细胞培养方法及装置与流程

本发明涉及细胞培养方法及装置，更具体而言，涉及使用设有多个凹部的细胞培养袋的细胞培养方法及装置。

背景技术：

近年来，在药物的生产、基因治疗，再生医疗，免疫疗法等领域中，要求将细胞(包括组织，微生物，病毒等)在人工的环境中效率良好地大量培养、诱导分化。

在这样的细胞培养中，为了避免污染的风险，有时使用封闭体系的细胞培养袋。细胞培养袋例如由密封周边部的塑料膜构成的袋主体、和安装于袋主体的端口构成。在专利文献1中记载了通过在袋主体的底面设有多个凹部，抑制细胞培养袋内的细胞的移动的细胞培养袋。

另一方面，在细胞培养中，一般而言，如果伴随细胞的增殖，培养基中的细胞浓度变得太高，则由于对增殖必需的培养基成分枯竭、细胞自身的代谢产物的蓄积等导致细胞的生长受到阻碍，使细胞的增殖效率降低，另一方面，培养基中细胞浓度过低，细胞的增殖、诱导分化的效率也降低。因此，为了提高细胞的培养、诱导分化效率，需要将细胞浓度维持在合理的范围内。

在使用设有多个凹部的细胞培养袋进行球状体培养的情况下，也需要将各凹部中的细胞浓度维持在合理的范围中，因此，以使得各凹部的细胞数均一的方式将细胞接种在各凹部中。

进一步，在所述球状体培养中，为了在各凹部中形成均一且适当的大小的球状体(细胞凝集团块)，要求在各凹部中各形成1个球状体，将每1个凹部1个球状体保持到培养结束。

为了在1个凹部中形成1个球状体，优选在细胞培养袋的内表面实施细胞难以粘附的细胞低粘附处理，将细胞集中在细胞培养袋的冠球状的凹部的底部中央。作为细胞低粘附处理，可列举包覆例如磷脂聚合物，聚乙烯醇衍生物，表面活性剂或白蛋白这样的蛋白质等而在塑料膜的表面阻碍细胞粘附性蛋白的吸附的处理等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-11260号公报

技术实现要素：

发明所要解决的问题

可是，即使对细胞培养袋实施了细胞低粘附处理，由于处理的不均匀、培养细胞的粘附力等各种原因，存在细胞、球状体粘附于凹部的内表面的情况。例如，如图10所示，接种在容纳有培养基s的细胞培养袋1的各凹部4中的细胞c，可能会通过细胞粘附性蛋白与凹部4的内表面的多个部位粘附。在这样的情况下，由于各细胞c以粘附的位置为出发点分别形成球状体，因此，会在1个凹部4中形成较小的多个球状体。然后，由于粘附在凹部4的内表面的球状体不发生移动，因此，球状体彼此粘附无法形成1个球状体。

因此，为了在各凹部中各形成一个球状体，需要将在凹部内表面的多个部位粘附的细胞剥离，集中到凹部内的1个位置(例如：底部中央)。

另外，即使在各凹部中各形成1个球状体的情况下，球状体也可能与凹部的内表面粘附。在球状体中与凹部内表面粘附的部分中，培养基成分容易枯竭，且代谢产物容易蓄积，因此，球状体整体的细胞的增殖、诱导分化效率会降低。

因此，在球状体培养中，为了提高细胞的增殖、诱导分化效率，要求将粘附在凹部内表面的球状体定期地(例如，在培养基交换时)剥离，从而改变球状体的粘附位置。

如果是在使用了以往的孔板的细胞培养中，可以通过用移液器使孔(凹部)内的培养基发生激流而剥离在孔的内表面粘附的细胞(例如：刚接种的细胞，或形成了球状体的细胞)。具体而言，可以通过将移液器前端插入孔中，以不吸上细胞的方式同时轻轻的吸上培养基，然后，将吸上来的培养基有力地注入孔中而在培养基中发生激流，通过激流而将细胞剥离。

然而，在使用了细胞培养袋的细胞培养中，难以在保持封闭体系不变的状况下将移液器插入细胞培养袋内的凹部。

需要说明的是，在使用了细胞培养袋的细胞培养中，可考虑如图11(a)所示，从端口3强力注入培养基s而在细胞培养袋1内产生培养基s的水流，将在凹部4的内壁粘附的细胞c剥离的方法。

但是，在该方法中，如图11(b)所示，在凹部4内沉淀的细胞c、经剥离的细胞c会移动到其它凹部4中，各凹部4内的细胞浓度会变得不均一。尤其是，如果在1个凹部4中进入了许多细胞c，则最后成为过大的团块c’，细胞的增殖、诱导分化效率会降低。

本发明是鉴于上述的状况而进行的，目的在于提供细胞培养方法及装置，其在使用形成有多个凹部的细胞培养袋进行细胞培养的时候，防止细胞在凹部间移动，并将在凹部的内表面粘附的细胞或细胞凝集团块剥离，可提高细胞或细胞凝集团块的增殖、诱导分化效率。

解决问题的方法

本发明涉及一种细胞培养方法，所述方法使用细胞培养袋，其中，所述细胞培养袋具备由密封了周边部的上表面膜及下表面膜构成的袋主体和安装在上述袋主体的端口，并在上述下表面膜形成有多个凹部，所述方法包括：将上述袋主体中容纳的培养基从上述端口排出，以上述上表面膜封闭上述多个凹部的封闭工序，和在被封闭的上述多个凹部的一部分或全部的凹部中，从上述细胞培养袋的外部对上述凹部给予物理刺激，将在该凹部的内表面粘附的细胞或细胞凝集团块剥离的剥离工序。

另外，本发明涉及细胞培养装置，所述细胞培养装置使用细胞培养袋，其中，所述细胞培养袋具备由密封了周边部的上表面膜及下表面膜构成的袋主体和安装在上述袋主体的端口，并在上述下表面膜形成有多个凹部，所述细胞培养装置具备：具有装载上述细胞培养袋的装载面的支架，和将上述袋主体中容纳的培养基从上述端口排出，直到上述上表面膜将上述多个凹部封闭的送液部件，和在被封闭的上述多个凹部的一部分或全部的凹部中，为了将在该凹部的内表面粘附的细胞或细胞凝集团块剥离而从上述细胞培养袋的外部对该凹部给予物理刺激的剥离部件。

发明的效果

根据本发明的细胞培养方法及装置，其在使用形成有多个凹部的细胞培养袋进行细胞培养的时候，可以防止细胞在凹部间的移动，并将在凹部的内表面粘附的细胞或细胞凝集团块剥离，提高细胞或细胞凝集团块的增殖、诱导分化效率。

例如，在细胞培养袋的凹部的内表面的多个部位发生粘附的情况下，通过将凹部封闭并对凹部给予物理刺激，可以防止细胞在凹部间的移动，同时将细胞剥离并使其集中在一个部位，在1个凹部中效率良好地形成1个细胞凝集团块(球状体)，提高细胞的增殖、诱导分化效率。

进一步，例如，当细胞凝集团块粘附在细胞培养袋的凹部的内表面的情况下，通过将凹部封闭，对凹部给予物理刺激，可以防止细胞凝集团块在凹部间的移动，同时将细胞凝集团块剥离并改变细胞凝集团块的粘附部位，提高细胞凝集团块的增殖、诱导分化效率。

附图说明

[图1]

(a)显示示出本发明的实施方式所使用的细胞培养袋的概略的平面图，(b)显示示出本发明的实施方式所使用的细胞培养袋的概略的侧面图，(c)显示示出本发明的实施方式所使用的细胞培养袋的概略的底视图。

[图2]

(a)示出本发明的第1实施方式涉及的细胞培养装置的剖面模式图，且按压构件上提的状态，(b)示出本发明的第1实施方式涉及的细胞培养装置的剖面模式图，且按压构件下压的状态。

[图3]

(a)显示示出本发明的第1实施方式中的细胞培养中的状态的剖面模式图，(b)示出本发明的第1实施方式中的封闭工序的细胞培养袋的剖面模式图。

[图4]

说明本发明的第1实施方式中的剥离工序的细胞培养袋的剖面模式图。

[图5]

(a)为显示接种了细胞的1个凹部内的照片，示出从接种48小时之后的凹部内，(b)为显示接种了细胞的1个凹部内的照片，示出封闭工序后的凹部内，(c)为显示接种了细胞的1个凹部内的照片，示出刚进行剥离工序后的凹部内，(d)为显示接种了细胞的1个凹部内的照片，示出从剥离工序15小时之后的凹部内。

[图6]

(a)为说明本发明的第2实施方式的细胞培养袋的剖面模式图，示出进行了上下翻转的细胞培养袋，(b)为说明本发明的第2实施方式的细胞培养袋的剖面模式图，示出使其倾斜的细胞培养袋，(c)为说明本发明的第2实施方式的细胞培养袋的剖面模式图，示出进行了上下翻转且使其倾斜的细胞培养袋。

[图7]

图7为说明本发明的第3实施方式的剥离工序的细胞培养袋的剖面模式图。

[图8]

(a)为说明本发明的第4实施方式涉及的细胞培养方法的细胞培养袋的剖面模式图，示出剥离工序，(b)为说明本发明的第4实施方式涉及的细胞培养方法的细胞培养袋的剖面模式图，示出解除工序，(c)为说明本发明的第4实施方式涉及的细胞培养方法的细胞培养袋的剖面模式图，示出排出工序。

[图9]

图9为说明本发明的第5实施方式涉及的细胞培养方法的细胞培养袋的剖面模式图。

[图10]

图10为显示在细胞培养袋的凹部的内表面的多个部位粘附有细胞的状态的细胞培养袋的剖面模式图。

[图11]

(a)为显示示出球状体从细胞培养袋内的凹部剥离的状态的细胞培养袋的剖面模式图，(b)为显示示出经剥离的球状体在细胞培养袋内在凹部间移动的状态的细胞培养袋的剖面模式图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施方式同时参考附图进行说明。

(细胞培养袋)

首先，在本实施方式涉及的细胞培养装置的说明之前，参考图1说明本实施方式所使用的细胞培养袋。图1(a)～图1(c)所示的细胞培养袋1具备：由叠合而将周边部20热封的上表面膜21及下表面膜22构成的袋主体2，和安装于该袋主体2的端口3。对袋主体2的大小没有特别限定，例如优选使为纵向50～500mm，宽50～500mm。

需要说明的是，在包括图1的各图中，将与端口3连接的管等流路、及封闭流路的夹具或阀等封闭部件的图示省略。

在下表面膜22中，如图1(c)所示，各个形成了成为细胞培养部的多个凹部4。对凹部4而言，为了抑制袋主体2内中的细胞的移动，使得培养中的细胞停留在一个凹部4中，优选开口直径(直径)d为0.3～10mm，深度d为0.1mm以上。另外，对凹部4而言，可以就全部凹部4而言为相同的开口直径，也可以包含开口直径不同的二种以上的凹部。例如也可以将下表面膜22分割成多个区域，在各个区域中的每个使凹部4的开口直径不同。

另外，在细胞培养袋1中，为了使细胞容易汇集在凹部4的底部，如图1(b)所示，凹部4具有球冠状的形状。需要说明的是，凹部4的形状并不限于这些。例如：凹部4也可以具有凹成研钵状(圆锥状)的形状。为了使细胞容易汇集在凹部4的底部，优选使凹部4的深度d相对于直径d的比d/d为0.05～1。

另外，凹部4的排列优选为如图1(c)所示的错开状，而使得凹部4占下表面膜22的占有面积尽可能地变大，但也可以根据需要排列为格子状。

上表面膜21如图1(b)所示具有由覆盖多个凹部4全部的上方的实质上平坦的顶面部分21a，和在顶面部分21a的周围形成的倾斜部分21b构成的膨出成高地状的膨出形状。由此，与将二块塑料膜叠合而仅将周边部密封的平袋状的容器相比，即使将袋主体2用培养基充满，下表面膜22的周边部发生隆起的变形也得到抑制。

对形成袋主体2的上表面膜21及下表面膜22而言，利用具有气体透过性的塑料膜形成。该塑料膜的气体透过性，优选根据jisk7126的气体透过度试验方法，于试验温度37℃测定的氧的透过度为5000ml/(m²·天·atm)以上。

作为在形成袋主体2的塑料膜中使用的材料，可列举例如：聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、硅酮类弹性体、聚苯乙烯类弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(fep)等热塑性树脂。这些可以以单层使用，也可以将同种或不同种的材料叠层而使用，但如果考虑将周边部进行热封时的热融合性，则优选具有作为封闭层起作用的层。

另外，为了使上表面膜21在具有挠性的同时也保持膨出形状，且下表面膜22保持凹部4的形状，形成袋主体2的塑料膜的厚度优选为具有适度的形状保持性的30～200μm。

端口3由培养基、细胞等能够流通的管状的构件构成，可以利用例如聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯类弹性体、fep等热塑性树脂形成。

(第1实施方式)

下面参考图2及图3对本发明的实施方式涉及的细胞培养方法及装置进行说明。图2为第1实施方式涉及的细胞培养装置100的剖面模式图，图2(a)示出按压构件升起的状态，图2(b)示出按压构件下降的状态。

本实施方式的细胞培养装置100具备：将细胞培养袋1装载的支架5、和具有按压上表面膜21中的顶面部分21a部分的底面6a的按压构件6、和支撑按压构件6的支撑机构7。

需要说明的是，图2中省略了作为进行培养基从细胞培养袋1的端口3的注入、作为进行排出的送液部件的泵，将球状体从细胞培养袋1的凹部4剥离的剥离部件的图示。需要说明的是，作为泵可列举例如：与端口3通过管连接的perista泵。

需要说明的是，送液部件不限定于泵，可以为例如：注射器。

支架5具有将细胞培养袋1水平装载的装载面5a。在该装载面5a中，作为将在细胞培养袋1的下表面膜22形成的多个凹部4的各个进行接受的形状而形成了开口部5b。由此，装载面5a以使得下表面膜22与凹部4不接触的方式进行支撑，因此，使凹部4的崩溃、变形得以避免而防止凹部4内的细胞的流出，并且，来自下表面膜22的气体透过性升高。

需要说明的是，将多个凹部4的各个进行接受的形状不限定为开口部，例如，可以为凹部，也可以为金属网状。

按压构件6为具有与细胞培养袋1的顶面部分21a一致的大致长方形的平面形状的板状构件，具有平坦的底面6a。

支撑机构7由在支架5上设置的框架71、和从按压构件6的上表面的四角向上方延伸而以框架71能够上下运动的方式贯穿的导销72、和将按压构件6向下方施力的施力部件73构成。施力机构73由按压构件6的上表面、和配置为与框架71彼此以同极侧相对的方式的磁石73构成。利用永磁体73彼此之间运转的斥力，按压构件6依照上表面膜21的高度进行上下移动。

需要说明的是，施力部件73并不限定于永磁体。另外，也可以省略施力部件73，利用按压构件6的自重，使按压构件6依照上表面膜21的高度进行上下移动。

下面参考图3及图4对本实施方式的细胞培养方法进行说明。需要说明的是，在图3及图4中省略了在图2中示出的细胞培养装置中的支撑机构7的图示。

如图3(a)所示，在细胞培养中，形成的球状体c以均一的细胞浓度被容纳在各凹部4中。

如图3(b)所示，在封闭工序中，通过用泵(未图示)将容纳于袋主体2中的培养基s从端口3排出，从而使上表面膜21中的多个凹部4被全部封闭。由于上表面膜21被按压构件6的平坦的底面6a所按压，因此，上表面膜21是平坦的，多个凹部4的各个被上表面膜21切实地封闭。由此，球状体c分别被在封闭各凹部4内，因此在后面的剥离工序中，可防止从球状体c的各凹部4流出。

需要说明的是，在由上表面膜21进行的多个凹部4的封闭时，可以是将各凹部4密闭也可以不密闭。在多个凹部4没有被密闭的情况下，多个凹部4只要被封闭到能够阻止细胞从凹部4流出的程度即可。

接着，如图4所示，在剥离工序中，从封闭的多个凹部4的一部分或全部中从该凹部4的内表面剥离球状体c。

在剥离工序中，可以对多个凹部中的一部分或全部的凹部4给予振动或摇动。在该情况下，可以对细胞培养装置100全部给予振动或摇动，也可以对形成了凹部4的下表面膜22施加振动或摇动的物理的力。对凹部4施加的振动或摇动也传递到凹部4的内表面粘附的球状体c，球状体c从凹部4内表面剥离。

需要说明的是，作为给予振动或摇动的部件，可以使用图4示出的安装于细胞培养装置的支架5的振动器(vibrator)8，也可以利用摇动装置。另外，也可以使凹部4与振动器直接接触，对凹部4直接施加振动。另外，也可以对一部分的凹部4选择地施加振动或摇动。

另外，振动及摇动可以为往返运动，例如采用试管混合器的旋转运动。

这里，在图5中，在本实施方式中显示了示出接种了细胞的1个凹部4内的照片。在此，使用ajinomotoco.，inc.制的培养基(stemfit(注册商标))，以每1个凹部(孔)3×10⁴个接种了未分化ips细胞(细胞株1231a3)。

图5(a)示出从接种48小时之后的凹部。如所述图所示，接种的细胞不仅在凹部的底部中央，而且粘附在凹部的内表面的能到达的位置而形成了球状体。需要说明的是，在所述图中，在凹部的周围内表面粘附的球状体由于离开了照片的焦点面，因此，没有清晰地显现。

图5(b)示出封闭工序后的凹部。仅将凹部4进行封闭，球状体仍保持粘附在内表面的各处。

在封闭工序中，作为送液部件使用perista泵，以1.0ml/分钟的送液速度从端口3排出培养基，直到上表面膜21将各凹部4封闭。

图5(c)为示出刚剥离工序后的凹部。利用振动器8使支架5振动。如所述图所示，从凹部4的周围内表面剥离的许多的较小球状体集中到凹部的底部中央。

在剥离工序中，使用了作为剥离部件为振动器8的试管混合器8。然后，如图4所示，通过将试管混合器8推压在细胞培养装置100的支架5的下表面1分钟，对细胞培养袋1的各凹部4从外部给予了物理刺激。作为试管混合器8，使用了振动速度：约2800转/分钟、水平振动式的tietechco.，ltd.制的presentmixer-6076881。

图5(d)示出从剥离工序15小时之后的凹部。在剥离工序后，向袋主体2内注入培养基而再开始培养。如所述图所示，在凹部4的底部中央形成了1个球状体。

像这样，根据本实施方式，防止球状体在凹部4间的移动，同时使球状体从内表面剥离而集合到一个部位。由此，可以在1个凹部4中效率良好地形成1个球状体而提高球状体的增殖、诱导分化效率。

进一步，在即使在1个凹部4中形成了1个球状体，而球状体粘附在凹部4的内表面的情况下，通过再次将凹部4封闭，对凹部4给予物理刺激，可以防止球状体在凹部4间的移动，同时将球状体从内表面剥离而改变球状体的粘附部位，提高球状体的增殖、诱导分化效率。

(第2实施方式)

接着，参考图6说明本发明的第2实施方式。在所述图中，省略一部分与第1实施方式相同的构成部分的图示。

在本实施方式中，在第1实施形态中说明的封闭工序后，在剥离工序中，代替对细胞培养袋的凹部4从外部给予物理刺激，而是如图6(a)所示，各凹部4保持封闭状态，将细胞培养袋1以每个图1显示的细胞培养装置100进行上下翻转。

另外，也可以如图6(b)所示，在剥离工序中，代替对凹部从外部给予物理刺激，而是各凹部4保持封闭状态，将细胞培养袋1以每个图1显示的细胞培养装置100进行倾斜。需要说明的是，对细胞培养袋1的相对于水平的倾斜角度没有特别限定，可以倾斜到例如90度。

进一步，也可以如图6(c)所示，在剥离工序中，代替对凹部从外部给予物理刺激，而是各凹部4保持封闭状态，将细胞培养袋1以每个图1显示的细胞培养装置100上下翻转且使其倾斜。

像这样，在本实施方式中，利用经培养袋100上下翻转和/或倾斜等简单的操作，将在凹部4的内表面粘附的球状体c通过重力剥离，另外，由于各凹部4被上表面膜21封闭，避免经剥离的细胞或球状体c移动到其它凹部4中。

另外，本实施方式适于仅通过将细胞培养袋1上下翻转和/或使其倾斜而将在细胞培养袋1的凹部4的内侧粘附的细胞及凝集团块剥离的情况。

需要说明的是，细胞培养袋1可以利用人手进行上下翻转和/或使其倾斜，也可以利用机械臂等机构进行上下翻转和/或使其倾斜。

另外，在上述第1实施方式的剥离工序中，也可以进一步进行本实施方式那样的将细胞培养袋1上下翻转和/或使其倾斜。另外，在后述的第3及4实施方式的剥离工序中，也可以进一步进行本实施方式那样的将细胞培养袋100上下翻转和/或使其倾斜。

(第3实施方式)

接着，参考图7说明本发明的第3实施方式。在所述图中，省略一部分与第1实施方式相同的构成部分的图示。

在本实施方式中，在第1实施形态中说明的封闭工序后，在剥离工序中，代替对细胞培养袋的凹部4给予振动或摇动，而是利用在多个凹部4的下方分别配置的上顶构件9，将各凹部从下方向上顶而对各凹部4给予物理刺激。

上顶构件9在支架5的装载面5a形成的开口部5b内利用致动器(未图示)进行上下运动。向下侧弯曲为凸状的冠球状的凹部4的底部被上顶构件9向上顶，以向上侧弯曲为凸状的方式反转地隆起。通过将凹部4向上顶，在凹部4的内表面粘附的球状体c发生剥离。

在保持凹部4向上侧反转的情况下，可以通过例如：接着将培养基注入袋主体2内后，利用按压构件6等按压袋主体2而使袋主体2的内压升高，使原来的向下侧弯曲为凸状的冠球状的形状恢复。另外，也可以通过例如：将向上侧反转的凹部4从下侧吸引而使凹部4的形状恢复。

需要说明的是，虽然在图7中示出了上顶构件9将全部的凹部4同时向上顶的例子，但也可以是上顶构件选择性地将一部分的凹部4上顶。

另外，也可以是1个上顶构件9将凹部4一个一个地按顺序向上顶。在该情况下，将致动器(未图示)构成为不仅使上顶构件9上下运动，也使上顶构件进行水平方向移动而按顺序定位在期望的凹部4的下方的方式即可。

另外，也可以将凹部4利用上顶构件9向上顶，并且对细胞培养袋1施加振动或摇动，对凹部4给予物理刺激，将在凹部4的内表面粘附的球状体c剥离。

像这样，即使是使用了细胞培养袋1的细胞培养，也可以防止球状体c在凹部4间的移动，并且改变球状体c在凹部4内的粘附位置。由此，可以提高细胞的培养、诱导分化效率。

(第4实施方式)

下面，参考图8而对本发明的第4实施方式的细胞培养方法及装置进行说明。

可以使本实施方式的细胞培养装置的结构与第2实施方式的那些相同。在本实施方式中，在第1实施形态中说明的封闭工序后，将不需要的球状体c1选择性剥离并排除。

如图8(a)所示，在剥离工序中，在封闭的多个凹部4中，将一部分的凹部内的球状体c1选择性剥离。在本实施方式中也使用与第1实施方式相同的剥离部件。

接着，如图8(b)所示，通过在解除工序中，利用泵从端口3向袋主体2内注入培养基，利用上表面膜21进行的凹部4的封闭得到解除。凹部4的封闭解除后，结果经剥离的球状体c1成为能够向该凹部4的外部流出的状态。

接着，如图8(c)所示，通过在排出工序中，利用泵从端口3将袋主体2内的培养基排出，将经选择性剥离的球状体c1与培养基s共同排出。如上所述地，可以将不需要的球状体c1选择性剥离并除去。

一方面，不需要的球状体c1被选择地剥离、除去，另一方面，未被选择的其它凹部4的球状体c由于分别粘附在各凹部4内表面，因此，不从端口3排出。

需要说明的是，虽然在本实施方式中，选择的是不需要的球状体c1，但被选择的球状体不限于不需要的，也可以选择作为例如提取样品的。另外，也可以将2个以上的凹部4内的球状体进行选择性剥离。

(第5实施方式)

接着，参考图9说明本发明的第5实施方式。

可以使本实施方式的细胞培养装置的结构与第4实施方式的那些相同。

在本实施方式中，在第4实施形态中说明的排出工序中，将细胞培养袋1上下翻转，且以使端口3位于多个凹部4的下方的方式使细胞培养袋1倾斜的状态选择地剥离球状体c1，与培养基s一起从端口3排出到袋主体2的外部。

需要说明的是，也可以以不使细胞培养袋1倾斜而仅上下翻转的状态，将剥离的球状体c1与培养基s一起从端口3排出到袋主体2的外部。

另外，本实施方式适于仅通过将细胞培养袋1上下翻转时，在细胞培养袋1的凹部4的内侧粘附的细胞及凝集团块不剥离的情况。

另外，将细胞培养袋1的上下翻转和/或使其倾斜的操作可以在排出工序中实施，也可以在排出工序之前的阶段中实施。

像这样，通过将细胞培养袋1上下翻转，将剥离工序中选择性剥离的球状体c1向凹部4的外部移动，从端口3容易地排出。进一步，如果将细胞培养袋1以端口3位于多个凹部4的下方的方式倾斜，则可以将剥离的球状体c1从端口3更容易地排出。

以上，对于本发明示出的优选实施方式进行了说明，但本发明并不受上述的实施方式限定，应当知道，在本发明的范围内能够实施各种变型。虽然在上述的实施方式中使用了棒状的上顶构件，但上顶构件的形状不限于这些。另外，虽然在上述实施方式中说明了利用按压构件按压上表面膜的例子，但在本发明中也可以省略按压构件。

另外，在上述实施方式中说明了将在细胞培养袋的凹部的内表面粘附的球状体进行剥离的例子，但本发明也适用于将没有形成球状体的细胞从细胞培养袋的凹部的内表面进行剥离的情况。

工业实用性

本发明能够用作效率良好地培养各种细胞的技术。

将该说明书中记载的文献及作为本申请的巴黎优先权的基础的日本申请说明书的内容全部援引于此。

附图标记

1细胞培养袋

2袋主体

20周边部

21上表面膜

21a顶面部分

21b倾斜部分

22下表面膜

3端口

4凹部(孔)

5支架

5a装载面

5b开口部

6按压构件

6a底面

7支撑机构

71框架

72导销

73施力部件(磁石)

8振动器(试管混合器)

9上顶构件

100细胞培养装置

c、c’、c1细胞或细胞凝集团块(球状体)

s培养基