一种蜂胶蛋白肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于蛋白肽制备领域，更具体地，涉及一种蜂胶蛋白肽及其制备方法和应用。

背景技术：

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢和树干处采集的树脂，然后混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等物质形成的一种具有芳香气味的粘性胶状固形物。一群蜜蜂一年内只能生产100-150g蜂胶，因而蜂胶也被誉为“紫色黄金”。蜂胶具有极其复杂的成分，目前已鉴定出300多种物质，包括黄酮类、萜烯类、芳香酸。

此外，蜂胶还具有广泛的生物学活性和药理活性，如抗氧化、清除自由基、消炎、促进伤口愈合、保护肝脏、保护受损心肌、降低血糖、提高人体免疫力及降低肿瘤发生风险等，因此被广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。蜂胶能消除更年期各种症状；调节月经，使周期正常；改善血液循环状态。

发明人经研究发现，通过改善制备工艺及不同的酶解参数所得蜂胶蛋白肽可应用于制备防治痛经及缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种蜂胶蛋白肽及其制备方法，该蜂胶蛋白肽活性高、易于被人体吸收，且具有防治痛经及缓解女性经期不适的功能，并且制备方法生产流程简单。

本发明的第一方面提供一种蜂胶蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)取蜂胶粉5-10g，葡萄糖0-3g，优选为0.5-3g，加50-150ml水，调节初始ph至6-8，在110-130℃灭菌15-30min，接入体积分数2-5％液体菌种，30-50℃，180-300r/min摇床振荡培养20-60h，得到蜂胶发酵胶质；

(2)将蜂胶发酵胶质置于酶解罐中，当物料的温度达到50-65℃，加入蛋白酶酶解，加酶量为10.0-12.0ku/g，蛋白酶的用量为干燥蜂胶粉质量的0.5％-5％，搅拌酶解时间为2-4小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥，即得所述蜂胶蛋白肽。

根据本发明，优选地，步骤(1)所述液体菌种为纳豆菌。

根据本发明，优选地，步骤(1)所述液体菌种发酵温度为36-37℃，最优选为36.9℃，发酵时间为20-24h，最优选为20-21h，发酵ph为7-7.5，最优选为7.3。

根据本发明，优选地，步骤(1)所述液体菌种发酵接种量为2.5-3.5％，最优选为3％。

根据本发明，优选地，步骤(2)所述酶解所用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶中的任意一种或两到三种复合酶，复合酶中的各单酶质量占总酶量的百分比范围为0％-90％，优选为低于40％，且复合酶中的各酶质量占总酶量的百分比之和为100％。

根据本发明，优选地，步骤(2)所述蛋白酶加酶量为10.5-11.5ku/g，最优选为11.0ku/g。

根据本发明，优选地，步骤(2)中所述蛋白酶水解ph为10-11，最优选为10.5，所述蛋白酶水解温度为61-63℃，最优选为62℃，所述蛋白酶水解时间2.5-3.5h，最优选为3h。

本发明的第二方面提供由上述制备方法制得的蜂胶蛋白肽。

本发明的第三方面提供所述蜂胶蛋白肽在制备防治痛经及缓解女性经期不适的保健食品、食品或药品中的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明的制备方法中，本发明的方法水解蜂胶蛋白制备低分子蛋白肽得率可达到52％以上，在发酵温度为36.9℃，发酵ph为7.3，接种量为3％，发酵时间为21.7h，同时加酶量为11.0ku/g、水解ph10.5、水解温度为62℃、水解时间3.0h，该条件下制备低分子蛋白肽得率最高，可达到57％以上。

2、本发明所制得的蜂胶蛋白肽具有防治痛经及缓解女性经期不适的功能，且效果显著，可应用于防治痛经及缓解女性经期不适的食品、保健食品、药品中。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了发酵时间对蛋白水解度的影响。

图2示出了ph对蛋白质水解度的影响。

图3示出了发酵温度对蛋白质水解度的影响。

图4示出了接种量对蛋白质水解度的影响。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1

本实施例提供一种蜂胶蛋白肽及其制备方法，包括如下步骤：

(1)取蜂胶粉5g，葡萄糖0.5g，加50ml水，调节初始ph6，在110℃灭菌15min，接入体积分数2％液体菌种，30℃，1800r/min摇床振荡培养20h；

(2)然后将蜂胶发酵胶质置于酶解罐中；当物料的温度达到50℃，加入蛋白酶酶解，加酶量为10.0ku/g，蛋白酶的用量为干燥蜂胶粉质量的0.5％，搅拌酶解时间为2小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为85℃，灭酶时间10分钟；灭酶后酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥即得。

步骤(2)所述酶解所用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶三种复合酶，复合酶中的各单酶质量占总酶量的百分比范围为40％，且复合酶中的各酶质量占总酶量的百分比之和为100％。

该实施例中，蜂胶蛋白肽得率为53.5％。

实施例2

本实施例提供一种蜂胶蛋白肽及其制备方法，包括如下步骤：

(1)取蜂胶粉8g，葡萄糖2g，加100ml水，调节初始ph7.3，在120℃灭菌20min，接入体积分数3％液体菌种，36.9℃，240r/min摇床振荡培养21.7h；

(2)然后将蜂胶发酵胶质置于酶解罐中；当物料的温度达到62℃，加入蛋白酶酶解，加酶量为11.0ku/g，蛋白酶的用量为干燥蜂胶粉质量的1％，搅拌酶解时间为3小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间20分钟；灭酶后酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥即得。

步骤(2)所述酶解所用蛋白酶选自木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的复合酶，复合酶中的各单酶质量占总酶量的百分比范围为35％，且复合酶中的各酶质量占总酶量的百分比之和为100％。

该实施例中，蜂胶蛋白肽得率为57.7％。

实施例3

本实施例提供一种蜂胶蛋白肽及其制备方法，包括如下步骤：

(1)取蜂胶粉10g，葡萄糖3g，加150ml水，调节初始ph8，在130℃灭菌30min，接入体积分数5％液体菌种，50℃，300r/min摇床振荡培养32h；

(2)然后将蜂胶发酵胶质置于酶解罐中；当物料的温度达到65℃，加入蛋白酶酶解，加酶量为12.0ku/g，蛋白酶的用量为干燥蜂胶粉质量的2％，搅拌酶解时间为4小时，酶解后升温灭酶，灭酶温度为95℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却至室温后，取酶解液经过滤、浓缩、干燥即得。

步骤(2)所述酶解所用蛋白酶选自胃蛋白酶和碱性蛋白酶的复合酶，复合酶中的各单酶质量占总酶量的百分比范围为45％，且复合酶中的各酶质量占总酶量的百分比之和为100％。

该实施例中，蜂胶蛋白肽得率为52.3％。

测试例

1、材料与试剂

蜂胶经脱脂后得到的干粉；纳豆菌，武汉轻工大学实验室保藏菌种。

试剂：三氯乙酸、无水乙醇、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠均为分析纯。

2、试验方法

总蛋白含量测定采用凯氏定氮法；

低分子肽质量分数测定方法采用双缩脲法；

肽得率的测定采用三氯乙酸(tca)沉淀法，并结合福林-酚法测定；

蜂胶蛋白水解度＝蜂胶蛋白的分子肽质量浓度/蜂胶蛋白质量浓度×100％。

3、单因素试验

(1)发酵时间对蛋白水解度的影响：取蜂胶粉5g，葡萄糖0.5g，加50ml水，调节初始ph7.5，121℃灭菌25min，接入体积分数为3％液体菌种，37℃，180r/min摇床振荡培养40h。每8h取样，测定蜂胶蛋白肽质量浓度，比较纳豆菌在不同培养时间水解蜂胶蛋白生成蛋白肽的量。

由图1可以看出，生成蜂胶蛋白肽的量，在随着发酵时间的增加蛋白质的水解度显著增大，在21.7h时到达峰值，之后水解度略微降低，可能是由于纳豆菌进一步将蛋白肽分解成氨基酸所造成的。由此可以确定，发酵时间为21.7h，此时生成的蛋白肽的量最大。

(2)ph对蛋白质水解度的影响：取干燥蜂胶粉5g，葡萄糖0.5g，加50ml水，调节初始ph分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，121℃灭菌25min，接入体积分数为3％液体菌种，37℃，180r/min摇床振荡培养40h。取样，测定蜂胶蛋白肽质量浓度，比较纳豆菌在不同ph条件下水解蜂胶蛋白生成蛋白肽的量。

由图2可知，当ph低于7.5时，蛋白质水解度随着ph增大而增大，当ph高于7.5时蛋白质水解的又逐渐减小，只有ph在7.5时蛋白质水解度相对最大，由此可知纳豆菌在ph7.3时最活跃，此时更有利于纳豆菌水解蛋白质。

(3)发酵温度对蛋白质水解度的影响：取干燥蜂胶粉5g，葡萄糖0.5g，加50ml水，调节初始ph7.5，121℃灭菌25min，接入体积分数为3％的液体菌种，分别放入24℃，30℃，36℃，42℃，48℃恒温培养振荡器中，180r/min振荡培养24h。取样，测定蜂胶蛋白肽质量浓度，比较纳豆菌在不同温度条件下水解蜂胶蛋白生成蛋白肽的量。

由图3可知在发酵温度为36.9℃时蛋白质水解度相对最大。

(4)接种量对蛋白质水解度的影响：取干燥蜂胶粉5g，葡萄糖0.5g，加50ml水，调节初始ph7.5，121℃灭菌25min，顺次接入体积分数为1％，2％，3％，4％，5％液体菌种，37℃，180r/min摇床振荡培养40h。取样，测定蜂胶蛋白肽质量浓度，比较不同接种量对蜂胶蛋白肽生成量的影响。

由图4可知，接种量体积分数为3％时更有利于纳豆菌发酵产低分子蜂胶蛋白肽。因为当接种量过少，在短时间内菌体浓度也较低，菌体分泌蛋白酶量较少，故使得蜂胶蛋白水解度低；而过大的接种量，菌体繁殖过快，满足菌体自身生长和繁殖需要的养分不足，降解的低分子肽被菌体吸收利用，使得蛋白水解度较低。

由上述实验结果可以得出：本发明的方法水解蜂胶蛋白制备低分子蛋白肽得率可达到52％以上，在发酵温度为36.9℃，发酵ph为7.3，接种量为3％，发酵时间为21.7h，同时加酶量为11.0ku/g、水解ph10.5、水解温度为62℃、水解时间3.0h，该条件下制备低分子蛋白肽得率最高，可达到57％以上。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。