一种用于治疗急性肝衰竭的间充质干细胞的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于治疗急性肝衰竭的间充质干细胞的制备方法。

背景技术：

急性肝衰竭(alf)是短期内大量肝细胞坏死或功能失调引起的以肝功能失代偿、凝血功能障碍等为特征的临床综合征。尽管随着医学诊疗技术的发展，急性肝衰竭的生存率有了显著的提高，但其死亡率仍高达40％-62.2％。

原位肝移植是目前急性肝衰竭最有效的治疗方法，但供体匮乏、免疫排斥等原因严重限制了其在临床中的广泛应用。肝细胞移植能够较快地发挥合成、解毒和促进胆红素排泄等作用，可部分解决肝脏供体短缺的问题，但是由于移植成活率低、移植细胞的选择性增殖等原因使其难以实现临床突破。因此寻求新的急性肝衰竭治疗方案是当今社会亟需解决的问题，近年来干细胞在临床应用中的研究进展为急性肝衰竭的治疗提供了新的希望。

间充质干细胞(mscs)是一种具有不断自我更新、多向分化及低免疫原性特征的成体干细胞，另外，它还具有抗炎、抗凋亡、促细胞增殖以及免疫调节等特性，因此被广泛应用于包括急性肝衰竭在内的多种疾病的治疗研究。

在对乙酰氨基酚引起的急性肝衰竭模型中，静脉应用间充质干细胞能有效提高模型小鼠的生存率、改善肝功能、改善肝细胞死亡、促进肝再生并增强肝脏的抗氧化能力。另外，间充质干细胞的良好抗急性肝衰竭疗效在应用刀豆蛋白a、四氯化碳、半乳糖胺等构建的急性肝衰竭模型中也得到了充分的证实。间充质干细胞依赖疾病微环境分泌的各种细胞因子所发挥的代谢及功能的支持作用是其发挥治疗潜能的关键，且旁分泌是一种重要的机制。但静脉应用的间充质干细胞绝大多数被局限于肺内，能够被募集到受损部位的细胞数目极其有限。因此，提高间充质干细胞向受损部位的归巢能力可能成为提高其治疗能力的重要措施。

在体内应用前，通过各种预处理方案可显著提高间充质干细胞的迁移能力及疗效。wang等证实，通过基因修饰过表达c-met能够显著提高间充质干细胞向受损肝脏的归巢及急性肝衰竭治疗能力。但基因工程的安全性问题，以及肝损伤血清有效成分浓度的不可控性，严重限制了上述预处理方案的临床应用。

针对上述问题，我们需要提供用于治疗急性肝衰竭的间充质干细胞，这是我们亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于治疗急性肝衰竭的间充质干细胞的制备方法，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种il-1β预处理的间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)骨髓间充质干细胞的分离；

2)传代培养，得到传代间充质干细胞；

3)选取传代间充质干细胞，应用含有il-1β的培养基培养，得到il-1β预处理的间充质干细胞。

较优化的技术方案，步骤3)中，选取传代间充质干细胞，培养基培养，待细胞融合度达到60％-70％，更换为含有20ng/ml的il-1β培养基继续培养48h，得到il-1β预处理的间充质干细胞。

较优化的技术方案，步骤2)操作时，选取步骤1)分离得到的骨髓间充质干细胞，培养基培养，待细胞融合度达70％时进行传代培养，培养3-5代后得到传代间充质干细胞。

较优化的技术方案，步骤1)中，所述骨髓间充质干细胞来源为大鼠骨髓。

较优化的技术方案，步骤1)中，骨髓间充质干细胞的分离方法为全骨髓贴壁法。

较优化的技术方案，步骤1)中，具体操作步骤为：

a)选取大鼠，麻醉处死，无菌分离大鼠股骨，以无菌pbs冲洗骨髓腔，收集骨髓并打散后接种于含10％胎牛血清的dmem/f12培养基内培养；

b)培养72h后更换培养基，并除去未贴壁细胞，后每3天换液1次，得到骨髓间充质干细胞。

较优化的技术方案，步骤2)得到传代间充质干细胞后进行细胞鉴定。

较优化的技术方案，步骤2)中，细胞鉴定步骤包括：

a)通过倒置显微镜观察传代间充质干细胞的形态与生长特点；

b)选取传代间充质干细胞，采用流式细胞仪检测阳性表面标志物cd90、cd105及阴性标志物cd45、cd34的表达；

c)选取传代间充质干细胞，体外诱导法诱导成脂、成骨分化，诱导2周后，分别通过油红o染色、茜素红染色鉴定。

较优化的技术方案，所述il-1β预处理的间充质干细胞在急性肝衰竭治疗中的应用。

较优化的技术方案，il-1β预处理的间充质干细胞用于急性肝衰竭治疗时，静脉注射1×10⁷细胞/kg间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

急性肝衰竭是一种进展速度快且致死率高的疾病，且缺乏除肝移植外的其它有效治疗方案。由于容易获取、不涉及伦理问题，以及具有对炎症性疾病的代谢及功能支持作用，间充质干细胞作为一种可能能够有效治疗急性肝衰竭的方案而被广泛研究。众多临床前实验证实，间充质干细胞应用能有效降低急性肝衰竭的死亡率，改善肝功能及肝脏的病理生理进程。

本发明采用了操作最简单、对细胞损伤最小且损失细胞最少的全骨髓贴壁法，所分离的骨髓间充质干细胞的纯度较高，cd90和cd105表达率大于95％,而cd45及cd34的表达量低于2％，并且具有较好的多向分化潜能，符合体内实验的要求。

分离得到骨髓间充质干细胞后，本发明又进行体外传代培养，培养至第3-5代后，得到传代间充质干细胞，再利用il-1β对其进行预处理，得到本发明公开的il-1β预处理的间充质干细胞，该细胞具有较未处理的间充质干细胞更高的cxcr4表达量，从而具有更强的向受损肝脏的归巢能力，在其归巢能力提高后，不仅能更有效的提高急性肝衰竭大鼠的生存率及肝功能，亦能更佳的促进受损肝脏的肝细胞的增殖，抑制肝细胞凋亡。

本发明公开了一种用于治疗急性肝衰竭的间充质干细胞的制备方法，步骤操作简单，技术方案合理，通过il-1β预处理可有效改善普通间充质干细胞在急性肝衰竭治疗中的疗效，为急性肝衰竭的治疗提供了新的方向及理论依据，具有较高的实用性。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明实施例中p4代细胞的显微镜观察示意图；

图2为本发明实施例中p4代细胞的cd90表达率；

图3为本发明实施例中p4代细胞的cd105表达率；

图4为本发明实施例中p4代细胞的cd45表达率；

图5为本发明实施例中p4代细胞的cd34表达率；

图6为本发明实施例存活率实验中存活率结果示意图，其中存活率实验中的模型对照组显示为con组，空白组显示为ns，治疗对照组显示为mscs，治疗实验组显示为pre-mscs；

图7为本发明实施例肝功能检测实验中静脉血清中丙氨酸转氨酶示意图；

图8为本发明实施例肝功能检测实验中静脉血清中天冬氨酸转氨酶示意图；

图9为本发明实施例肝功能检测实验中静脉血清中总胆红素示意图；

图10为本发明实施例肝功能检测实验中静脉血清中白蛋白示意图；

图11为本发明实施例肝功能检测实验中空白治疗组肝脏标本he染色示意图；

图12为本发明实施例肝功能检测实验中治疗对照组肝脏标本he染色示意图；

图13为本发明实施例肝功能检测实验中治疗实验组肝脏标本he染色示意图；

图14为本发明实施例肝功能检测实验中肝脏标本相对坏死面积统计示意图；图7-图14为肝功能检测结果，其中模型对照组显示为con组，空白组显示为ns，治疗对照组显示为mscs，治疗实验组显示为pre-mscs；

图15为本发明实施例原位凋亡检测实验中肝脏tunel阳性肝细胞统计示意图；

图16为本发明实施例ki67的免疫组化检测实验中肝脏ki67阳性肝细胞统计示意图；图15-图16免疫组化及原位凋亡检测实验中空白组显示为ns，治疗对照组显示为mscs，治疗实验组显示为pre-mscs；

图17为本发明实施例归巢实验中相对荧光密度检测示意图；其中归巢实验中的空白组显示为ns，治疗对照组显示为mscs，治疗实验组显示为pre-mscs，所有细胞经cm-dil标记处理；

图18为本发明实施例westernblot检测实验中cxcr4、c-met蛋白表达示意图；其中westernblot检测实验中il-1β预处理后的间充质干细胞组显示为il-1β，p4代间充质干细胞组显示为con组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：

1、取雄性成年sd大鼠,6-8周龄，体重180-200g，无特定病原体(specific-pathogenfree,spf)级别，购自常州卡文斯实验动物有限公司﹝许可证号：scxk(苏)2016-0010)﹞，于无锡市人民医院动物实验中心spf级环境饲养(实验单位使用许可证编号：syxk(苏)2015-0004)。

2、il-1β预处理的间充质干细胞的制备：

s1：麻醉处死大鼠，无菌分离大鼠股骨，以无菌pbs冲洗骨髓腔，收集骨髓并打散后接种于含10％胎牛血清(fbs)的dmem/f12培养基内培养，72h后更换培养基除去未贴壁细胞，后每3天换液1次，得到骨髓间充质干细胞。

s2：选取骨髓间充质干细胞，培养基培养，待细胞融合度达70％时进行传代培养，培养4代后得到第四代间充质干细胞，标记为p4。

s3：选取p4代细胞，待细胞融合度达到60％-70％，更换为额外含有20ng/ml的il-1β的培养基继续培养48h，得到所述il-1β预处理的间充质干细胞。

3、检测实验：

本实施例统计方法为：采用spss19.0软件进行统计学分析，数据结果均以均数±标准差表示。数据间的相互比较通过单因素方差分析完成，其中两两比较采用lsd-t法，仅有2组数据的组间比较采用t检验。检验水准α＝0.05(双侧)。p>0.05代表数据间比较无显著性差异，p＜0.05表示数据间比较有统计学差异，p＜0.01和p＜0.001表示统计学差异更加显著。

以下依据该统计方法进行实验：

(1)p4代细胞的鉴定：

选取p4代细胞，通过倒置显微镜观察形态与生长特点；

应用流式细胞仪检测p4代细胞阳性表面标志物cd90、cd105及阴性标志物cd45、cd34的表达；

选取p4代细胞，体外诱导法诱导成脂、成骨分化，诱导2周后，分别通过油红o染色、茜素红染色鉴定。

结论：①由倒置显微镜观察可知，p4代细胞体积有所增大，呈长梭形、多角样生长(如附图1所示)。

②由流式细胞仪检测结果显示，p4代细胞表面cd90和cd105表达率大于95％，而cd45及cd34的表达量低于2％(如附图2-5所示)。

③进行诱导成脂分化培养的细胞肉眼可见被油红o着色的脂滴形成。进行诱导成骨分化培养的细胞可见茜素红染色阳性，提示有钙盐形成。

通过鉴定实验可知，通过该实施例制备的p4代细胞为纯度较高的间充质干细胞，干细胞表面高表达cd90和cd105,而几乎不表达代表造血细胞免疫表型的cd45及cd34，同时该间充质干细胞具有较好的多向分化潜能，符合体内实验的要求。

(2)存活率实验：

取10只大鼠，分别给予植物油溶液3ml/kg单次腹腔注射，作为模型对照组；

分别取30只大鼠，分别给予体积分数为50％的四氯化碳植物油溶液3ml/kg单次腹腔注射，构建大鼠急性肝衰竭模型，造模6h后将急性肝衰竭大鼠随机平分为3组：

空白组：分别给予大鼠尾静脉注射5ml/kg的生理盐水。

治疗对照组：分别给予大鼠尾静脉注射1×10⁷细胞/kg的p4代间充质干细胞。

治疗实验组：分别给予大鼠尾静脉注射1×10⁷细胞/kg的il-1β预处理的间充质干细胞。

治疗后每天观察记录大鼠生存情况至第6天结束，计算各组大鼠存活率。

结论：观察记录后发现，模型对照组中大鼠直至观察结束均无死亡现象，治疗实验组中大鼠的存活率高达70％，而治疗对照组中大鼠存活率为40％，空白组中大鼠存活率仅为20％(如附图6所示)。

(3)肝功能检测实验：

取8只大鼠，分别给予大鼠体积分数为50％的植物油溶液2.5ml/kg单次腹腔注射，作为模型对照组；

分别取24只大鼠，分别给予大鼠体积分数为50％的四氯化碳植物油溶液2.5ml/kg单次腹腔注射，构建大鼠急性肝衰竭模型，造模6h后将急性肝衰竭大鼠随机平分为3组：

空白组：分别给予大鼠尾静脉注射5ml/kg的生理盐水。

治疗对照组：分别给予大鼠尾静脉注射1×10⁷细胞/kg的p4代间充质干细胞。

治疗实验组：分别给予大鼠尾静脉注射1×10⁷细胞/kg的il-1β预处理的间充质干细胞。

分别于治疗后24h、48h通过内眦静脉取血法收集静脉血，应用生化自动分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、总胆红素(tbil)及白蛋白(alb)。

于治疗后48h麻醉处死大鼠，留取肝脏组织置于体积分数为10％福尔马林固定24h后，经石蜡包埋后被切成厚度为4μm的切片用于伊红(he)染色及免疫组化分析。显微镜观察he染色，于100×倍数下，随机选取5个视野拍照，并应用imagej分析肝脏坏死面积相对于拍照面积的比例。

结论：①应用生化自动分析仪检测结果显示，治疗24h后，模型对照组各个指标均保持正常；治疗实验组的alt、ast、tbil及alb分别为141.71±34.98u/l、556.14±97.32u/l、3.14±0.54μmol/l、26.11±0.58g/l；治疗对照组中的alt、ast、tbil及alb分别为233.43±2.30u/l、1049.86±150.35u/l、4.67±1.28μmol/l、26.48±1.03g/l(p＜0.05)。

治疗48h后，模型对照组各个指标均保持正常，治疗实验组alt、ast、tbil及alb分别为98.29±12.24u/l、376.14±60.09u/l、1.37±0.37μmol/l、26.31±0.76g/l。治疗对照组中alt、ast、tbil及alb分别为176.67±17.61u/l、713.83±91.52u/l、1.9±0.32μmol/l、24.88±0.69g/l(p＜0.01)。

以上检测结果如说明书附图7-10所示。

②he染色结果显示：空白组中明显可见大面积的肝组织坏死区域，治疗实验组和治疗对照组均明显改善了肝组织坏死的情况，且治疗实验组的肝组织坏死情况最轻。

统计可知，治疗对照组中肝组织的相对坏死面积为23.72％±2.88％；空白组中肝组织的相对坏死面积为28.95％±3.00％，而治疗实验组中肝组织的相对坏死面积为17.64％±3.07％，明显低于其他两组(p＜0.01)。(如附图11-14所示)

通过上述存活率、肝功能及肝脏病理学检测结果可知：il-1β处理后的间充质干细胞能够更加显著的改善大鼠的肝功能，提高大鼠存活率，降低肝脏的坏死。

(4)免疫组化及原位凋亡检测实验：

取(3)肝功能检测实验中留取的三组(空白组、治疗对照组、治疗实验组)肝脏组织，分别进行以下检测：

分别选取ki67抗体作为一抗，应用抗原修复法进行免疫组化染色。原位凋亡检测应用商业化的tunel凋亡试剂盒参照说明书完成。染色完成后，显微镜观察，于200×倍数下，随机选取5个视野拍照，并应用imagej计数阳性染色细胞数。

结论：①tunel染色图片及阳性细胞数分析显示，空白组中凋亡的肝细胞数目最多，为765.00±86.97，其他两组(治疗对照组、治疗实验组)均有显著降低的tunel阳性细胞数(p＜0.001)，而治疗实验组的疗效最佳；其中治疗实验组凋亡的肝细胞数目为225.4±51.03，治疗对照组凋亡的肝细胞数目为355.4±46.01。(p＜0.01)

②ki67染色的结果趋势与tunel完全相反，空白组、治疗实验组、治疗对照组的增殖细胞数分别为139.4±17.18、189.2±29.99、391.8±46.58，其中治疗实验组肝细胞增殖作用最强。

通过上述检测结果可知：il-1β预处理后的间充质干细胞能更加显著抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞增殖，疗效比未预处理的间充质干细胞更佳。

以上检测结果如附图15-16所示。

(5)细胞标记及归巢实验：

①细胞标记实验：选取p4代细胞，待p4代细胞融合度达到90％左右时，胰酶消化细胞。应用含3μmcm-dil的pbs溶液重悬细胞，37℃培养箱孵育5min，然后4℃孵育15min。后离心弃上清，pbs洗3遍，最后以ns重悬细胞并计数，配制成2×106细胞/ml的细胞溶液。取少量细胞溶液加入含有10％pbs的培养基中于37℃恒温培养箱中继续培养，待细胞贴壁稳定生长后，应用荧光显微镜观察并拍照，通过与白光下图像对比，分析细胞的标记率。

②归巢实验：分别取24只大鼠，分别给予大鼠体积分数为50％的四氯化碳植物油溶液2.5ml/kg单次腹腔注射，构建大鼠急性肝衰竭模型，造模6h后将急性肝衰竭大鼠随机平分为3组：

空白组：分别给予大鼠尾静脉注射5ml/kg的生理盐水。

治疗对照组：分别给予大鼠尾静脉注射1×10⁷细胞/kg的cm-dil标记后的p4代间充质干细胞。

治疗实验组：分别给予大鼠尾静脉注射1×10⁷细胞/kg的il-1β培养基培养后的cm-dil标记间充质干细胞。

治疗24h后麻醉处死大鼠，留取肝组织-80℃冰冻后，应用冰冻切片机切片，厚度4μm，荧光显微镜下观察标记细胞在肝组织中的分布，于200×倍数下，随机选取5个视野拍照，并应用imagej分析各组的荧光信号密度。

结论：①细胞标记实验中应用cm-dil对细胞进行了标记，几乎所有的细胞均能被阳性标记，且标记对细胞的形态无明显影响。

②归巢实验中，24h后通过荧光显微镜观察大鼠肝脏的冰冻切片的荧光情况，并应用imagej对相对光密度进行分析，结果显示，空白组无红色荧光，治疗实验组的荧光最明显，相对荧光密度为1.88％±0.42％，而治疗对照组的相对荧光密度为0.57％±0.23％(p＜0.001)(如附图17所示)。

通过上述检测结果可知：il-1β预处理能显著促进间充质干细胞向受损肝脏的归巢能力，进一步促进肝细胞增殖，以此来改善大鼠的肝功能。

(6)westernblot检测：

参照bca试剂盒说明书，收集应用20ng/ml的il-1β预处理48h后的间充质干细胞的细胞总蛋白、p4代间充质干细胞的细胞总蛋白，应用cxcr4、c-met、内参抗体tubulin作为一抗，以及相应的二抗进行westernblot检测，并对蛋白表达的灰度值进行数据分析。

结论：检测结果显示，il-1β预处理48h后的间充质干细胞的cxcr4表达量明显提高，其cxcr4的灰度值为p4代间充质干细胞cxcr4灰度值的2.46倍(p＜0.001)，而c-met在两种细胞中的表达无显著性差异(p＞0.5)(如附图18所示)。

综上所述，本发明利用全骨髓贴壁法成功分离培养出了纯度较高的骨髓间充质干细胞，并对其进行il-1β预处理，治疗时il-1β预处理显著增强了间充质干细胞cxcr4的表达，进一步提高了间充质干细胞向受损肝脏的归巢能力，从而显著提高间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠的生存率、肝功能、肝脏坏死及肝细胞凋亡的改善作用，并进一步促进肝脏重建，通过本申请制备方法获得的间充质干细胞在急性肝衰竭治疗时具有优异疗效。

本研究首次通过实验证实il-1β预处理可以显著增强间充质干细胞在急性肝衰竭治疗中的疗效，并证实这种疗效的增强至少部分是il-1β预处理提高了间充质干细胞的cxcr4的表达，而进一步提高了间充质干细胞向受损肝脏的归巢能力所致。这一发现为提高间充质干细胞在急性肝衰竭中的疗效提供了新的方向及理论依据。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。