一种磁珠纯化高活性效应型T细胞方法与流程

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种磁珠纯化高活性效应型t细胞方法。

背景技术：

从生物体内获取原代细胞，我们通常得到的是多种细胞混合的细胞群，为了获得目的细胞，我们需要使用分选方法纯化。现在常用的分选方法一般有两种：流式分选和磁珠分选。流式分选是将单细胞悬液放入高压压入充满鞘液流动室内，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出，喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中，再充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。而磁珠分选是常用的仪器中细胞分离技术，通常使用生物素化抗体标记特定的细胞，再和链霉亲合素蛋白包被的磁珠结合，通过外加磁体形成磁场，磁珠会使被标记的细胞滞留在磁场中，而未通过结合生物素化抗体与磁珠相连接的细胞则不会在磁场中停留，使某个特定标志物是否表达的两类细胞得以分离。磁珠纯化法通常使用纯化系统通过磁场分离磁珠而达到分离和纯化细胞、蛋白或核酸等物质的目的，它与流式分选相比，磁珠纯化法具有提取效率高、分离速度快、所需设备简单等特点。它能把细胞用超级顺磁性的macsmicrobeads（macs微型磁珠）特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞通过一个放在强而稳定磁场中的分选柱，分选柱里的基质造成一个高梯度磁场，被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出，当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以获得标记和未标记的两个细胞组份。但是由于磁珠分选多为成品试剂盒，对特定细胞的分离有着多样的限制，而且一般一次只能分离一种细胞，而市面上只有针对小鼠记忆性cd8+t细胞（cd8+tm）的试剂盒，无法再进一步分离获得小鼠效应记忆性cd8+t细胞（cd8+tem）和中央记忆性cd8+t细胞（cd8+tcm），因此，采用一种合理的细胞纯化方法，是本领域技术人员亟待解决的难题。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供磁珠纯化高活性效应型t细胞方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的一种磁珠纯化高活性效应型t细胞方法，包括以下步骤：

1）构建诱导记忆性t细胞模型。

2）提取细胞混悬液。

3）免疫磁珠法分离、纯化cd8+tna细胞。

4）二次磁性分选法分离、纯化cd8+tem细胞、cd8+tcm细胞。

5）采用流式细胞术验证分离后各组分cd8+t细胞的纯度。

以上所述步骤1）～5）中，将从细胞组织中提取纯度高的记忆性cd8+t细胞cd8+tem样品。

以上所述步骤1）～5）中，将从细胞组织中提取纯度高的中央记忆性cd8+t细胞cd8+tcm样品。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

1.分选纯度高。细胞的分离有着多样的限制，而且一般一次只能分离一种细胞，而本磁珠纯化高活性效应型t细胞技术，分离获得的目的细胞具有分选纯度高的特点，本方法可以在利用成品试剂盒的基础上，加入其他试剂进行二次分选，可以获得纯度很高的小鼠效应记忆性cd8⁺t细胞（cd8⁺tem）和中央记忆性cd8⁺t细胞（cd8⁺tcm）样品，并进行后续所需实验。

2.回收率高。采用本发明的分选方法，具有细胞存活率高，回收率高等特点，因为不需要实验室拥有带分选功能的流式，应用更加广泛，而且分离的细胞可立即用于后续试验，例如流式细胞术，细胞培养和基于细胞的各类实验，简单方便，节约实验时间，提高工作效率。

3.操作简单。本磁珠纯化高活性效应型t细胞方法，相较于流式分选，具有操作相对简单流程化，对操作者要求较低，而且使用孵育的时间较短，操作过程大大加快。

附图说明

图1是成功构建小鼠皮肤移植模型。

图2是分选后的cd8⁺tna（cd8⁺cd44^-cd62l⁺）流式验证。

图3分选后的cd8⁺tcm（cd8⁺cd44⁺cd62l⁺）流式验证。

图4分选后的cd8⁺tem（cd8⁺cd44⁺cd62l^-）流式验证。

具体实施方式

下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例

本发明的磁珠纯化高活性效应型t细胞方法，包括以下步骤：

1.使用的材料

1）本实施例采用受体小鼠：balb/c小鼠，spf级，健康，雌性，体重平均18～22g。来自北京维通利华实验动物技术有限公司；

2）本实施例采用供体小鼠：c57bl/6小鼠，spf级，健康，雌性，体重平均18～22g。来自北京维通利华实验动物技术有限公司；

3）本实验采用的cd62l生物素结合抗体，来自ebioscience；

4）本实验选用的easysep™mousecd8+tcellisolationkit，来自stemcell；

5）选用的easysep™mousenaivecd8+tcellisolationkit，来自stemcell；

6）磁珠分选专用14ml分选管，来自stemcell；

7）磁珠分选用磁力架，来自stemcell；

8）cd44（fitc）流式抗体，来自bdbiosciences；

9）cd62l（pe）流式抗体，来自bdbiosciences；

10）cd8（pe-cy5）流式抗体，来自bdbiosciences；

11）选用的流式细胞仪，来自beckmancoulter；

2.实验分组

效应记忆性cd8+t细胞（effectormemorycd8+tcells,cd8+tem）组，接受首次皮肤移植三个月后接受再次皮肤移植，再饲养三天。

中央记忆性cd8+t细胞（centralmemorycd8+tcells,cd8+tcm）组，接受首次皮肤移植清洁饲养三个月。

初始性cd8+t细胞（naïvecd8+tcells,cd8+tna）组，同环境饲养三个月。

3.构建诱导记忆性t细胞小鼠皮肤移植模型

1)高压蒸汽灭菌法消毒手术器械及相关物品，手术场所消毒；

2)每只受体小鼠分别编号，测量体重，记录相关信息；

3)准备好消毒用的75%酒精棉球以及放置供体皮肤的生理盐水容器；

4)颈椎脱臼法处死皮肤供体c57bl/6小鼠，背部朝上固定在手术板上，75%酒精棉球消毒背部，剪下小鼠背部大部分皮肤置于放有生理盐水的容器中，将其修剪成数个大小约1cm×1cm圆形皮片；

5)腹腔注射麻醉受体balb/c小鼠。用75%酒精棉球消毒小鼠一侧腹部皮肤，注入0.7％戊巴比妥钠生理盐水溶液，用量0.1ml/10g体重，退针后75%酒精棉球消毒；

6)小鼠充分麻醉后，背部朝上固定在手术板上，手术区域备皮，背部约3cm×3cm大小，75％酒精棉球消毒三遍；

7)剪下1cm×1cm大小的皮片；

8)取供体c57bl/6小鼠背部皮片一片，使用间断缝合方法固定到受体balb/c小鼠背部皮肤缺损处；

9)缝合牢固后，75％酒精棉球消毒三次，不用包扎处理；

10)术后密切观察其状态，观察移植皮片的生长情况并拍照记录。

4.提取小鼠脾脏细胞混悬液

1)高压蒸汽灭菌法消毒手术器械及相关物品，手术场所消毒；

2)受体小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精中消毒5min；

3)准备装有适量pbs的容器；

4)将小鼠摆成右侧卧位固定在手术板上，剪开其左侧腹背部皮肤，充分暴露脾脏；

5)剪开皮下组织，将脾脏游离下来，放入pbs中；

6)取1ml注射器，将针头弯折约90°，固定住脾脏后，刺破包膜，刮出脾脏组织；

7)充分吹打混合脾脏组织与pbs，至脾脏细胞呈混悬液状态，转移至离心管中；

8)室温1200rpm，离心6min，弃上清液，靠干多余液体；

9)加入1ml红细胞裂解液，混匀细胞后室温孵育5min；

10)加入20mlpbs充分混匀后使用200目滤器过滤至另一离心管；

11)室温1200rpm，离心6min，弃上清液，靠干多余液体，加入pbs重悬后再离心重复两次；

12)计数后细胞。

5.免疫磁珠法分离、纯化cd8+tna细胞

1)取上一步获得的细胞悬液；

2)准备stemcelleasysep™mousenaivecd8+tcellisolationkit和分选液（含有2％胎牛血清（fbs）的pbs）；

3)离心弃上清后使用分选液将细胞浓度调整至1×108cells/ml；

4)加入大鼠血清50μl/ml；

5)将样品转移至分选管中；

6)加入isolationcocktail50μl/ml，轻吹混匀后室温孵育10min；

7)rapidspheres™（即磁珠混悬液）预先涡旋30s使其充分混匀；

8)加入rapidspheres™（即磁珠混悬液）100μl/ml，轻吹混匀后室温孵育5min；

9)使用分选液补充液体体积：如果样品体积小于等于4ml则补充体积至5ml；如果样品体积大于4ml则补充体积至10ml；

10)将分选管插入磁力架中，室温孵育5min；

11)直接倒出管中清液至离心管中，可得到初始性cd8+t细胞（naïvecd8+tcells,cd8+tna）悬液。

6.二次磁性分选法分离、纯化cd8+tem细胞、cd8+tcm细胞

1)取步骤3.3获得的细胞悬液；

2)准备cd62l生物素结合抗体、stemcelleasysep™mousecd8+tcellisolationkit和分选液（含有2％胎牛血清（fbs）的pbs）；

3)离心弃上清后使用分选液将细胞浓度调整至1×108cells/ml；

4)加入大鼠血清50μl/ml；

5)样品转移至分选管中；

6)加入isolationcocktail50μl/ml，轻吹混匀后室温孵育10min；

7)rapidspheres™（即磁珠混悬液）预先涡旋30s使其充分混匀；

8)加入rapidspheres™（即磁珠混悬液）125μl/ml，轻吹混匀后室温孵育5min；

9)使用分选液补足液体体积：如果样品体积小于等于4ml则补充体积至5ml；如果样品体积大于4ml则补充体积至10ml；

10)将分选管插入磁力架中，室温孵育2.5min；

11)直接倒出管中清液至另一分选管中；

12)加入cd62l生物素结合抗体0.5μl/ml，轻吹混匀后室温孵育10min；

13)rapidspheres™（即磁珠混悬液）预先涡旋30s使其充分混匀；

14)加入rapidspheres™（即磁珠混悬液）125μl/ml，轻吹混匀后室温孵育5min；

15)将分选管插入磁力架中，室温孵育2.5min；

16)直接倒出管中清液至离心管中，清液即为中央记忆性cd8+t细胞（centralmemorycd8+tcells,cd8+tcm）悬液，取出分选管，使用分选液重悬带有磁珠的细胞，所得悬液即为中央记忆性cd8+t细胞（centralmemorycd8+tcells,cd8+tcm）悬液。

7.流式细胞术验证分离后各组分cd8+t细胞的纯度

1)取分选后的各组cd8+t细胞，用pbs重悬调整浓度为1×107cells/ml，每组分空白、cd8单染、cd44单染、cd62l单染、三染五管，各取100μl细胞悬液于流式管中；

2)各管分别加入流式抗体，cd8（pe-cy5）用量每管2.5μl，cd44（fitc）用量每管1μl，cd62l（pe）用量每管2.5μl。混匀后4°c避光孵育30min；

3)加入1mlpbs吹打混匀后，室温1200rpm离心6min，弃上清，靠干多余液体，然后重复洗涤2次；

4)加入500μlpbs重悬细胞，充分混匀后上机检测；

5)用空白管细胞调节电压；

6)pe-cy5、fitc、pe各通道的单染细胞调节荧光补偿信号；

7)各组细胞指标：cd8+tna细胞：cd8+cd44-cd62l+；cd8+tcm细胞：cd8+cd44+cd62l+；cd8+tem细胞：cd8+cd44+cd62l-。

本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。