本发明提供了一种用于储存和/或运输多细胞聚集体的新方式。所述多细胞聚集体包含多个邻接细胞，其中所述聚集体被截留或包封在可逆交联水凝胶中，并将所述被截留或包封的聚集体包装在密封容器中。还提供了用于制备用于储存和/或从第一位置运输到第二位置的这样的聚集体的方法，以及用于运输所述聚集体的相关方法和用于满足对所述聚集体的订购或索求的方法。
背景技术：
细胞可用于若干方面，包括科学研究、食品、药物开发、再生医学和3d打印。合适的细胞可以是邻接细胞组(本文通常称为多细胞聚集体)的形式，所述邻接细胞组包括组织(例如微组织)、细胞层、类器官和球状体。
多细胞聚集体可以被产生和/或制备以用于通常在地理上与它们的使用点分开的位置。然而，在英国或全球运送这样的多孔材料可能花费数小时或数天，并且容易延误，并且材料需要在适合目的条件下运送到使用点。已经证明难以有效地运输和回收多细胞聚集体如组织，许多方法导致例如细胞形态、细胞完整性的改变和/或细胞存活力随时间的损失。因此，多细胞聚集体的储存和/或运输代表了例如实验室供应(研究分布)和治疗(商业销售/试验)方面的重要障碍。
储存和运送细胞材料的常规方法是在适当的介质(例如在2-8℃下)中冷链运送或在运送之前和期间冷冻样品。例如，通常使用低温保存的组织的运输。然而，这些方法通常需要在运送之前进行多个处理步骤，并且这些过程可能不利地影响运送的材料或显著地增加成本。例如，低温保存经常导致细胞或组织存活力的丧失、结构完整性的降低和由于在运输期间必须保持低温而增加的费用。冷链运输也有许多缺点。这些缺点包括需要减少运输持续时间(因此增加了运送后勤和行程安排的复杂性)，以及对细胞或组织存活力、形态、结构完整性和质量的不利影响。当细胞材料用于人类用途(例如用于化妆品或临床用途，或用于人类用作食品)时，这些缺点是特别显著的问题。
需要一种简单而有效的方法来储存和/或运输包括多细胞聚集体的细胞材料。
技术实现要素：
本发明人已经开发了一种储存和/或运输包含多个邻接细胞的多细胞聚集体的新方法。
本发明人已经令人惊讶地示出，将多细胞聚集体截留或包封在可逆交联水凝胶中保护了聚集体中的细胞材料免受储存和/或运输的机械和环境应力。令人惊讶地，被截留或包封的细胞材料不需要在储存和/或运输期间维持细胞形态、结构完整性和/或细胞存活力(例如，一定温度、氧气和二氧化碳水平，以及支持营养物)一般所需的最佳条件。因此，可以将被截留或包封的细胞材料包装在密封容器中，以有效储存或递送至其使用点，同时将材料保持在适合目的的条件下。此外，经包装的材料的储存和/或运输可以在宽得多的条件范围(例如，较宽的温度范围，包括环境温度)下有效地进行，而不显著影响细胞存活力、结构完整性和/或形态。
先前已经显示水凝胶是用于储存和/或运输个体化细胞的有效包装材料，其中细胞被分离或分散在水凝胶内(参见例如发明人提交的wo2012/127224)。本发明人现在已经令人惊讶地确定，每个细胞不需要单独地与水凝胶直接接触对于水凝胶以提供对机械和环境应力的必要保护，所述机械和环境应力包括在储存和/或运输期间来自缺乏可溶性因子如气体和代谢物的应力。本发明人在本文中有利地显示，水凝胶也可用于支持在储存和/或运输期间包含多个邻接细胞的多细胞聚集体的存活力(并保持细胞形态和结构完整性)。本发明人已经成功测试的聚集体类型的实例包括细胞球状体、类器官、微组织和细胞层(例如具有至少一层的多细胞聚集体，其中聚集体的底层/侧在一侧粘附至组织培养板，并且聚集体的顶层/侧在另一侧涂覆有水凝胶)。在这种情况下，聚集体可以包含一个细胞层(即单层)或可以包含多个层(例如双层等)。
有利地，水凝胶可有效地用于储存和/或运输宽范围的多细胞聚集体。
本发明的方法可特别用于在任何细胞退化发生之前即时储存多细胞材料(例如分离的或制造的组织)，这为使用者提供了灵活性，因为多细胞材料(例如分离的/制造的组织)可安全地储存直到适当的人员可用、gmp实验室可进入或直到样品可批量处理，而不影响终点性能。
本发明已经使用藻酸盐水凝胶进行了举例说明。然而，本发明同样适用于具有等同机械性能的其它可逆交联水凝胶。下面更详细地描述可同样用于本发明的上下文内的替代水凝胶。
此外，本发明已经使用某些细胞类型例如包含基质细胞、上皮细胞或神经元细胞的多细胞聚集体进行了举例说明。此外，提供了描述本发明在简单的多细胞球状体和简单的3d组织构建体上的应用的数据。然而，本发明不限于这些特定的细胞类型，并且同样适用于其它多细胞聚集体，如下文更详细地描述。
一方面，提供了一种将包含多个邻接细胞的体外多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)通过以下制备用于运输的多细胞聚集体；
i)使所述多细胞聚集体与藻酸盐水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有聚集体的藻酸盐水凝胶，其中所述多细胞聚集体被截留或包封在所述藻酸盐水凝胶中；和
iii)将含有多细胞聚集体的藻酸盐水凝胶包装并密封在水密或气密容器中；和
(b)在10至30℃的温度下将步骤(a)的经包装的多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置，其中第一位置与第二位置之间的距离为至少1英里。
任选地，所述方法可以进一步包含：
(c)在所述第二位置处从所述藻酸盐水凝胶释放所述多细胞聚集体。
另一方面，提供了一种满足对包含多个邻接细胞的体外多细胞聚集体的订购或索求的方法，所述方法包含：接收对多细胞聚集体的订购或索求；和a)通过以下制备用于运输的多细胞聚集体；
i)使所述多细胞聚集体与藻酸盐水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有聚集体的藻酸盐水凝胶，其中所述多细胞聚集体被截留或包封在所述藻酸盐水凝胶中；和
iii)将含有多细胞聚集体的藻酸盐水凝胶包装并密封在水密或气密容器中；和
b)派送用于运输的步骤(a)的经包装的多细胞聚集体；或将步骤(a)的多细胞聚集体运输到在所述订购或索求中指定的位置。
任选地，在10至30℃的温度下将所述多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置，且第一位置与第二位置之间的距离为至少1英里。
又一方面，提供了一种将包含多个邻接细胞的体外多细胞聚集体储存至少24小时的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)通过以下制备用于储存的多细胞聚集体；
i)使所述多细胞聚集体与藻酸盐水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有聚集体的藻酸盐水凝胶，其中所述多细胞聚集体被截留或包封在所述藻酸盐水凝胶中；和
iii)将含有多细胞聚集体的藻酸盐水凝胶包装并密封在水密或气密容器中；和
(b)将步骤(a)的经包装的多细胞聚集体在10至30℃的温度下储存至少24小时。
任选地，所述方法可以进一步包含：(c)在储存后从所述藻酸盐水凝胶释放所述多细胞聚集体。
任选地，步骤(a)包含：在使所述多细胞聚集体与所述藻酸盐水凝胶形成聚合物接触之前，将所述多细胞聚集体置于所述容器中以用于运输、派送或储存。
或者，步骤(a)包含：在使所述多细胞聚集体与所述藻酸盐水凝胶形成聚合物接触之后，将所述多细胞聚集体置于所述容器中以用于运输、派送或储存。
任选地，所述容器是细胞培养器皿。
任选地，所述细胞培养器皿选自细胞培养管、细胞培养瓶、细胞培养碟或包含多个孔的细胞培养板。
任选地，包含多个孔的细胞培养板选自4孔、6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔细胞培养板。
任选地，所述水凝胶形成聚合物包含藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁或藻酸钠。
任选地，所述藻酸盐的量为0.5％(w/v)至5.0％(w/v)藻酸钙。
任选地，所述多细胞聚集体包含组织、细胞层、球状体、类器官或其任意组合。
任选地，所述多细胞聚集体包含异源细胞类型。
或者，所述多细胞聚集体包含同源细胞类型。
任选地，所述多细胞聚集体包含人细胞。
任选地，所述多细胞聚集体包含人脂肪来源的基质细胞(hasc)、人诱导多能干细胞(ipsc)来源的皮层神经元、人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)或人角膜基质成纤维细胞(hcsf)。
任选地，聚合由化学试剂引发。
任选地，所述化学聚合试剂是氯化钙。
另一方面，提供了一种包含多个邻接细胞的体外组织，其中所述组织被截留或包封在可逆交联藻酸盐水凝胶中，且所述经截留或包封的组织被包装在密封的水密或气密容器中。
任选地，所述水凝胶包含交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁或藻酸钠。
任选地，所述交联的藻酸盐为0.5％(w/v)至5.0％(w/v)藻酸钙。
任选地，所述多个邻接细胞形成细胞层、球状体、类器官或其任意组合。
任选地，所述容器是密封储存小瓶或运输管。
任选地，所述密封储存小瓶是微量离心管、离心管、冷冻小瓶、运输管或通用容器。
任选地，所述容器是细胞培养器皿。
任选地，所述细胞培养器皿选自包细胞培养管、细胞培养烧瓶、细胞培养碟或包含多个孔的细胞培养板。
任选地，包含多个孔的细胞培养板选自4孔、6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔细胞培养板。
任选地，所述多细胞聚集体包含异源细胞类型。
或者，所述多细胞聚集体包含同源细胞类型。
任选地，所述多细胞聚集体包含人细胞。
任选地，所述多细胞聚集体包含人脂肪来源的基质细胞(hasc)、人诱导多能干细胞(ipsc)来源的皮层神经元、人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)或人角膜基质成纤维细胞(hcsf)。
又一方面，提供了一种制备用于储存或从第一位置运输到第二位置的包含多个邻接细胞的体外组织的方法，所述方法包含以下步骤：
i)使所述组织与藻酸盐水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有组织的藻酸盐水凝胶，其中所述组织被截留或包封在所述藻酸盐水凝胶中；和
iii)将含有多细胞聚集体的藻酸盐水凝胶包装并密封在水密或气密容器中。
任选地，所述方法包含：在使所述组织与所述藻酸盐水凝胶形成聚合物接触之前，将所述组织置于所述容器中以用于储存或运输。
任选地，所述方法包含：在使所述组织与所述藻酸盐水凝胶形成聚合物接触之后，将所述组织置于所述容器中以用于储存或运输。
任选地，所述方法进一步包含：iii)将密封的容器从第一位置派送到第二位置，其中在10至30℃的温度下将所述多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置，且第一位置与第二位置之间的距离为至少1英里。
另一方面，提供了一种包含多个邻接细胞的多细胞聚集体，其中所述聚集体被截留或包封在可逆交联水凝胶中，且所述经截留或包封的聚集体被包装在密封的容器中。
任选地，所述水凝胶包含交联藻酸盐，其中所述水凝胶任选地包含交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁或藻酸钠。
任选地，所述交联的藻酸盐为约0.5％(w/v)至5.0％(w/v)藻酸钙。
任选地，所述多个邻接细胞形成组织、细胞层、球状体、类器官或其任意组合。
任选地，所述容器是细胞培养器皿。
任选地，所述细胞培养器皿选自细胞培养管、细胞培养瓶、细胞培养碟或包含多个孔的细胞培养板。
任选地，包含多个孔的细胞培养板选自4孔、6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔细胞培养板。
另一方面，提供了一种制备用于储存或从第一位置运输到第二位置的包含多个邻接细胞的多细胞聚集体的方法，所述方法包含以下步骤：
i)使所述多细胞聚集体与水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有聚集体的水凝胶，其中所述聚集体被截留或包封在所述水凝胶中；
其中将所述含有聚集体的水凝胶包装在容器中以用于储存或从第一位置运输到第二位置，且其中所述方法包含：将含有聚集体的水凝胶密封到容器中。
任选地，所述方法包含：在使所述多细胞聚集体与所述水凝胶形成聚合物接触之前，将所述多细胞聚集体置于所述容器中以用于储存或运输。
或者，所述方法包含：在使所述多细胞聚集体与所述水凝胶形成聚合物接触之后，将所述多细胞聚集体置于所述容器中以用于储存或运输。
任选地，所述方法进一步包含：将密封的容器从第一位置派送到第二位置。
另一方面，提供了一种将包含多个邻接细胞的多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)根据本文所述方法制备用于运输的多细胞聚集体；
(b)将步骤(a)的多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置；和任选地
(c)在所述第二位置处从所述水凝胶释放所述多细胞聚集体。
另一方面，提供了一种满足对多细胞聚集体的订购或索求的方法，所述方法包含以下步骤：
a)接收对多细胞聚集体的订购或索求；
b)根据本文所述方法制备用于运输的多细胞聚集体；和
c)派送用于运输的步骤(b)的多细胞聚集体；或将步骤(b)的多细胞聚集体运输到在所述订购或索求中指定的位置。
任选地，所述容器是细胞培养器皿。
任选地，所述细胞培养器皿选自细胞培养管、细胞培养瓶、细胞培养碟或包含多个孔的细胞培养板。
任选地，包含多个孔的细胞培养板选自4孔、6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔细胞培养板。
任选地，所述水凝胶包含藻酸盐。
任选地，所述水凝胶形成聚合物包含藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁或藻酸钠。
任选地，所述藻酸盐的量为约0.5％(w/v)至5.0％(w/v)藻酸钙。
任选地，所述多细胞聚集体包含组织、细胞层、球状体、类器官或其任意组合。
任选地，所述多细胞聚集体包含异源或同源细胞类型。
任选地，所述多细胞聚集体包含人细胞。
任选地，所述多细胞聚集体包含人脂肪来源的基质细胞(hasc)、人诱导多能干细胞(ipsc)来源的皮层神经元、人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)或人角膜基质成纤维细胞(hcsf)。
任选地，聚合由化学试剂引发。
任选地，所述化学聚合试剂是氯化钙。
任选地，在环境温度下将多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置。
在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包含”和“含有”及其变体是指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整体或步骤。
在本说明书的整个描述和权利要求中，单数涵盖复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，说明对象应被理解为既考虑复数又考虑单数。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整体、特性、化合物、化学部分或组应被理解为适用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
本文所引用的专利、科学和技术文献建立了提交时本领域技术人员可获得的知识。本文引用的已授权专利、已公布和未决专利申请以及其它出版物的全部公开内容通过引用并入本文，其程度如同明确地和单独地指出将每篇通过引用并入本文一样。在任何不一致的情况下，以本公开为准。
下面进一步详细描述本发明的各个方面。
附图说明
下面将参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：
图1示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，人脂肪来源的间充质基质细胞(hasc)在96孔板中储存细胞单层后的细胞恢复、存活力和形态。
图2示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，成熟皮层神经元在96孔板中储存和运送后的细胞恢复、存活力和形态。
图3示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)在96孔板中储存后的细胞恢复、存活力和形态。
图4示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，hasc来源的球状体在紧密密封的管中储存后的存活力。在图中，每个时间点的右手边一列对应于‘+水凝胶’。当球状体在储存于“-水凝胶”中后被铺板于组织培养塑料上时，没有看到细胞生长。
图5示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，hasc来源的球状体在96孔板中储存后的存活力。a)来自96孔板的单一孔。
图6示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，在紧密密封的管中的人角膜基质成纤维细胞(hasc)构建体的存活力和完整性。注意到在-水凝胶储存条件下没有看到活细胞保留。
图7示出了保存在96孔培养板中的真皮角质形成细胞上皮细胞的储存。人真皮角质形成细胞上皮细胞的存活力和形态在96孔培养板中被保存。
图8示出了保存在96孔培养板中的真皮成纤维细胞的储存和运送。人真皮成纤维细胞的存活力和形态在96孔培养板中被保存。
图9示出了保存在96孔培养板、384孔培养板和保存在96孔板中3d微支架中的hek-293细胞的储存和运送。hek-293和瞬时转染的hek-293细胞的药理学反应性被保存。
图10示出了人腹部皮肤活检样品在96孔板中的储存。在96孔板中的新鲜收集的腹部皮肤活检样品被保存。
图11示出了ipsc来源的成血管细胞(巨噬细胞祖细胞工厂)的储存。悬浮在藻酸钙水凝胶珠粒中的ipsc来源的成血管细胞被保存。
图12示出了人皮肤3d构建体的储存。人皮肤3d构建体在藻酸盐水凝胶保护下被保存。
图13示出了保存在96孔培养板中的结直肠癌类器官的储存。结直肠癌类器官在藻酸盐水凝胶保护下在96孔板中储存后存活力和形态被保存。
具体实施方式
下面描述本发明的几个不同方面。为了便于理解，它们被分别讨论。然而，在上下文允许的情况下，每一个所提供的定义和示例等同地应用于所有方面。
多细胞聚集体
提供了一种包含多个邻接或互连细胞的多细胞聚集体，其中所述聚集体被截留或包封在可逆交联水凝胶中，且所述经截留或包封的聚集体被包装在密封容器中。
先前已经显示，将单个细胞完全包封在藻酸盐水凝胶中可以在低温下保持它们的功能。然而，在多细胞聚集体中，每个细胞不完全包封在水凝胶中，因为每个细胞的至少一个表面(或表面的一部分)与另一个细胞(或基质或人工构建体)接触。在三维多细胞聚集体中，内部的一些细胞可能根本不被水凝胶包封，而朝向外部的那些细胞将被稍微包封。本发明人现在已经令人惊讶地显示，如本文所述的将多细胞聚集体包封或截留在水凝胶中，其中聚集体的每个细胞不被水凝胶本身完全且直接地包围，可用于有效地储存和/或运输多细胞聚集体，同时保持细胞形态、完整性和/或存活力。
术语“多细胞聚集体”和“聚集体”在本文中可互换地使用，除非上下文另有说明。聚集体是指例如细胞的球、簇、层等。
如本文所使用的，“多细胞聚集体”是指多个邻接或互连的细胞。多细胞聚集体可以由例如至少10个邻接细胞形成(其中每个细胞与聚集体内的至少一个其它细胞直接接触(换言之是触碰))。例如，聚集体可以包含至少10、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108或至少109等的邻接细胞。在优选实施例中，邻接细胞是互连的。
任选地，多细胞聚集体是体外多细胞聚集体(换言之，多细胞聚集体是分离的并且在其生物学范围之外)。
多细胞聚集体的细胞通常具有结构完整的细胞膜。已知数种测定细胞膜结构完整性的方法，包括碘化丙啶染色(参见以下实施例)。
在优选实施例中，多细胞聚集体中的细胞是有存活力的细胞或活细胞，或多细胞聚集体中的至少基本上所有细胞优选是活的(或有存活力的)。用于确定细胞是否是活的方法是本领域公知的。
如本文所使用的，“邻接”是指以形成细胞聚集体的方式彼此连接的细胞。当置于溶液如水凝胶形成聚合物溶液中时，邻接细胞保持聚集体形式。邻接细胞可以直接接触，例如其中它们以形成细胞聚集体的方式彼此粘附或触碰。或者，邻接细胞可以例如借助于基质、基底或支架(例如细胞外基质)的存在以形成细胞聚集体的方式间接连接，其中基质、基底或支架将邻接细胞连接到聚集体中。
如上所述，基质、基底或支架可以连接邻接细胞，以形成聚集体。术语“基质”、“基底”和“支架”在本文中可互换地使用，并且统称为聚集体内的“结构”。已经发现，可以通过将这样的结构封装在凝胶内来增强水凝胶的机械强度。所述结构还可以促进或维持聚集体的形成。所述结构可以是天然来源的或合成的。
在一个实施例中，所述结构可以是合成的或天然的聚合物。优选地，所述结构是可生物降解的。所述结构可以是例如包含聚乳酸(例如聚(乳酸-co-己内酯)(placl))、胶原或尼龙的聚合物。
在另一个实施例中，细胞通过细胞外基质(ecm)以形成多细胞聚集体的方式邻接。合适结构的另一个实例是用于3d细胞培养的
所述结构可以是尼龙网。这样的复合材料具有比藻酸盐凝胶更稳健并且在凝胶的储存或传送过程中较不可能破碎的优点。另一个益处是尼龙网可以缝合，从而允许凝胶通过缝线固定。尼龙网可以在凝胶内，部分在凝胶内和部分在凝胶外或在凝胶外(即在表面上)。尼龙网优选具有0.01-100μm的网目尺寸。优选地，它由合适的无毒材料制成，所述材料可以是可溶的或不可溶的。在优选的实例中，水凝胶为包含尼龙网的圆盘形式。优选地，尼龙网嵌入在圆盘内。
或者，聚集体可以是无结构的。具有或不具有结构的细胞培养的适当方法是本领域公知的。
在优选实施例中，邻接细胞是互连的。如本文所用，“互连”是指彼此直接接触并且例如通过细胞间连接(例如通过一个或多个细胞连接物(也称为细胞间桥))物理连接的细胞。细胞连接物由多蛋白复合物组成，其提供相邻细胞之间或细胞与细胞外基质之间的接触。细胞连接物在上皮组织中特别丰富。细胞连接物使得能够在相邻细胞之间进行通信。
多细胞聚集体可以是任何邻接细胞的组，例如，其可以是组织或器官(例如动物或植物组织或器官，或合成/人工组织或器官，即组织工程化组织或器官)的形式。
合适的动物组织或器官的实例包括皮肤、角膜、肌肉、肝脏和心脏组织或器官。这样的组织或器官可以直接从活体动物获得。用于从动物分离适当的多细胞聚集体的方法是本领域公知的。
合适的植物组织或器官(从活体植物中获得的)的实例包括源自内胚层、中胚层和外胚层胚芽层的细胞或组织、叶肉组织、木质部组织和韧皮部组织、叶、茎、根和生殖器官。用于从植物分离适当的多细胞聚集体的方法是本领域公知的。
合适的合成组织或器官的实例包括已经体外或离体产生或繁殖的任何细胞组织或器官。非限制性实例包括细胞球体、球状体、类器官或微组织。这些类型的聚集体通常使用细胞培养方法在三维中产生。这样的方法是本领域周知的。适当的方法的实例在以下实施例部分中提供。
本文所述的多细胞聚集体也可以包含多个邻接(互连)细胞，其中细胞是细胞片的形式(即一层或多层细胞，例如单层)，例如，已经体外或离体培养的细胞片。换言之，聚集体可以是平面的。非限制性实例会是包括角膜细胞片(例如单层角膜细胞)的多细胞聚集体。适当的方法的实例在以下实施例部分中提供。
在一个实施例中，多细胞聚集体可以附着到表面(例如，附着到容器如组织培养孔或组织培养瓶的表面)。例如，所述多细胞聚集体可包含粘附细胞，并且所述粘附细胞可粘附至容器的表面。适当的容器(如可密封容器)在本文其他处详细描述。在一个实施例中，多细胞聚集体包含在这样的表面上形成粘附层(例如单层、双层或多层聚集体)的细胞。
在一个实施例中，多细胞聚集体可以附着到它们在其中体外接种和/或生长的容器(例如培养器皿)的表面。
在一个特别的实施例中，多细胞聚集体包含多个邻接(例如互连)细胞，其中细胞形成组织、细胞层、球状体、类器官或其任意组合。
在一些实施例中，多细胞聚集体中的细胞全部是同一类型。例如，它们可以是脑细胞、肌肉细胞或心脏细胞。在其它实施例中，多细胞聚集体中的细胞全部来自同一谱系，例如全部是造血前体细胞。在一些实施例中，所述细胞是干细胞，例如，神经干细胞或胚胎干细胞。
因此，在一个实施例中，多细胞聚集体包含同源或异源细胞类型。
在实施例中，所述细胞是脂肪细胞、星形细胞、血细胞、血来源的细胞、骨髓细胞、骨肉瘤细胞、脑星形细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、心肌细胞、小脑颗粒细胞、软骨细胞、角膜细胞、真皮乳头细胞、胚胎癌细胞、胚胎干细胞、胚胎肾细胞、内皮细胞、上皮细胞、红白血病淋巴母细胞、成纤维细胞、胎儿细胞、胚种基质细胞、肝细胞、肠细胞、角化细胞、角膜细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞、淋巴母细胞、黑素细胞、系膜细胞、脑膜细胞、间充质干细胞、小神经胶质细胞、神经细胞、神经干细胞、神经母细胞瘤细胞、少突胶质细胞、少突神经胶质瘤细胞、口腔角质细胞、器官培养细胞、成骨细胞、卵巢肿瘤细胞、胰腺β细胞、周细胞、神经束膜细胞、根鞘细胞、施万细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、星形细胞、滑膜细胞、甲状腺癌细胞、绒毛滋养细胞、卵黄囊癌细胞、卵母细胞、精子和胚状体。
在一个实施例中，所述细胞是角膜细胞。例如，所述细胞可以是角膜干细胞，优选包括角膜缘上皮细胞，即可从角膜边缘处的角膜缘获得的干细胞和分化细胞的异源混合物。换言之，包含角膜干细胞的多细胞聚集体可以包含角膜干细胞和尚未完全定向为角膜上皮表型的细胞的混合物。
在另一个实施例中，细胞包括基质祖细胞，如分化或未分化形式的角膜成纤维细胞(角膜细胞)。优选地，这些角膜成纤维细胞从外周角膜缘或从角膜缘环获得。
在另一个实施例中，所述细胞是骨髓细胞。
在其他实施例中，所述细胞是软骨细胞。
在又一些实施例中，所述细胞是上皮细胞。
在一个实施例中，所述多细胞聚集体包含人脂肪来源的基质细胞(hasc)、人诱导多能干细胞(ipsc)来源的皮层神经元、人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)或人角膜基质成纤维细胞(hcsf)。
在另一个实施例中，所述多细胞聚集体包含人脂肪来源的基质细胞(hasc)、人诱导多能干细胞(ipsc)来源的皮层神经元、人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)、人角膜基质成纤维细胞(hcsf)、人角化细胞、人真皮成纤维细胞、hek-293细胞或人ipsc来源的成血管细胞。
优选所述细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施例中，所述细胞是鱼细胞。
合适的细胞类型的非限制性实例包括人细胞，或来自非人灵长类、啮齿类、兔、马、狗、猫、羊、牛、猪、鱼或鸟的细胞。
在本发明的上下文中，本文所述的多细胞聚集体被截留或包封在可逆交联水凝胶中。
如本文所使用的，术语“截留”是指聚集体被水凝胶物理捕获/捕捉，使得它不从水凝胶释放(除非例如交联逆转，使得水凝胶恢复成溶液)。聚集体可以借助被水凝胶完全包围而被截留，或者其可以借助大部分(但不是全部)聚集体被水凝胶包围而被捕获。在此语境中，“大部分”是指至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的聚集体(按体积计)被水凝胶包围。在此语境中，“完全包围”是指约100％的聚集体(按体积计)被水凝胶包围。术语“截留”特别与未结合/粘附到表面如容器的固体表面(如本文别处所述)的聚集体有关。
水凝胶可以是覆盖/包围至少大部分聚集体的涂层，以将聚集体捕获在水凝胶中。
术语“包封”是指将多细胞聚集体封在水凝胶中。在未结合的多细胞聚集体(即，未结合/粘附至容器的表面如固体表面的聚集体(如本文别处所述)的情况下，多细胞聚集体在被水凝胶完全包围时为被水凝胶“包封”。在结合/粘附至固体表面的多细胞聚集体的情况下，当聚集体的至少大部分未结合的(“游离”)外表面积被水凝胶包围时，聚集体被认为是被“包封”。换言之，在此情况下，包封是指将多细胞聚集体的可用表面封在水凝胶中。“大部分”是指至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的可用聚集体外表面积被水凝胶覆盖。
短语“未结合(“自由”)外表面积”和“可用聚集体外表面积”是指聚集体的不与固体表面直接接触的外表面(边缘)。这在本文中也被称为“可用表面”。
水凝胶可以是覆盖/包围至少大部分聚集体可用表面的涂层，以将聚集体包封在水凝胶中。术语“涂层”和其等同物在本文中用于描述水凝胶层。水凝胶涂层可以独立于聚集体形成，然后以包封或截留聚集体的方式放置在聚集体上方(类似于覆盖层)。在此情况下，水凝胶涂层可以包含独立于(即，空间上独立于)聚集体形成的交联海藻酸盐层。然后可以将水凝胶涂层放置在聚集体的表面上(例如表面结合的单层、双层或多层聚集体)，其中水凝胶层涂覆聚集体但不是原位交联的。或者，水凝胶涂层可以原位(即，在聚集体存在下)形成。
在聚集体包含一个或多个细胞层的情况下，应注意，聚集体可以通过聚集体的底侧对仅固体表面的粘附而附着到固体表面(例如，如本文所述的容器的固体表面)。换言之，在具有多个细胞层的聚集体中，其可以是仅一个细胞层(在聚集体的底侧)粘附到固体表面，并且借助于这种粘附，聚集体作为整体附着到固体表面。也可以使用本文所述的方法用水凝胶包封或涂覆这样的聚集体。
适当的情况下，一个或多个多细胞聚集体可以被截留或包封在单个水凝胶内。例如，水凝胶可以截留或包封两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个聚集体。
在本发明的一些实施例中，被截留或包封在水凝胶中的聚集体中细胞的浓度为约10至107个细胞/ml水凝胶溶液(例如在细胞培养条件下或在环境条件下的藻酸盐凝胶)。
如本文所用的，“可逆交联水凝胶”是指通过可逆交联(即，交联可以逆转以使得水凝胶恢复为溶液)形成的水凝胶。交联的逆转使得被截留或包封的多细胞聚集体可以从水凝胶被释放(例如在使用它们时/运输或储存完成后)。可逆交联水凝胶的实例是本领域周知的。因此，合适的水凝胶易于被本领域技术人员识别。
本文所指的水凝胶包含具有交联或网络结构或基质的水凝胶形成聚合物；和间隙液体。水凝胶能够抑制或防止包封或截留在其中的聚集体中的细胞分化。优选地，水凝胶是半渗透的。
术语“水凝胶形成聚合物”是指能够在适当条件下形成交联或网络结构或基质的聚合物，其中间隙液体和多细胞聚集体可以保留在这样的结构或基质内。水凝胶将包含内孔。
交联或网络结构或基质的形成的引发可以通过任何合适的方式，这取决于聚合物的性质。
聚合物将通常是亲水性聚合物。它将能够在含水液体中膨胀。在本发明的一个实施例中，水凝胶形成聚合物是胶原。在此实施例中，胶原水凝胶包含在间隙液体和被截留或包封的多细胞聚集体周围形成连续支架的胶原原纤的基质。通过加入稀碱可引发溶解的胶原聚合/聚集，以形成交联胶原原纤的胶凝网络。原纤的胶凝网络支撑溶解胶原纤维的最初体积，从而保留间隙液体。生产这样的胶原凝胶的通常方法是本领域所周知的(例如wo2006/003442、wo2007/060459和wo2009/004351)。
用于胶原凝胶中的胶原可以是任何原纤形成胶原。
原纤形成胶原的实例是i、ii、iii、v、vi、ix和xi型。凝胶可以包含全部是一种胶原类型或不同类型胶原的混合物。优选地，凝胶包含i型胶原或由其组成。在本发明的一些实施例中，凝胶排他地或基本上由胶原原纤形成，即胶原原纤是凝胶中仅有或基本上仅有的聚合物。在本发明的其它实施例中，胶原凝胶可以额外地包含其它天然形成的聚合物，例如丝、纤连蛋白、弹性蛋白、甲壳质和/或纤维素。通常，非胶原的天然形成的聚合物的量将小于凝胶的5％，优选小于4％、3％、2％或1％(wt/wt)。凝胶中也可以存在类似量的非天然聚合物，例如肽两亲物、聚内酯、聚交酯、聚甘油栓(polyglycone)、聚己内酯和/或磷酸盐玻璃。
在本发明的一些实施例中，水凝胶形成聚合物是藻酸或金属离子的藻酸盐。优选地，所述金属是1族金属(例如，藻酸锂、藻酸钠或藻酸钾)或2族金属(例如，藻酸钙、藻酸镁、藻酸钡或藻酸锶)。优选地，聚合物是藻酸钙或藻酸钠或藻酸锶，最优选藻酸钙。
决定藻酸盐凝胶渗透性的一个因素是凝胶中的甘露糖醛酸(m)和古洛糖醛酸(g)含量。具有高m:g比的凝胶具有小的本征孔径。必要时可以调节m:g比以增加凝胶的渗透性，以改善被截留或包封的多细胞聚集体的存活力。在一些实施例中，藻酸盐凝胶的g含量是0-30％。在一些实施例中，m含量优选是30-70％。在一些优选实施例中，凝胶是m含量为50-70％或60-70％的藻酸盐凝胶且凝胶额外地包含孔增强剂(本文中也称为致孔剂)。在一些实施例中，孔径增加剂是羟乙基纤维素(hec)。在此实施例中，可以将hec用于水凝胶的制备中，然后在使用前将其完全地、基本上完全地或部分地从水凝胶中除去。水凝胶中hec的优选浓度(在制备期间)包括0.5-3.0％hec，更优选1.0-2.5％，甚至更优选1.2-2.4％hec。在一些优选实施方案中，水凝胶中hec的浓度(在制备期间)是1.2％或2.4％。(浓度以重量％给出)。hec可以作为胶团悬浮在凝胶中。可以通过在合适的含水溶剂或缓冲液例如组织培养基中洗涤水凝胶来实现hec的去除。
在本发明的一些实施例中，水凝胶形成聚合物是藻酸盐。在一些实施例中，可以首先用本文所述的不同的水凝胶形成聚合物涂覆多细胞聚集体，然后再涂覆藻酸盐。在其它实施例中，水凝胶形成聚合物是藻酸盐和另一种水凝胶形成聚合物的混合物。在一些实施例中，对藻酸盐进行改性(例如用肽)。
在本发明的其它实施例中，水凝胶形成聚合物是交联的丙烯酸基(例如聚丙烯酰胺)聚合物。
在进一步的实施例中，水凝胶形成聚合物是可交联的纤维素衍生物、羟基醚聚合物(例如泊洛沙姆)、果胶或天然树胶。
在本发明的一些实施例中，水凝胶在生理温度下不是热可逆的，即，水凝胶的溶胶-凝胶转变不能在0-40℃的温度下实现。
可以通过改变水凝胶中水凝胶形成聚合物的浓度来改变水凝胶的结构。所述结构影响水凝胶中聚集体的存活力，细胞分化速率以及凝胶的稳健性及其处理性能。水凝胶中水凝胶形成聚合物的优选浓度是0.2-5％(聚合物的重量比间隙液体的体积)，并且包括例如0.2-0.4％、0.4-0.5％、0.5-0.7％、0.7-1.1％、1.1-1.3％、1.3-2.2％、2.2-2.6％、2.6-3.0％、3.0-3.5％、3.5-4.0％、4.0-4.5％和4.5-5.0％(或其任意组合，例如0.2-0.5％、0.2至0.7％等)。
在一个实施例中，非凝胶化水凝胶溶液的粘度最高至500mpa.s，任选地，非凝胶化水凝胶溶液的粘度为5至200mpa.s(优选5至100mpa.s)。
在其它实施例中，水凝胶中水凝胶形成聚合物的浓度高于0.25％、0.3％、0.4％、0.5％或0.6％。在其它实施例中，水凝胶中水凝胶形成聚合物的浓度低于5％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.6％、2.4％、1.5％、1.4％、1.3％或1.2％。在一些优选实施例中，水凝胶中水凝胶形成聚合物的浓度为约0.3％、约0.6％或约1.2％。在一些特别优选的实施例中，水凝胶中水凝胶形成聚合物的浓度为约1％。在本发明的一些特别优选的实施例中，水凝胶由约1％藻酸钠或由约1％藻酸钙形成。
在本发明的一些实施例中，使用包含多价金属阳离子的化合物，例如使用氯化钙，促进水凝胶的胶凝化。特别地，可以使用氯化钙(例如50-200mm氯化钙，优选75-120mm氯化钙)使藻酸盐水凝胶胶凝化。
在本发明的其它实施例中，使用替代的金属氯化物，例如氯化镁或氯化钡或氯化锶。或者，可以使用其它多价阳离子，例如la3+或fe3+。
在本发明的一些其它实施例中，凝胶(优选藻酸盐凝胶)额外地包含co2。这可有助于细胞在储存后特别是在冷藏条件下储存后的存活力。本发明进一步提供了一种制备水凝胶的方法，所述方法包含在选自由镁盐和钙盐组成的组的第2族金属盐的存在下使水凝胶形成聚合物胶凝化的步骤。
在本发明的一些实施例中，水凝胶包含交联的藻酸盐。例如，水凝胶可以包含交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁或藻酸钠。在一个特别的实施例中，所述交联藻酸盐为约0.5％(w/v)至约5.0％(w/v)藻酸钙。例如，所述交联藻酸盐可以为约1.0％(w/v)至约2.5％(w/v)、约1.5％(w/v)至约2.0％(w/v)藻酸钙，或其间的任意范围。
间隙液体可以是聚合物可在其中溶解且聚合物可在其中胶凝化的任何液体。通常，其将是含水液体，例如含水缓冲液或细胞培养基。所述液体可以含有抗生物质。优选地，水凝胶是灭菌的，即无菌的。优选地，所述液体不含有动物来源的产物，例如胎牛血清或牛血清白蛋白。
如本文所使用的，术语“抑制或防止细胞分化”是指水凝胶内所含多细胞聚集体内所有细胞或大部分细胞内的细胞分化速率(对于给定温度)处于比在相同的给定温度下在适当的组织培养条件下保持且不被截留或封装在水凝胶中的相等多细胞聚集体中的对照细胞的细胞分化速率更低的水平。大部分可以是至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
水凝胶可以以任何合适的尺寸生产。然而，为了易于运输，水凝胶优选长度小于1000mm，优选长度小于500、250、100或50mm。水凝胶的厚度通常是0.1-50mm，优选0.1-10mm、0.5-5mm、1.0-2.0mm，更优选约1.5mm。
本发明的水凝胶的体积优选是0.2-100ml，更优选0.2-50ml、0.2-25ml或0.2-10ml。在一些优选实施例中，本发明的水凝胶的体积是0.4-5ml，优选0.4-4ml，更优选0.4-3ml。在本发明的一些实施例中，所述体积可以是约420μι或约2ml。
在本发明的一些实施例中，水凝胶是薄层、圆盘或片的形式。本文显示这样的形式的水凝胶在低温储存期间增强细胞存活力。优选地，凝胶是圆盘或薄层的形式。圆盘可以例如具有5-50mm或10-50mm、优选10-30mm、更优选15-25mm、最优选约19mm的直径。薄层、圆盘或片的厚度通常是0.1-5mm，优选0.5-2.0mm，更优选约1.0或1.5mm，或约1、2、3、4或5mm。在一些实施例中，圆盘形式的水凝胶的最终体积为优选200μι至1ml，优选200-600μι，优选300-500μι，更优选400-450μι。
关于本发明的圆盘，优选的水凝胶聚合物浓度是约1.2％，这是由于此浓度提供增加的结构稳定性。优选地，水凝胶(例如圆盘)是未压缩的水凝胶，即它没有受到轴向压缩力。
在本发明的上下文内，本发明的被水凝胶截留或包封的多细胞聚集体可以被包装在密封容器中。
如本文使用的，“密封容器”是指可以保持密封以防止气体或液体连续流动的容器。例如，密封容器可以是水密或气密容器，例如塑料容器。适当的密封容器的非限制性实例包括密封的小瓶或冷冻小瓶或组织培养瓶，任选地与合适的培养基(例如细胞培养基)一起。在其它实施例中，可以将水凝胶容纳在密封袋中，任选地具有受控的co2水平。
在一个实施例中，密封容器是细胞培养器皿。任选地，所述细胞培养器皿选自细胞培养管、细胞培养瓶、细胞培养碟或包含多个孔的细胞培养板。例如，细胞培养板可以选自4孔、6孔、8孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔、1536孔细胞培养板。适当的细胞培养器皿是本领域周知的。
可以使用盖(例如，螺旋装配盖)或另一种方式(例如，粘附膜或胶带等)密封容器。
制备用于储存或运输的多细胞聚集体的方法
本发明还提供了一种制备用于储存或从第一位置运输到第二位置的包含多个邻接细胞的多细胞聚集体的方法。所述方法包含以下步骤：
i)使所述多细胞聚集体与水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有聚集体的水凝胶，其中所述聚集体被截留或包封在所述水凝胶中；
其中将所述含有聚集体的水凝胶包装在用于储存或从第一位置运输到第二位置的容器中，且其中所述方法包含：将含有聚集体的水凝胶密封到容器中。
任选地，在本方法的步骤i)之前将聚集体放置在容器内，例如可以使水凝胶形成聚合物与多细胞聚集体接触，同时将多细胞聚集体定位于适合于储存或运输的容器内。在此实施例中，可以将多细胞聚集体的邻接细胞放置到容器中(例如接种到容器中)，任选地其中细胞可以粘附至容器(例如在容器中形成粘附层)。
或者，可以在本方法的步骤(i)之后将聚集体放置在容器内，例如在将多细胞聚集体放置在适合于储存或运输的容器内之前，可以使水凝胶形成聚合物与多细胞聚集体接触(和可选地按步骤ii)聚合)。
任选地，所述方法包括步骤iii)将用于运输的密封的容器从第一位置派送到第二位置。
可以使用任何适合的方式使多细胞聚集体与水凝胶形成聚合物接触。例如，可以将多细胞聚集体与含有水凝胶形成聚合物的溶液混合(在聚合/聚集之前或在水凝胶形成聚合物交联之前)。
可以同时在可密封的容器内使多细胞聚集体与水凝胶形成聚合物接触(以使得例如一旦形成水凝胶，可以将容器密封以备储存和/或运输)，或可以在将聚集体放置在可密封的容器中之前使其与水凝胶形成聚合物接触。合适的容器在本文别处描述。
所述方法然后包含：使所述聚集体-聚合物聚合以形成可逆交联的含有聚集体的水凝胶，其中所述聚集体被截留或包封在所述水凝胶中。使聚集体-聚合物聚合以形成可逆交联的含有聚集体的水凝胶的方法是本领域周知的，且根据使用的聚合物而不同。例如，藻酸盐溶液的聚合(以形成本发明的藻酸盐水凝胶)可以由化学剂如氯化钙引发。
如本文使用的，术语使水凝胶“聚合”或“胶凝化”可互换地用于指水凝胶形成聚合物从液体到水凝胶的状态变化。
水凝胶在适当的细胞相容条件下，即对细胞存活力无害或不明显有害的条件下凝胶化。
在一些实施例中，在cgmp(现行优良制造规范)条件下制备水凝胶。
为了在水凝胶中储存、运输或运送细胞，水凝胶必须适当地包装。因此，本发明的方法包含：将含聚集体的水凝胶包装在容器中，以用于存储或从第一位置运输到第二位置，和将容器密封。合适的容器已经在本文别处描述。
含聚集体的水凝胶可以与密封/可密封容器中的适当介质接触(例如，完全或部分浸在其中)。合适的介质包括细胞或组织培养基，例如补充的dmem培养基。
所述方法可以任选地包含：将用于运输的密封的容器从第一位置派送到第二位置。如本文所使用的，“派送”是指释放容器以用于运输(例如，将容器释放给邮递员以运输/递送到预期的目的地)。因此，派送本身不包括将密封容器运输到第二个位置。
运输/满足订购聚集体的方法
本发明进一步提供了一种将包含多个邻接细胞的多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置的的方法。所述方法包含以下步骤：
(a)根据本文其它处所述制备方法制备用于运输的多细胞聚集体；
(b)将步骤(a)的多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置；和任选地
(c)在所述第二位置处从所述水凝胶释放所述多细胞聚集体。
此外，还提供了一种满足对多细胞聚集体的订购或索求的方法，所述方法包含以下步骤：
a)接收对多细胞聚集体的订购或索求；
b)根据本文其它处所述制备方法制备用于运输的多细胞聚集体；
c)派送用于运输的步骤(b)的多细胞聚集体；或将步骤(b)的多细胞聚集体运输到在所述订购或索求中指定的位置。
可以以任何合适的方式，例如通过互联网、电子邮件、短信、电话或邮寄接收订购或索求。
本发明别处所述的方面(例如合适的容器、水凝胶聚集体、聚合剂)在此同样适用。
本发明的聚集体可以在水凝胶(和密封容器)内通过任何合适的方式运输，例如通过邮递或快递，其可以包括通过汽车方式运输，例如通过汽车、货车、卡车、摩托车、飞机等。优选地，运输是通过邮递或快递进行的。
第二位置优选地是远离第一位置的位置，例如，距离第一位置至少1英里、优选大于5英里。
从第一位置运输到第二位置可以花费至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时、至少24小时等。
可以在-80℃至45℃范围的温度下，优选在4至45℃下，在水凝胶(和密封容器)内储存或运输聚集体。在一个实施例中，在环境温度下将多细胞聚集体从第一位置运输到第二位置。
在一些实施例中，水凝胶(和密封容器)内的聚集体在细胞培养条件(例如约37℃，约5％co2和约95％湿度)下储存或运输。在一些实施例中，它们在冷藏条件下储存或运输，例如4-6℃，优选约4℃。在特别的实施例中，当储存或运输时将它们冷冻(定义为2-8℃(eu药典))。在另一个实施例中，它们被冷(定义为8-15℃)储存或运输。
在其它实施例中，它们在环境条件下储存或运输，例如10-25℃，优选15-20℃。在一些实施例中，环境温度可以最高至30℃(即10-30℃)，或甚至最高至40℃。在其它实施例中，它们在约37℃下储存或运输。
在一些实施例中，它们在受控室温(crt)(定义为15-25℃)下储存或运输。它们可以冷地或在crt下(即8-25℃)储存或运输。
在其它实施例中，它们在低温(即低于约35℃，通常在0至32℃的范围内)下储存或运输。在一个实施例中，它们在crt至32℃(即15-32℃)下储存或运输。在另一个实施例中，它们在crt或最高至32℃(即8-32℃)下冷储存或运输。
在本发明的一些实施例中，将包含多细胞聚集体的水凝胶在储存和/或运输之前进行冻结。这可以延长多细胞聚集体的细胞在解冻后存活的时间和/或增加可用的运送时间。因此，水凝胶可以以这种方式用作后冷冻保护剂。例如，可以将包含聚集体的水凝胶的温度降低至低于0℃、低于-15℃或低于-80℃。包含多细胞聚集体的水凝胶可以进行或不进行除霜或解冻，即在储存和/或运输期间优选以缓慢、受控或不受控的升温速率将其温度升高到高于0℃。在其它实施例中，本发明的水凝胶不进行冷藏或冻结。
其中保留有多细胞聚集体的水凝胶可以储存和/或运输最多至10或20周。优选地，将聚集体在从水凝胶中释放之前储存在水凝胶中最多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。更优选地，将聚集体在从水凝胶中释放之前储存在水凝胶中最多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。
本文所指的水凝胶是一种可以从中释放包含多个邻接细胞的多细胞聚集体的水凝胶。换言之，在保存或储存或运输其中包含的多细胞聚集体之后，水凝胶能够被解离，从而允许释放或去除先前保留在其中的所有或基本上所有的多细胞聚集体(或从聚集体去除解离的水凝胶，所述聚集体可例如粘附至合适的容器如细胞培养板的表面。
在适当的细胞相容条件下，即对细胞和/或细胞膜的完整性无害或不显著有害的条件下，解离水凝胶。
优选地，水凝胶通过化学分解或溶解而解离。例如，藻酸盐凝胶可以在合适的藻酸盐溶解缓冲液(例如0.055m柠檬酸钠，0.15mnacl，ph6.8)中分解。
优选地，多细胞聚集体中至少50％、60％或70％的细胞在储存后保持存活，更优选至少80％、85％、90％或95％的细胞在储存后保持存活。存活力可以通过台盼蓝拒染试验或其他类似方法来评价。其他类似方法包括mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)试验和提取后细胞集落形成检查。
储存多细胞聚集体的方法
又一方面，提供了一种将包含多个邻接细胞的体外多细胞聚集体储存至少24小时的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)通过以下制备用于储存的多细胞聚集体：
i)使所述多细胞聚集体与藻酸盐水凝胶形成聚合物接触；
ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含有聚集体的藻酸盐水凝胶，其中所述多细胞聚集体被截留或包封在所述藻酸盐水凝胶中；和
iii)将含有多细胞聚集体的藻酸盐水凝胶包装并密封在水密或气密容器中；和
(b)将步骤(a)的经包装的多细胞聚集体在10至30℃的温度下储存至少24小时。
其中保留有体外多细胞聚集体的水凝胶可以储存最多至10或20周。优选地，将聚集体储存在水凝胶中最多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周之后再从水凝胶中释放。更优选地，将聚集体储存在水凝胶中最多至1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之后再从水凝胶中释放。
在一些实施例中，水凝胶(和密封容器)内的聚集体在细胞培养条件(例如约37℃，约5％co2和约95％湿度)下储存。在一些实施例中，它们在冷藏条件下储存，例如4-6℃，优选约4℃。在特别的实施例中，当储存时将它们冷动(定义为2-8℃(eu药典))。在另一个实施例中，它们被冷(定义为8-15℃)储存。
在其它实施例中，它们在环境条件下储存，例如10-25℃，优选15-20℃。在一些实施例中，环境温度可以最高至30℃(即10-30℃)，或甚至最高至40℃。在其它实施例中，它们在约37℃下储存或运输。
在一些实施例中，它们在受控室温(crt)(定义为15-25℃)下储存。它们可以冷地或在crt下(即8-25℃)储存。
在其它实施例中，它们在低温(即低于约35℃，通常在0至32℃的范围内)下储存。在一个实施例中，它们在crt至32℃(即15-32℃)下储存。在另一个实施例中，它们在crt或最高至32℃(即8-32℃)下冷储存。
除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，singleton和dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology,2ded.,johnwileyandsons,ny(194)；以及hale和marham,theharpercollinsdictionaryofbiology,harperperennial,ny(1991)为本领域技术人员提供了本发明中所用许多术语的通用词典。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施本发明，但本文描述了优选的方法和材料。因此，下面紧接着定义的术语通过参考说明书整体进行更全面的描述。此外，如本文所用，单数术语“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。除非另有说明，核酸以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。应当理解，本发明不限于所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以根据本领域技术人员使用它们的环境而变化。
本发明的方面通过以下非限制性实施例来说明。
实施例
实施例1：材料和方法
在培养器皿中细胞层的保存
用标准方案培养人脂肪来源的基质细胞(hasc)、人诱导多能干细胞(ipsc)来源的皮层神经元，和人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)并在保存前构建单层。将培养板从标准培养条件下移出，并使其平衡至室温，然后移出用过的培养基，并用300μl培养基(-水凝胶对照)替换，或用300l1％(w/v)藻酸钙复合物涂覆细胞。简言之，将稀释在培养基中的1％(w/v)藻酸钠施用于细胞，然后用0.1m氯化钙使凝胶交联20分钟。所有制备在室温下进行。用培养基洗涤5分钟后，用粘附膜密封培养板，然后储存在15℃的控温孵化器中或15-25℃的受控室温(crt)包装中。在储存之后，使用300μl0.1m柠檬酸三钠溶解凝胶并用培养基替换，然后返回到标准培养条件。
紧密封闭管中球状体和组织的保存
将hasc来源的球状体和人角膜基质成纤维细胞(hcsf)来源的组织构建体分别封装在1.2和2.4％(w/v)藻酸钙圆盘中然后储存在含有培养基的紧密密封管中。将-水凝胶对照悬浮于不具有藻酸盐水凝胶的培养基中。简言之，将球状体和组织构建体悬浮在藻酸钠中，然后使用0.102m氯化钙使凝胶交联8分钟。然后将凝胶置于2ml装有1.5ml培养基的冷冻小瓶中，然后储存在冰箱(4℃)或温度受控的孵化器中(15℃)。储存后，使用0.1m柠檬酸三钠溶解凝胶并将球状体和组织构建体置于培养基中，然后恢复到标准培养条件。
培养器皿中球状体的保存
如2.1所述，将hasc来源的球状体悬浮于1％(w/v)藻酸钠中，然后在96孔培养板中凝胶化。将培养板密封并在15℃下储存在温度受控的孵化器中，然后进行凝胶溶解并恢复到标准培养条件。-水凝胶对照由填充有300μl培养基的孔组成。
存活力恢复的评价
在储存并恢复到标准培养条件后，评价活细胞恢复、细胞存活力和细胞形态。使用alamarblue代谢活性计算存活细胞数，并给出相对于未储存对照的％活细胞恢复。通过钙黄绿素-am/乙啡啶同型二聚体-1(活/死)染色来评价存活力和形态，并通过荧光显微镜成像。
实施例2：细胞单层的板内保存
保存在96孔培养板中的人脂肪来源的间充质干细胞(asc)的储存
图1示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，人类脂肪来源的间充质基质细胞(hasc)在96孔板中储存细胞单层后的细胞恢复、存活力和形态。将hasc接种在96孔板中并培养24小时。储存前，除去培养基并用300μl培养基(-水凝胶)或300μl藻酸钙水凝胶复合物(+水凝胶)替换，然后将培养板密封并在15℃下储存(培养板示于a中)。储存3天后，将培养板恢复到标准培养条件下2小时，然后通过alamarblue代谢活性试剂评价％活细胞恢复(b)，并通过钙黄绿素-am(活指示剂；绿色)/ethd-1(死指示剂；红色)染色评价存活力和形态(c)。在没有藻酸盐水凝胶保护的hasc的恢复在实验装置之间高度可变的情况下，用藻酸盐水凝胶保护维持了asc单层的存活力和完整性。在藻酸盐水凝胶保护下以相同的方式制备hasc，并储存延长的时间(1和2周)，然后将培养板恢复到标准培养条件过夜(d)。即使在延长的储存期间，也观察到良好的活细胞恢复水平，并且细胞表现出标准的纺锤形形态。结果表示为与未储存培养相比的％细胞恢复的平均值±sd。
保存在96孔培养板中的人ipsc来源的皮层神经元的储存和运送
图2示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，成熟皮层神经元在96孔板中储存和运送后的细胞恢复、存活力和形态。将人ipsc来源的分化的神经元(成熟31-36天)在具有300μl神经维持培养基(-水凝胶)或涂覆有300μl藻酸钙水凝胶复合物(+水凝胶)的密封96孔板中储存和运送。在15℃下过夜储存后，将培养板在15-25℃的受控室温(crt)包装中返回运送(总储存时间：3天；到达时的温度：19℃)。将培养板恢复到标准培养条件5天，然后通过alamarblue评价活细胞恢复(a)。随后用钙黄绿素-am(活指示剂；绿色)和乙啡啶同型二聚体-1(死指示剂；红色)染色细胞(b)。没有藻酸盐-水凝胶保护的储存和运输导致存活细胞数的显著损失，而当培养物用藻酸盐涂覆时，细胞恢复被保持。此外，培养物保持其形态和轴突连接，这表明藻酸盐水凝胶能够在室温储存期间保护细胞，并保护细胞免受运输期间诱发的机械应力。结果表示为与非储存培养物相比的％细胞恢复的平均值±sd。
保存在96孔培养板中的人肾近端小管细胞单层的储存
图3示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，人原代肾近端小管上皮细胞(hptc)在96孔板中储存后的细胞恢复、存活力和形态。将来自2个供体的hptc接种在96孔板中并培养7天达到汇合。将细胞在15℃下在具有300μl培养基(-水凝胶)或涂覆有300μl藻酸钙水凝胶复合物(+水凝胶)的密封96孔板中储存3或5天，然后恢复到标准培养条件。24小时后，没有藻酸盐水凝胶保护，几乎没有附着存活细胞的证据(a)。相反，用藻酸盐水凝胶覆盖的培养物显示相当大数目的存活细胞的恢复。在3-4天(对于3天储存的细胞)和7-8天(对于5天储存的细胞)的恢复培养期后，培养物恢复了全％细胞恢复(b)，如通过alamarblue代谢活性试验评价的。恢复的hptc培养物形成具有高％存活力的紧密上皮培养物，如通过钙黄绿素-am(活指示剂；绿色)和乙啡啶同型二聚体-1(死指示剂；红色)染色所评价的。结果表示为与未储存培养物相比的％细胞恢复的平均值±sd。
保存在96孔培养板中的真皮角质形成细胞上皮细胞的储存
图7示出了96孔培养板中的人真皮角质形成细胞上皮细胞的存活力和形态的保存。将来自3个供体的角质形成细胞接种在96孔板中并培养，直到它们近汇合。然后用300μl藻酸钙水凝胶复合物覆盖细胞并在15℃下储存5天。除去凝胶后，将细胞恢复到标准培养条件过夜，并通过活/死(cam/ethd-1)染色和荧光显微术评价存活力和形态。细胞在储存后保持高细胞存活力和正常形态。
保存在96孔培养板中的真皮成纤维细胞的储存和运送
图8示出了96孔培养板中的人真皮成纤维细胞的存活力和形态的保存。将来自3个供体的真皮成纤维细胞接种在96孔板中并培养，直到它们近汇合。然后用300μl藻酸钙水凝胶复合物覆盖细胞并在15℃下储存5天。除去凝胶后，将细胞恢复到标准培养条件过夜，并通过mtt试验(a)和活/死(cam/ethd-1)染色和荧光显微术(b)评价存活力和形态。细胞在储存后保持高细胞存活力和正常形态。
保存在96孔培养板、384孔培养板和96孔板中的3d微支架中的hek-293细胞的储存和运送
图9示出了hek-293细胞和瞬时转染的hek-293细胞的药理学反应性的保存。将hek-293细胞接种在96孔板或384孔板中24小时，然后用藻酸钙复合物覆盖。然后将细胞在受控室温下运送到遥远的位置(大于1英里)，并在储存5天后除去凝胶。将细胞恢复到标准培养条件过夜，然后用基于环磷腺苷应答元素的荧光素酶试验(a)并用基于钙通量的flipr试验(b)评价细胞对佛司可林的药理学应答。ec50值在未储存和未储存的细胞之间相似，表明没有功能损失。在封装、储存和运送超过5天之前，还用编码ddr1激酶序列的cdna瞬时转染hek-293细胞。在恢复到标准培养条件过夜后，用dasatinib处理细胞，并通过bret评价配体结合活性。细胞保留cdna的瞬时表达并显示与dasatinib相当的ec50。
实施例3：细胞来源的类器官、组织和球状体的保存
悬浮于冷冻小瓶中的人asc球状体的储存
图4示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，hasc来源的球状体在紧密密封的管中储存后的存活力。由5×104hasc组成的球状体培养24小时，然后悬浮于储存介质(-水凝胶)中或包封于1.2％(w/v)藻酸钙(+水凝胶)中。将球状体置于含有储存介质的紧密密封的小瓶中并在4℃下储存72小时。在从储存中释放后评价球状体的存活力，然后返回到标准培养条件。a：嵌入在藻酸盐中的hasc球体的图像；b：储存后球状体的钙黄绿素-am/乙啡啶同型二聚体-1(活/死)染色；c：在恢复到标准培养条件下24或72小时后球状体的相对代谢活性；d：培养72小时后储存的球状体的图像。没有包封，球状体出现溶胀，并且在返回到标准培养条件后不能附着和恢复代谢活性。藻酸盐包封阻止了这一点，并保持了hasc来源的球状体的存活力和完整性。结果表示为平均值±sd。
保存在96孔培养板中的asc球状体的储存
图5示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，hasc来源的球状体在96孔板中储存后的存活力。由7×104hasc组成的球状体培养24小时，然后悬浮于储存介质(-水凝胶)中或包封于密封96孔板中的藻酸钙(+水凝胶)中(如a中所示)。将培养板在15℃下储存7天，然后恢复到标准培养条件，而不除去藻酸盐水凝胶。培养24小时后，如钙黄绿素-am(活指示剂；绿色)和乙啡啶同型二聚体-1(死指示剂；红色)染色(b)所评价的，未包封的那些球状体显示出非常差的存活力。相反，具有藻酸盐保护的球状体保持存活。
人角膜基质成纤维细胞来源的组织构建体的储存
图6示出了在具有或不具有藻酸盐水凝胶保护的情况下，在紧密密封的管中的人角膜基质成纤维细胞(hcsf)构建体的存活力和完整性。将hcsf来源的组织构建体悬浮于储存介质(-水凝胶)中或包封于藻酸钙(+水凝胶)中。将组织置于含有储存介质的紧密密封管中，并在15℃下储存72小时。通过钙黄绿素-am/乙啡啶同型二聚体-1(活/死)染色来评价组织在从储存释放后的存活力。没有包封，不能鉴定出活细胞，并且总细胞数低，但在储存期间包封维持了细胞存活力和组织完整性。
人腹部皮肤活检样品在96孔板中的储存
图10示出了在96孔板中新鲜收集的腹部皮肤活检样品的保存。将新鲜的皮肤活检样品分离，解剖，并置于96孔板中，然后用藻酸钙复合物覆盖。将皮肤在15℃下储存5天，然后除去凝胶并返回培养4小时。随后，通过h&e和胶原染色检查组织完整性(a)，通过观察alamarblue的相对代谢活性检查存活力(b)。储存5天的组织在结构或完整性上没有表现出变化，并且没有存活力损失。
ipsc来源的成血管细胞(巨噬细胞祖细胞工厂)的储存
图11示出悬浮在藻酸钙水凝胶珠粒中的ipsc来源的成血管细胞的保存。成血管细胞悬浮在藻酸钠中，然后与钙以珠粒的形式交联。将悬浮在完全培养基中的珠粒在受控室温下经5天的时间运送到遥远的地点。从藻酸盐珠粒中回收成血管细胞，并将其返回培养20天，在此期间收集巨噬细胞祖细胞并评估表型。包封保留了成血管细胞产生表达典型谱系标志物的巨噬细胞祖细胞的能力。
人皮肤3d构建体的储存
图12示出用藻酸盐水凝胶保护的人皮肤3d构建体的保存。将3d培养插入物中的由真皮角质形成细胞和成纤维细胞组成的3d组织构建体在受控室温下在藻酸盐水凝胶保护下储存并运送5天和7天。在除去凝胶并过夜孵育后，评价细胞存活力。在整个支架结构中看到活细胞(cam-阳性；绿色)，在储存和运送5和7天后几乎没有死细胞的迹象，并且在储存5和7天后皮肤模型的相对代谢活性得以保持(大约90％的未储存对照)。
保存在96孔培养板中的结直肠癌类器官的储存
图13示出结直肠癌类器官在藻酸盐水凝胶保护下在96孔板中储存后被保存的存活力和形态。在96孔板中的培养中建立结直肠癌类器官。然后用150μl藻酸钙水凝胶复合物覆盖类器官并在15℃下储存5天。除去凝胶后，将细胞恢复到标准培养条件过夜，并通过活/死(cam/ethd-1)染色和荧光和明视野显微术评价存活力和形态。类器官在储存后保持高细胞存活力和正常形态。
实施例4：技术概述
这里提供的数据描述了藻酸盐作为层或涂层在储存和/或运输期间保存细胞和简单组织的用途。它提供了细胞层原位(即在它们接种和/或生长的培养容器中)的保存。以这种方式保存的细胞包括基质细胞、上皮细胞和神经元细胞。还提供了描述保存简单多细胞球体和简单3d组织构建体的数据。数据证明藻酸盐水凝胶涂层在室温储存期间保持细胞存活力和培养物/组织完整性的能力，以及在运输期间提供机械保护的能力。