本发明属于基因检测
技术领域：
，特别涉及一种检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法。
背景技术：
：家族性地中海热(familialmediterraneanfever，fmf)是一种常染色体隐性遗传性疾病，属于单基因自身炎症性疾病，临床表现为反复发作性发热伴腹膜炎、胸膜炎、滑膜炎和下肢丹毒样皮疹。长期反复发作的炎性反应会导致肾脏淀粉样变。典型的fmf发作每次持续小于3d，发作频率从每周1次至每年数次不等。口服秋水仙碱有效，并能预防淀粉样变。fmf的致病基因mefv位于第16号染色体短臂，编码含781个氨基酸的蛋白称为炎素(pyrin)，炎素对于炎性反应的发生具有抑制作用。fmf累及全球约100000例患者，大多数是地中海裔人群，包括土耳其人、阿拉伯人、亚美尼亚人和犹太人。最常见的mefv基因突变有5种:m694v、v726a、m680i、m694i(以上4种位于外显子10)及e148q(位于外显子2)，占所有fmf基因突变的74％。但是，近几年在其他国家和种族出现了越来越多的fmf病例报道，如美国和日本。以同属亚洲的日本人为例，最早于2002年报道了fmf患者，此后陆续又有许多病例报道，其中包括1项全国调查问卷病例，总共80例。这项研究表明，日本fmf患者临床症状较地中海裔人群更轻微，淀粉样变发生率更低，基因突变类型也不同。目前，已有许多fmf诊断标准被应用于临床，但目前所共识的诊断标准都是基于地中海裔人群所设立的，亚洲人可能不一定完全符合该诊断标准，因此中国人fmf发病率极大可能被低估。尽管fmf仍被视为一种罕见病，但临床医生仍需迫切提高对本病的认识，最大程度地避免漏诊和误诊。依赖科学技术的发展，目前单基因病的诊断以二代测序为主，但其操作步骤繁复、检测时间长、对技术人员操作及分析能力要求较高，这些容易对检测结果的可靠性产生影响，同时二代测序检测试剂及分析耗材昂贵，较高的成本给其在二代测序疾病分子诊断及人群筛查中的应用带来诸多挑战，影响了应用的普及。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法；利用该引物组的检测方法所得检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，检测成本大大降低，适合批量筛查。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种检测家族性地中海热单基因病的引物组，包括用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如seqidno.1～54所示的一对或多对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如seqidno.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。进一步地，上述引物组包括用于检测家族性地中海单基因病的27个突变位点的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如seqidno.1～54所示的全部的27对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如seqidno.55～81所示的全部的27个延伸引物。本发明还提供了一种检测家族性地中海热单基因病的试剂盒，该试剂盒含有用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，该扩增引物组包括核苷酸序列如seqidno.1～54所示的一对或多对扩增引物，该延伸引物组包括核苷酸序列如seqidno.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。进一步地，该试剂盒含有的扩增引物组和延伸引物组用于检测用于检测家族性地中海单基因病的27个突变位点，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如seqidno.1～54所示的全部的27对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如seqidno.55～81所示的全部的27个延伸引物。进一步地，该试剂盒还包括pcr反应taq酶和pcr缓冲液，pcr反应taq酶、pcr缓冲液与所述扩增引物用于制备多重pcr扩增反应体系。进一步地，该试剂盒还包括sap酶和sap缓冲液，所述sap酶和sap缓冲液用于制备碱性磷酸酶处理反应体系。进一步地，该试剂盒还包括iplex酶和iplex缓冲液，该iplex酶、iplex缓冲液与所述延伸引物用于制备延伸反应体系。进一步地，该试剂盒还包括massarray芯片。本发明还提供了一种检测家族性地中海热单基因病的方法，包括以下步骤：(1)获得用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物和延伸引物；(2)提取待检测样本的dna；(3)以步骤(2)提取的dna为模板，使用步骤(1)获得的扩增引物通过pcr扩增，获得目标序列扩增产物；(4)利用sap酶除去步骤(3)获得的扩增产物中含有的游离的dntps；(5)以步骤(3)获得的目标序列扩增产物为模板，利用步骤(1)获得的延伸引物进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；(6)纯化步骤(5)获得的延伸产物；(7)将纯化后的延伸产物采用飞行时间质谱基因分型系统进行检测和分型。本发明的有益效果是：本发明采用不同的引物设计软件，并结合agilentearraydesign探针设计系统，通过不断优化引物序列，最终将这27个突变位点的多重pcr扩增压缩至1个well(孔)中进行。采用本发明的引物组进行检测家族性地中海热单基因病的方法，检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，且操作便利，检测灵敏度高，节省时间，检测成本大大降低，适合批量筛查。具体实施方式下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例一、引物设计本发明依据omim、clinvar等专业遗传数据库，并查阅相关数据库收集了中国人所常见的突变，共收集家族性地中海热单基因病突变位点27个，分别为：rs104895093、rs104895091、rs11466018、rs104895098、rs104895085、rs11466045、rs104895076、rs104895105、rs104895128、rs104895179、rs75977701、rs387907570、rs28940580、rs28940578、rs61752717、rs28940579、rs3743930、rs104895079、rs104895081、rs104895083、rs104895094、rs61732874、rs104895097、rs11466023、rs11466024、rs11466048、rs146820856。针对massarray技术，如果将27个基因突变位点放在1个well中，就需要考虑通过实验条件不断优化引物。我们采用不同的引物设计软件，如primrpremier、oligo、vectorntisuit、dnasis、omiga、dnastar等，并结合agilentearraydesign探针设计系统，通过不断优化引物序列，得到核苷酸序列如seqidno.1～54所示的27对扩增引物，以及核苷酸序列如seqidno.55～81所示的27个延伸引物，最终将这27个基因突变位点的检测压缩至1个孔中进行；针对该27个基因突变位点的扩增引物序列和延伸引物序列如表1所示。表1扩增引物序列和延伸引物序列本发明提供的试剂盒包含了表1中所示的扩增引物和延伸引物；进一步的，该试剂盒还包含pcr反应taq酶、pcr缓冲液、sap酶、sap缓冲液、iplex酶、iplex缓冲液以及massarray芯片；本发明的实施例利用该试剂盒进行基因突变检测。二、基因突变检测本实施例收集了10例疑似家族性地中海热患者的血液样品(均已签署知情同意书)，具体基因检测过程如下：2.1dna提取使用wizardgenomicdnapurificationkit(promega)或nucleospintissue(mn)等试剂盒或类似产品，提取10例血样中的dna。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组dna电泳条带通常不小于20kb。质检合格的dna将浓度调整到50ng/μl，转移至384孔板，-20℃储存备用。2.2pcr扩增pcr扩增采用多重pcr技术，在384孔板中进行，每个pcr扩增反应体系的总体积为5μl。在一个新的1.5mlep管中按照表2配制pcrmastermix溶液。表2pcrmastermix溶液试剂对每个反应的体积，μl10×pcr缓冲液0.5mgcl2(25mm)0.4dntp混合物(25mm)0.1热启动taq酶(5u/μl)0.1水1.9pcr扩增引物混合物1总体积4使用24通道加样器，调节加样体积为4μl，在384孔板的每个加样孔中加入pcrmastermix溶液，该384孔板即为pcr反应板。取出已经制备好的dna样品384孔板，使用24通道加样器，调节加样体积为1μl，在上述pcr反应板的加样孔中加入提取的dna，得到pcr扩增反应体系；每个5μl的pcr扩增反应体系中包含模板dna50ng，热启动taq酶0.5u，每条扩增引物0.5pmol，0.1μl的25mmdntps。在兼容384孔板的pcr仪上设定pcr反应条件为：94℃预变性4分钟；94℃变性20秒,56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，45个循环；72℃延伸3分钟；4℃保持。将384孔pcr反应板放置于pcr仪上，启动pcr反应。反应结束后，得到pcr扩增产物。2.3pcr扩增产物碱性磷酸酶处理在pcr反应结束后，将pcr扩增产物用sap(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dntps，具体过程如下：按照表3配制碱性磷酸酶处理反应液。表3碱性磷酸酶处理反应液试剂对每个反应的体积，μl水1.53sap缓冲液(10×)0.17sap酶(1.7u/ul)0.3总体积2使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将碱性磷酸酶处理反应液加入到384孔pcr反应板中。对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，碱性磷酸酶处理反应体系总体积为7μl，其中包含pcr扩增产物5μl，碱性磷酸酶处理反应液2μl。将上述384孔pcr反应板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件：37℃40分钟；85℃5分钟；4℃维持，启动pcr仪进行碱性磷酸酶处理。2.4单碱基延伸在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，单碱基延伸反应体系总体积为9μl。按照表4配制单碱基延伸反应液。表4单碱基延伸反应液试剂对每个反应的体积，μl水0.619延伸引物混合物0.94iplex缓冲液0.2iplexterminator0.2iplex酶0.041总体积2使用24通道加样器，调节加样体积为2μl，将单碱基延伸反应液对应加入到384孔pcr反应板中。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含碱性磷酸酶处理后的pcr扩增产物7μl及单碱基延伸反应液2μl。将384孔pcr反应板放置在兼容384孔板的pcr仪上，设定pcr反应条件如下：i.94℃预变性30秒；ii.94℃变性5秒；iii.52℃退火5秒；iv.80℃延伸5秒；v.gotoiii，4个循环；vi.gotoii，39个循环；vii.72℃延伸3分钟；viii.4℃保持。启动pcr仪进行单碱基延伸反应；在该过程中，以获得的扩增产物为模板，采用延伸引物通过单碱基延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。2.5树脂纯化将cleanresin树脂平铺到6mg的树脂板中；加16μl水到延伸产物的对应孔内；将干燥后的树脂倒入带有延伸产物的反应板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与延伸产物充分接触；离心使树脂沉入孔底部。2.6芯片点样启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上。2.7质谱检测将点样后的spectrochip芯片使用maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)分析，检测结果使用typer4.0软件(sequenom)分型并输出结果。2.8查看结果根据质谱检测结果分析得到，10例样品中，7例样品中检测到了家族性地中海热相关的致病性突变，其他3例样品未得到阳性结果。具体结果如表5所示。表5样品检测结果2.9结果验证我们采用wes方法对7例阳性样品和3例阴性样品进行试验。wes方法检测结果与本发明实施例的检测方法所得结果一致性为90％。验证结果如表6所示。表6验证结果以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>苏州恩科金生物科技有限公司<120>检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法<130>2019<160>81<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgtgaggtcttcagat16<210>2<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gagaatgttgcgggt15<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gcaataaggtgtctccaa18<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4acactgcgggcggtctc17<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tgacatcagcctttgtt17<210>6<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gccgcagggcttgcc15<210>7<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7attgacttgcatccc15<210>8<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aggcaggaacctcccaa17<210>9<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ttgtggttgatgctg15<210>10<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gaaaatagcatgctct16<210>11<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ctggcagaaggcatt15<210>12<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cagccaggggaaata15<210>13<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggtgacagcgcatgag16<210>14<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tgggtgtttgacacag16<210>15<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15ccaccaaggacgcca15<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16gcatcttcagcgtctgtt18<210>17<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17agtgaagaaccctgt15<210>18<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18ggggcaggaccaggt15<210>19<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19ggcgcccccaagatc15<210>20<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20agcaagctgggagag15<210>21<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21ggcggcagcccatcc15<210>22<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22tgggcatcactcctgg16<210>23<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23cttgcacctgattca15<210>24<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24ggagctgagtcattga16<210>25<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25gtctatgcgcgtcatac17<210>26<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26gccatgcgcatgtctgct18<210>27<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27cccccaggcaaccca15<210>28<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28cccacctggcagatg15<210>29<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29cccagaggcgctggg15<210>30<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30agcaggaggcctgga15<210>31<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31tgggtggctgccctg15<210>32<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32caggggctgacagcag16<210>33<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33ggctgcttttcgcag15<210>34<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34tggcggcacaccaaat16<210>35<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gacagctgcaggagat16<210>36<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36cctgcaagcgccagc15<210>37<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37aaggtctggggagcct16<210>38<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gtgaaccttctcatc15<210>39<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39aagaggggcagcccc15<210>40<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40tggcagggcaggagg15<210>41<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41cgcggcgcctgccgc15<210>42<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gctgcattcaggcac15<210>43<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43gccagcctggtgctg15<210>44<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44caggttgttgacacag16<210>45<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45gtcttatatgtggctc16<210>46<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46tggagtggaagccac15<210>47<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47gcagaaagcgcacaca16<210>48<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48gaagaccatggagtg15<210>49<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49gtgccagagctcatc15<210>50<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50attggcaatggcatc15<210>51<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51acagcaggcgccacca16<210>52<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52ccaaggagccgctctt16<210>53<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53ataggcgctcttggactt18<210>54<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54ctcgcaggccccaag15<210>55<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>55gtgtggctgaagaat15<210>56<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>56acacaactgaccattg16<210>57<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>57ctgcaacctgtcatgc16<210>58<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>58aagatccacctggac15<210>59<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>59tggagctctccattctt17<210>60<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>60ggccccagccaggcc15<210>61<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>61aagctgctgtgtgag15<210>62<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>62agggggcagagaaggc16<210>63<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>63caacctcacagctcata17<210>64<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>64gactcctgcacagcat16<210>65<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>65aggcc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