一种溶磷青霉PSF及其应用的制作方法

本发明涉及微生物肥料
技术领域：
，具体的说是一种溶磷青霉psf菌株，菌株分类命名为青霉penicilliumsp.，及其在提高盐渍化土壤供磷水平方面的应用。
背景技术：
：磷是植物营养中的三大要素之一，又是植物体内有机化合物的重要组成成分，对其生长发育都起着不可忽视的作用。我国有74％的耕地土壤缺磷，土壤中95％磷为无效形式，为了获得高产每年都向土壤反复施加大量可溶性磷肥，然而由于土壤的固定等作用，作物对施入的磷肥当季利用效率只有5％～10％，大部分与土壤中的ca2+、fe2+、fe3+、a13+结合形成难溶性磷酸盐。这不仅造成磷素资源的浪费，而且对水体环境安全构成一定的威胁。因此，如何提高土壤磷的可利用性一直受到国内外研究人员广泛关注。微生物对于土壤中磷元素的转化起着非常重要的作用。国外大量研究证明，土壤中存在某些微生物可将难溶态的磷转化为可溶磷，这类微生物被统称为溶磷微生物。溶磷微生物能够通过酸化、螯合和交换反应等方式将土壤中难溶性的磷酸盐转化为易于被植物吸收利用的水溶性磷，提高了土壤的供磷水平，从而增加作物产量。另外，溶磷微生物还能分泌生长调节物质，促进农作物植物根系对锌、铜等其它营养元素的吸收，增强植物抗病能力，并减少环境污染。我国土地资源丰富，但可利用的土地资源很少，其中各类盐渍化土壤总面积多达9.91×107hm2，开发利用盐碱土壤对我国农业生态系统的可持续发展具有重要意义。近年来虽然有较多的解磷微生物被筛选和鉴定，但大都是一些非耐盐菌，它们在高盐环境下应用潜力有限。盐碱化土壤由于其特殊的理化性质可能会导致传统的非土著解磷菌定殖能力差、竞争力较弱、溶磷能力退化快、菌种淘汰率高等劣势。盐渍化土壤中的土著微生物已经适应了高盐环境，对高盐环境下难溶磷的转化有更好的应用潜力。因此，从盐渍化土壤中筛选土著耐盐解磷菌对于开发微生物肥料，提高盐碱土壤磷素利用率具有重要意义。技术实现要素：本发明为解决上述盐渍化土壤中有效磷缺乏、盐碱化土壤由于其特殊的理化性质可能会导致传统的非土著解磷菌定殖能力差、竞争力较弱、溶磷能力退化快、菌种淘汰率高等问题，提供了一种高耐盐溶磷青霉psf菌株，该菌株对难溶性磷酸盐具有很强的溶解能力，而且能够在高盐浓度下生长，施于盐渍化土壤后，可有效提高土壤中可溶性磷酸盐含量，促进作物的生长的作用。针对上述问题，本发明的目的在于提供一种溶磷青霉psf及其应用，所述溶磷青霉psf的保藏编号为：cgmccno.18558，菌种命名为psf，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，微生物(株)为：青霉属，分类单元为青霉penicilliumsp.，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2019年10月9日。所述溶磷青霉psf的its基因序列长493bp，利用blast软件与genbank的序列进行同源性分析，结果显示溶磷青霉psf与青霉penicilliumsp的同源性最高，其中溶磷青霉psf与桔青霉菌(penicilliumcitrinum)的同源性高达99.3％，结合形态学特征鉴定psf为青霉属(penicilliumsp)即为桔青霉菌(penicilliumcitrinum)。所述的溶磷青霉psf菌株的形态学特征为：在温度为28℃条件下，溶磷青霉psf菌株生长迅速，在pda固体培养基上培养3d后出现灰绿色孢子，分生孢子呈椭圆型或圆形，直径为3μm。所述的溶磷青霉psf菌株的生理生化特征为：适宜的生长温度为15℃-40℃，ph值为4-9,nacl耐受性为0-9％。所述的溶磷青霉psf是从黄河三角洲盐渍化土壤中分离得到，经无机磷培养基pikovskayaagar筛选获得。所述的溶磷青霉psf在溶解磷酸盐和提高盐渍化土壤供磷方面中的应用。所述的溶磷青霉psf在溶解难溶性磷酸盐方面中的应用，该溶磷青霉psf对多种难溶性磷酸盐都有很强的溶解能力，该菌株能够在高盐浓度下生长，施于盐渍化土壤后，可有效提高土壤中可溶性磷酸盐含量，促进作物的生长。所述的磷酸盐为ca5(po4)3oh、alpo4、zn3(po4)2或fepo4中的任意一种。本发明的有益效果为：本发明中的一种溶磷青霉psf及其应用，所述溶磷青霉psf的保藏编号为：cgmccno.18558，菌种命名为psf，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，微生物(株)为：青霉属，分类单元为青霉penicilliumsp.，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2019年10月9日，参照真菌鉴定手册，根据其形态特征、生理生化特征和its序列结果比对分析，利用blast软件与genbank的序列进行同源性分析，结果显示溶磷青霉psf与桔青霉菌(penicilliumcitrinum)的同源性高达99.3％，经多相分类鉴定溶磷青霉psf属于青霉属，命名单元为青霉penicilliumsp.即为桔青霉菌(penicilliumcitrinum)。本发明提供的溶磷青霉psf，对ca5(po4)3oh、alpo4、zn3(po4)2、fepo4等多种难溶性磷酸盐都具有很好的溶解作用，其中以ca5(po4)3oh难溶性磷酸盐为例，将溶磷青霉psf接种到pda固体培养基中培养5～7d后，发酵液中可溶性磷含量由4.7mg/l提高到97.1mg/l，可溶性磷含量增加了19.7倍，同时通过溶磷青霉psf对各种难溶性磷酸盐的溶解试验可知，溶磷青霉psf对四种难溶性磷酸盐都具有很强的溶解能力，其中alpo4磷酸盐的溶磷效果高于ca5(po4)3oh、zn3(po4)2、fepo4，其中溶磷青霉psf对ca5(po4)3oh的溶解能力为97.1mg/l、zn3(po4)2的溶解能力为765.3mg/l、fepo4的溶解能力为854.4mg/l，alpo4的溶解能力为930.6mg/l，由此可知，溶磷青霉psf具有高耐盐特性，在盐渍化土壤中能很好的生长和定殖，促使难溶态磷转化为植物可吸收利用的可溶性磷酸盐，促进植物的生长，可以减少化肥的使用，有良好的应用开发前景。本发明中提供的溶磷青霉psf，具有高耐盐特性，可以耐受9％的盐浓度，可以在盐渍化土壤中很好的生长和定殖，可以有效解决磷缺乏、提高盐碱化土壤中磷定殖能力、溶磷效果快，有良好的应用前景；将psf菌株培养物施于盐渍化土壤后，可有效提高土壤中可溶性磷酸盐含量，促进作物的生长。附图说明图1为溶磷青霉psf菌株的溶磷能力示意图；图2为溶磷青霉对绿豆生根的促进作用(ck为对照组；a为稀释5倍、b为稀释10倍、c为稀释100倍、d为稀释1000倍)；图3为溶磷青霉对促进绿豆生长的作用，其中a为溶磷青霉，b为空白对照。具体实施方式：为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。本发明提供的溶磷青霉psf，所述溶磷青霉psf的保藏编号为：cgmccno.18558，菌种命名为psf，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，微生物(株)为：青霉属，分类单元为青霉penicilliumsp.，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2019年10月9日，参照真菌鉴定手册，根据其形态特征和生理生化特征，以及its序列结果比对分析，经多相分类鉴定溶磷青霉psf属于青霉属即青霉属，命名为青霉penicilliumsp.；所述真菌总dna提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；所述的dna纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；所述pvk无机磷固体培养基的组分为：葡萄糖10g，ca3(po4)25g，(nh4)2so40.5g，nacl0.2g，kcl0.2g，mgso4·7h2o0.1g,酵母提取物0.5g,mnso4·h2o0.002g，feso4·7h2o,0.002g，蒸馏水1000ml，琼脂20g；制备方法：在蒸馏水中加入葡萄糖、ca3(po4)2、(nh4)2so4、nacl、kcl、mgso4·7h2o、酵母提取物、mnso4·h2o、feso4·7h2o、琼脂，加热搅拌均匀，调节ph值为7.0，制得pvk无机磷固体培养基；所述pvk无机磷液体培养基，pvk无机磷液体培养基与pvk无机磷固体培养基相比缺少琼脂20g，其他组分均相同；pda固体培养基：土豆200g，蔗糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；制备方法：将土豆去皮切成小块放入锅中，加水煮沸30min后，用纱布趁热过滤，滤液补足水后，加入蔗糖、酵母粉，121℃灭菌30min，制得pda固体培养基；pvk液体培养基：葡萄糖10g，ca3(po4)25g，(nh4)2so40.5g，nacl0.2g，kcl0.2g，mgso4·7h2o0.1g,酵母提取物0.5g,mnso4·h2o0.002g，feso4·7h2o,0.002g，蒸馏水1000ml。实施例1本发明提供的一种溶磷青霉psf1.菌株的来源样本来源于黄河三角洲盐渍化土壤；选取自黄河三角洲盐渍化土壤，称取10g土壤样品置于90ml无菌水中，以转速为3000转/分钟震荡3分钟，制成土壤悬液；2.菌株的分离将土壤悬液按10倍梯度稀释，然后分别吸取10-4、10-5、10-6三个梯度的土壤悬夜200μl，分别涂布在pvk无机磷固体培养基上，然后将接种后的pvk无机磷固体培养基倒置于生化培养箱中，28℃、培养7d，采用透明圈法共筛选出溶磷真菌15株，其中菌株编号为psf溶磷解能力最强，其在pvk固体培养基上形成的溶磷圈(28℃培养3天，见图1)的直径为2.47cm，将溶磷菌株psf经8次传代后溶磷水平稳定，且生长繁殖速度快，故进选定做进一步研究，命名为psf；3.菌株的形态特征和生理生化特征按体积比为1％的接种量，将分离菌株psf接种于pda固体培养基，28℃恒温培养，观察其菌丝蔓延情况以及菌落特征，分别在第1d、2d、3d、4d，利用湿室培养法培养菌丝观察菌丝的生长情况(即从湿室中取出载玻片至于显微镜下观察菌丝的生长情况)；具体操作步骤为：以pda固体培养基作为基础培养基，在pda固体培养基中加入不同浓度含量的nacl，其中nacl的浓度分别为1％、3％、5％、7％、9％、11％，按体积比为1％的接种量，将分离菌株分别接种到含有不同浓度的nacl的pda固体培养基中，待pda固体培养基中长满真菌菌丝，用无菌打孔器在长满真菌菌丝的pda固体培养基上打孔，然后用镊子夹取琼脂片倒扣在耐盐实验用培养基平板的中心位置，28℃恒温培养，分别观察培养至第1d、第2d、第3d、第4d、第5d时的菌落菌丝，并记录菌丝在不同浓度的nacl的pda固体培养基上的生长情况；结果显示，在温度为28℃条件下，溶磷青霉psf菌株生长迅速，在pda固体培养基上培养3d后出现灰绿色孢子，分生孢子呈椭圆型或圆形，直径为3μm；溶磷青霉psf菌株在nacl含量为0～5％的pda固体培养基上生长良好，其中在含盐量为3％时生长最好，5d的菌落直径为4.7cm。当nacl含量高于5％时，菌株生长受到抑制；盐含量为9％时，菌落几乎没有蔓延和生长，说明真菌最高可耐受9％的盐浓度；4.菌株its基因的pcr扩增和序列测定1)选取通用引物：上游引物为its1:5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′；下游引物为its4:5′-tcctccgcttattgatatgc-3′1)按体积比为1％的接种量，将分离菌株psf接种于pda固体培养基，28℃恒温培养5天，取菌丝颜色呈青绿色的菌丝，将菌丝放入研钵中用液氮研磨，将研磨好的菌丝体采用真菌总dna提取试剂盒提取其基因组dna，利用真菌its序列的pcr通用引物进行pcr扩增；pcr扩增程序为:94℃预热5min；94℃变性1min,57℃退火45s,72℃延伸45s,共35个循环；72℃延伸10min，得到pcr产物；将pcr产物经过dna纯化试剂盒纯化后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过测序得到its序列全长为493bp；经过blast比对分析，进行同源性比对，发现该菌与桔青霉菌(penicilliumcitrinum)即青霉(penicilliumsp.)的its序列同源性最高，属于青霉(penicilliumsp.)属即为桔青霉菌属(penicilliumcitrinum)。该菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：cgmccno.18558，微生物(株)为：青霉属，菌株的分类单元为：青霉penicilliumsp.，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2019年10月9日，菌种命名为psf。实施例2溶磷青霉psf对各种难溶性磷酸盐的溶解作用本菌株主要是针对四种难溶性磷酸盐即ca5(po4)3oh、alpo4、zn3(po4)2和fepo4的溶磷作用；溶磷青霉psf菌悬液的制备：按体积分数比，在1份溶磷青霉psf中加入5份pbs缓冲液，混合均匀，制得溶磷青霉psf菌悬液，备用；分别利用溶磷青霉psf对ca5(po4)3oh、alpo4、zn3(po4)2、fepo4的溶解情况，以制备ca5(po4)3oh磷酸盐检测液为例：在150ml锥形瓶中加入50mlpvk液体培养基、0.5gca5(po4)3oh、500μl溶磷青霉psf菌悬液，温度为28℃条件下，以转速为200r/min摇床培养5～7d，制得ca5(po4)3oh磷酸盐检测液；根据ca5(po4)3oh磷酸盐检测液的制备方法，依次制备alpo4磷酸盐检测液、zn3(po4)2磷酸盐检测液、fepo4磷酸盐检测液，以及空白对照组，其中空白对照组中将溶磷青霉psf菌悬液替换为无菌生理盐水；测定各难溶性磷酸盐检测液种的磷含量，结果见表1；表1溶磷青霉psf对4种难溶磷酸盐的溶解能力(mg/l)ca5(po4)3ohzn3(po4)2alpo4fepo4空白对照组4.718.921.119.7接种psf97.1765.3930.6854.4通过表1可知：溶磷青霉psf对四种难溶性磷酸盐都具有很强的溶解能力，其中alpo4磷酸盐的溶磷效果高于ca5(po4)3oh、zn3(po4)2、fepo4，同时远远高于对照组，其中溶磷青霉psf对ca5(po4)3oh的溶解能力为97.1mg/l、zn3(po4)2的溶解能力为765.3mg/l、fepo4的溶解能力为854.4mg/l，alpo4的溶解能力为930.6mg/l。实施例3溶磷青霉psf的发酵培养液的制备将溶磷青霉psf接种在pda培养基上，28℃条件下培养3d，用打孔法接种直径为7mm含有psf菌丝的琼脂块置于pvk液体培养基中，温度为28℃，摇床转速为180rpm，摇瓶发酵96小时，制得溶磷青霉psf发酵培养液，备用。实施例4溶磷青霉psf的发酵培养液对绿豆幼苗根系生长的促进作用菌液选用实施例3中制备的溶磷青霉psf发酵培养液，备用；取溶磷青霉psf发酵培养液，离心，取上清夜，将上清夜分别按5倍、10倍、100倍、1000倍进行稀释，制得5倍的溶磷青霉psf发酵稀释液、10倍的溶磷青霉psf发酵稀释液、100倍的溶磷青霉psf发酵稀释液、1000倍的溶磷青霉psf发酵稀释液，同时以蒸馏水做为对照组；以5倍的溶磷青霉psf发酵稀释液为例做5倍溶磷青霉psf的绿豆栽培苗，观察溶磷青霉psf对绿豆幼苗的生根情况：在10ml的试管中加入5倍的溶磷青霉psf发酵稀释液9ml，用封口膜将试管的口部封口，同时用牛皮纸包裹整个试管的四周，在试管口的牛皮纸和封口膜中间位置打孔，载入绿豆幼苗，每管一棵，培养7天，设置四个重复，制得5倍溶磷青霉psf的绿豆栽培苗；根据5倍溶磷青霉psf的绿豆栽培苗的栽培方法，依次栽培10倍溶磷青霉psf的绿豆栽培苗、100倍溶磷青霉psf的绿豆栽培苗、100倍溶磷青霉psf的绿豆栽培苗和对照组的绿豆苗栽培苗，每组设置四个重复，记录每组绿豆栽培苗根系的生长情况，结果见图2、表2：表2溶磷青霉psf对绿豆幼苗根生长的促进作用通过图2、表2可知，溶磷青霉psf可以有效促进绿豆幼苗的根部生长，其中稀释100倍时效果最好，重复根芽数最高可达21个。实施例5：溶磷青霉psf对绿豆生长情况的影响。土壤选取：选取黄河三角洲地区中度盐渍化土壤；菌液选用实施例3中制备的溶磷青霉psf发酵培养液，备用；试验步骤：试验在光照培养箱中进行，按每5g土壤中加入1ml的菌液，在每个培养皿内加入15g中度盐渍化土壤、3ml溶磷青霉psf的发酵培养液，对照组加入3ml经高温灭菌后psf发酵培养液，播种绿豆，撒种前浇水至土壤中的含水量25％，绿豆在生长期间每隔1天浇水一次，保持土壤中的含水量为25％，观察绿豆培养半个月的情况，结果见图3；通过图3可知，盐渍化土壤对绿豆生长有很强的抑制作用(见图3b)，但是施用本申请中的溶磷青霉psf后可以很好的促进绿豆的生长(见图3a)。sequencelisting<110>滨州学院<120>一种溶磷青霉psf及其应用<130>2019<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>493<212>dna<213>青霉penicilliumsp.<400>1tttcgtatgaggcctaaggatcattacccagtgcgggcccatcggggcccagcctcccac60cggtgttgcccgaacctatgttgcctcggcgggccccgcgcccgccgacggcccccctga120acgctgtctgaagttgcagtctgagacctataacgaaattagttaaaactttcaacaacg180gatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattg240cagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggg300gcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggctctcgcc360ccccgcttccggggggcgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcg420tatggggcttcgtcacccgctctagtaggcccggccggcgcccgccggcagcatatcaat480aagcggaggaaaa493<210>2<211>18<212>dna<213>人工合成<400>2ccgtaggtgaacctgcgg18<210>3<211>20<212>dna<213>人工合成<400>3tcctccgcttattgatatgc20当前第1页1 2 3