h3k27ac及基因表达，进一步为其早期预防和干预提供科学依据，具有重要的临床意义。

序列表

<110>武汉大学

<120>孕期地塞米松应用所致子代高胆固醇血症易感的生物标志物、其引物及应用

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<400>17

cttctggtgcccatcattta20

<210>18

<211>19

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<400>18

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<400>19

gcaagttcaacggcacag18

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<400>20

gccagtagactccacgaca19