相关申请
本申请要求于2018年1月31日提交的美国临时专利申请第62/624,624号的优先权。出于所有目的,该临时申请的内容通过引用整体合并于此。
背景技术:
自然杀伤(nk)细胞是细胞毒性淋巴细胞,其构成先天免疫系统的主要成分。通常占到循环淋巴细胞的约10-15%的nk细胞结合并杀死所靶向的细胞,包括病毒感染的细胞和许多恶性细胞,对于抗原而言是非特异性的,并且没有事先的免疫致敏。herberman等,science214:24(1981)。通过诱导细胞裂解来杀死靶细胞。用于该目的的nk细胞从受试者的血液的外周血淋巴细胞(“pbl”)部分中分离,在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞,然后将其重新注入受试者中。已经显示nk细胞在离体治疗和体内治疗中都有些有效。然而,由于并非所有的nk细胞都具有细胞溶解作用的事实,这种疗法变得复杂化,并且该疗法对所治疗的患者是特异性的。
nk-
然而,细胞收获效率低下仍然是产生足够的nk-
技术实现要素:
本文提供了收获nk-
任选地,收集nk-
任选地,已经收获的nk-
前面的一般描述和下面的详细描述是示例性和说明性的,并且旨在提供对本公开的进一步说明。对于本领域技术人员而言,其他目的、优点和新颖特征将是清楚的。
附图说明
当结合附图考虑以下公开时,将更容易地理解目的、特征和优点。
图1是收获nk-
具体实施方式
本文提供了使用含有1-5%白蛋白,任选地5%人类白蛋白的缓冲液收获nk-
在阅读了该说明书之后,对于本领域技术人员而言,如何实施各种可选的实施方式和可选的应用将变得显而易见。然而,本文中未描述所有实施方式。应理解的是,本文提出的实施方式仅是以示例性的而不是限制性的方式提出的。因此,各种可选实施方式的这种详细描述不应被解释为限制本文所阐述的本公开的范围或广度。应当理解,下面描述的方面不限于特定的组合物、制备这种组合物的方法或它们的用途,因为它们可能会有所变化。
术语
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
在本说明书和随后的权利要求中,将引用许多术语,这些术语应被定义为具有以下含义:
本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的,而无意于进行限制。如本文所使用的,单数形式的“一”、“一个”和“该”也旨在包含复数形式,除非上下文另外明确指出。因此,例如,提及“一个自然杀伤细胞”包括多个自然杀伤细胞。
所有数字指定,例如ph值、温度、时间、浓度、量和分子量,包括范围,都是近似值,其在适当的情况下以0.1或1.0的增量(+)或(-)变化。应当理解,尽管并非总是明确地陈述,但是所有数字指定可以以术语“约”前置。
如本领域技术人员将理解的,出于任何和所有目的,特别是在提供书面说明方面,本文公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地认可为充分描述该范围,并且可以将该范围分解为至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性示例,本文讨论的各个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一,等。如本领域的技术人员还应理解的,如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等等的所有语言包含所陈述的数字并指代随后可如上所述细分为子范围的范围。最后,如本领域技术人员将理解的,范围包含各单个成员。因此,例如,具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地,具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组,依此类推。
还应理解,尽管并非总是明确指出,本文所述的试剂仅是示例性的,其等同物是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生,并且该描述包括其中事件或情况发生的情况以及其中事件或情况没有发生的情况。
术语“包含”旨在表示所述组合物和方法包括所列举的元素,但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时,“基本上由……组成”应表示排除对该组合具有任何实质意义的其他元素。例如,基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响权利要求的基本和新颖特征的其他元素。“由...组成”是指排除多于痕量的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方式在本公开的范围内。
如本文所用,“自然杀伤(nk)细胞”是免疫系统的细胞,其在没有特异性抗原刺激并且没有根据主要组织相容性复合物(mhc)类别的限制的情况下杀死靶细胞。靶细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。nk细胞的特征在于存在cd56和不存在cd3表面标志物。
为了本发明的目的,且除非另有说明,术语“nk-
如本文所用,术语“ank细胞”是指亲本nk-
如本文所用,术语“hank细胞”是指已经被工程化以表达fc受体的nk-
如本文所用,术语“tank细胞”是指已被工程化以表达对癌症特异性抗原、癌症相关抗原或肿瘤特异性抗原具有亲和力的嵌合抗原受体(car)的nk-
如本文所用,术语“t-hank细胞”是指已被工程化以表达对癌症特异性抗原、癌症相关抗原或肿瘤特异性抗原具有亲和力的嵌合抗原受体(car)并表达fc受体的nk-
术语“fc受体”是指在某些细胞(例如,自然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质,其通过结合至称为fc区的抗体的部分而促进免疫细胞的保护性功能。抗体的fc区与细胞的fc受体(fcr)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。fcr根据其识别的抗体类型进行分类。例如,fc-γ受体(fcγr)与igg类的抗体结合。fcγriii-a(也称为cd16)是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。fcγriii-a通常在nk细胞上发现。nk-
如本文所用,术语“嵌合抗原受体”(car)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。car可以在t细胞或nk细胞中表达以增加细胞毒性。通常,细胞外抗原结合结构域是对在目的细胞上发现的抗原具有特异性的scfv。基于scfv结构域的特异性,表达car的nk-
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用,并指任何长度的核苷酸的聚合形式,脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构,并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段(例如,探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在,可以在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰,例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求,否则多核苷酸包含双链形式以及已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。
术语“表达”是指基因产物的产生。当涉及表达时,术语“瞬时”是指多核苷酸未并入细胞的基因组中。
术语“细胞因子”或“多个细胞因子”是指影响免疫系统细胞的生物分子的大类。示例性细胞因子包括但不限于,干扰素和白介素(il),特别是il-2、il-12、il-15、il-18和il-21。在优选的实施方式中,细胞因子是il-2。
如本文所用,术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸,使得当置于允许的细胞内(例如,通过转化过程)时,载体可以复制。载体可以在一种细胞类型(例如,细菌)中复制,但是在另一种细胞(例如,哺乳动物细胞)中复制的能力有限。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸dna;与阳离子脂质(单独或与阳离子聚合物结合)复合的dna;阴离子和阳离子脂质体;dna-蛋白质复合物和包含与阳离子聚合物(如异质聚赖氨酸、确定长度的寡肽和聚乙烯亚胺)凝聚的,在某些情况下包含在脂质体中的dna的颗粒;以及包含病毒和聚赖氨酸-dna的三元复合物的使用。
如本文所用,当涉及细胞毒性、存活力或细胞回收率时,术语“基本上相同”与术语“相当的”或“相似的”互换使用,是指对细胞毒性、存活力或细胞回收率的两个测量彼此的差异不超过15%、不超过10%、不超过8%或不超过5%。
如本文所用,术语“细胞毒性”当用于描述效应细胞如nk细胞的活性时,是指通过多种生物学、生物化学或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。
如本文所用,术语“收获”是指从其培养基中分离和收集细胞并制备细胞用于治疗应用。收获包括用合适的缓冲液,例如5%白蛋白洗涤细胞,以及任选地将细胞重悬于适合于预期应用(例如,输注)的缓冲液中。
如本文所用,术语“回收率”是指与进入收获过程的细胞数量相比,在收获过程完成之后获得的细胞的相对量。在某些情况下,回收率以百分比表示,例如,当使用连续离心作为收获细胞的手段时,回收率可以表示为以下方程式:
回收率=从连续离心中回收的细胞量/进入连续离心的细胞量。
为了方便读者,可以在说明书中使用标题或副标题,其不意在影响本公开的范围。另外,在下面更具体地定义本说明书中使用的一些术语。
白蛋白
白蛋白是细胞培养物中的蛋白质补充剂,用于将未酯化的脂肪酸递送到细胞中或从细胞中释放;白蛋白可以源自人或非人类来源,例如人或牛。人白蛋白可以源自人血清(“人血清白蛋白”)或人血浆(“人血浆白蛋白”),或者可以在体外合成,例如通过表达编码人白蛋白的基因(例如,nm_000477的序列)。迄今为止,白蛋白,特别是源自人的白蛋白尚未用于在收获期间洗涤细胞,因为与其他洗涤缓冲液(如pbs或生长培养基,如xvivotm10)相比,白蛋白的成本相对较高。人白蛋白可以商业购得,例如,从cslbehring。
收获nk-
生长nk-
可以通过离心收获如此产生的nk-
除白蛋白外,洗涤缓冲液还可包含1-10mg/ml的钠,例如3-5mg/ml的钠或3.2mg/ml的钠。任选地,洗涤缓冲液缺乏糖,例如右旋糖酐。任选地,洗涤缓冲液缺乏右旋糖酐-40。
收获方法可以回收80至100%的nk-
如本文所公开的使用1-5%白蛋白收获的nk-
nk-
可选地,也可以使用钙黄绿素释放测定法评估产生的nk-
任选地,评估的nk-
nk-
可以使用本文公开的方法培养的nk-
nk-
据发现nk-
迄今为止,对内源性nk细胞的研究表明,il-2(1000iu/ml)对于运输过程中nk细胞的活化至关重要,但是不必将细胞维持在37℃和5%的二氧化碳中。koepsell等,transfusion53:398-403(2013)。
修饰的nk-
尽管nk-
对内源性nk细胞的研究表明,il-2(1000iu/ml)对于运输过程中的nk细胞活化至关重要,但是不必将细胞维持在37℃和5%的二氧化碳中。koepsell等,transfusion53:398-403(2013)。但是,内源性nk细胞与nk-
fc受体
fc受体结合抗体的fc部分。几种fc受体是已知的,并且根据它们优选的配体、亲和力、表达和与抗体结合后的作用而不同。
表1.说明性fc受体
在一些实施方式中,nk-
在一些实施方式中,fc受体是cd16。编码cd16的代表性氨基酸序列示于seqidno:2中。编码cd16的代表性多核苷酸序列示于seqidno:1中。在一些实施方式中,nk-
同源多核苷酸序列包括对编码cd16变体的多肽序列进行编码的那些序列。在一些实施方式中,同源cd16多核苷酸的长度可以是约150至约700、约750或约800多核苷酸,尽管具有超过700至800多核苷酸的cd16变体在本公开的范围内。
在其他实例中,具有改变cd16氨基酸序列的多态性的cdna序列用于修饰nk-
在实例中,使用本领域已知的方法例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和pcr诱变来制备变体多肽。可以对克隆的dna进行定点诱变(carter,1986;zoller和smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(wells等,1985)或其他已知技术以产生cd16变体(ausubel,2002;sambrook和russell,2001)。
人cd16多肽的氨基酸序列中的保守置换,其中一个类别的氨基酸被相同类别的另一氨基酸取代落入所公开的cd16变体的范围内,只要该置换没有实质性地改变多肽的活性。保守置换是本领域技术人员众所周知的。影响(1)多肽主链的结构如β-折叠或α-螺旋构象,(2)电荷,(3)疏水性或(4)靶位点的侧链的体积的非保守置换可以修饰cd16多肽的功能或免疫学特性。非保守置换需要将这些类别中一个的成员交换为另一个类别。可以将置换引入保守置换位点中或更优选引入非保守位点中。
在一些实施方式中,cd16多肽变体的长度为至少200个氨基酸,并且与seqidno:1或seqidno:2具有至少70%的氨基酸序列同一性,或至少80%或至少90%的同一性。在一些实施方式中,cd16多肽变体的长度为至少225个氨基酸,并且与seqidno:1或seqidno:2具有至少70%的氨基酸序列同一性,或至少80%或至少90%的同一性。
在一些实施方式中,编码cd16多肽的核酸可以编码cd16融合蛋白。cd16融合多肽包含与非cd16多肽融合的cd16的任何部分或整个cd16。在一些实施方式中,可以产生其中异源多肽序列与cd16的c末端融合或位于cd16内部的融合多肽。通常,最多约30%的cd16胞质结构域可以被替换。这样的修饰可以增强表达或增强细胞毒性(例如,adcc响应性)。在其他实例中,嵌合蛋白,例如来自其他淋巴细胞活化受体的结构域,包括但不限于ig-a、ig-b、cd3-e、cd3-d、dap-12和dap-10,取代了一部分cd16细胞质结构域。
融合基因可以通过常规技术合成,包括自动dna合成仪和使用锚定引物的pcr扩增,其在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端,随后可以对其进行退火和重新扩增以产生嵌合基因序列(ausubel,2002)。许多载体是可商购的,其有助于将cd16框内亚克隆到融合部分。
嵌合抗原受体
如本文所述,将nk-
表2:肿瘤特异性抗原和相关的恶性肿瘤
在一些实施方式中,car靶向cd19、cd33或cspg-4。
在实例中,使用本领域已知的方法例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和pcr诱变来制备变体多肽。可以对克隆的dna进行定点诱变(carter,1986;zoller和smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(wells等,1985)或其他已知技术以产生cd16变体(ausubel,2002;sambrook和russell,2001)。
任选地,car靶向与特定癌症类型相关的抗原。任选地,所述癌症选自于白血病(包括急性白血病(例如,急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红细胞性白血病))和慢性白血病(例如,慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如,霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、实体肿瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤,如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在一些实施方式中,编码car的多核苷酸突变以改变编码car的氨基酸序列,而不改变car的功能。例如,可以在以上公开的car中进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换的多核苷酸置换。可以按照例如在专利公开号wo2014039523;us20140242701;us20140274909;us20130280285;和wo2014099671中描述的对car工程化,其每一个通过引用整体并入本文。任选地,该car是cd19car、cd33car或cspg-4car。
另外的修饰-细胞因子
nk-
在一些实施方式中,表达fcr的nk-
在一个实施方式中,表达具有将il-2引导至内质网的信号序列的il-2。不受理论的束缚,但是将il-2引导至内质网允许以足以自分泌激活的水平表达il-2,但不会细胞外释放il-2。参见konstantinidis等“targetingil-2totheendoplasmicreticulumconfinesautocrinegrowthstimulationtonk-
另外的修饰-自杀基因
术语“自杀基因”是允许细胞的负向选择的一种基因。自杀基因被用作安全系统,从而允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀死。在重组基因引起导致不受控制的细胞生长的突变的情况中,这是理想的。已经确定了许多自杀基因系统,包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌deo基因(另请参见,例如,yazawak,fisherwe,brunicardifc:currentprogressinsuicidegenetherapyforcancer.worldj.surg.2002年7月;26(7):783-9)。如本文所用,自杀基因在nk-
在一个实施方式中,自杀基因是胸苷激酶(tk)基因。tk基因可以是野生型或突变tk基因(例如,tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦(ganciclovir)杀死表达tk蛋白的细胞。
在另一个实施方式中,自杀基因是胞嘧啶脱氨酶,其在5-氟胞嘧啶存在下对细胞是毒性的。garcia-sanchez等,“cytosinedeaminaseadenoviralvectorand5-fluorocytosineselectivelyreducebreastcancercells1million-foldwhentheycontaminatehematopoieticcells:apotentialpurgingmethodforautologoustransplantation.”blood1998年7月15日;92(2):672-82。
在另一个实施方式中,自杀基因是在异环磷酰胺或环磷酰胺存在下毒性的细胞色素p450。参见,例如,touati等,“asuicidegenetherapycombiningtheimprovementofcyclophosphamidetumorcytotoxicityandthedevelopmentofananti-tumorimmuneresponse.”currgenether.2014;14(3):236-46。
在另一个实施方式中,自杀基因是icas9。distasi,(2011)“inducibleapoptosisasasafetyswitchforadoptivecelltherapy.”nengljmed365:1673–1683。另见morgan,“liveandletdie:anewsuicidegenetherapymovestotheclinic”moleculartherapy(2012);20:11–13。icas9蛋白在小分子ap1903存在下诱导细胞凋亡。ap1903是生物学惰性的小分子,其在临床研究中已显示出是良好耐受的,并已用于过继性细胞治疗的情况中。
在一个实施方式中,在施用于患者之前,修饰的nk-
转基因表达
可通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如,cd19car和cd16)工程化到表达载体中。可以将转基因工程化到相同的表达载体或不同的表达载体中。在优选的实施方式中,将转基因工程化到相同的载体中。
在一些实施方式中,载体允许将转基因整合至细胞的基因组中。在一些实施方式中,载体具有正向选择标记。正向选择标记包括允许细胞在将杀死不表达该基因的细胞的条件下生长的任何基因。非限制性实例包含抗生素抗性,例如,遗传霉素(来自tn5的neo基因)。
可以使用任何数量的载体来表达fc受体和/或car。在一些实施方式中,载体是质粒。在一个实施方式中,载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于,逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等等。
可使用本领域已知的任何转染方法将转基因引入nk-
公开了可用于本公开的方法和组合物,可与本公开的方法和组合物结合使用,可用于制备本公开的方法和组合物的材料、组合物和组分,或者公开了本公开的方法和组合物的产物。在本文中公开了这些和其他材料,并且应当理解,当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时,尽管这些化合物的各个单独的和集体的组合和排列的具体指示可能未明确公开,但其各自都在本文中特别考虑和描述。例如,如果公开并讨论了一种方法,并且讨论了可以对包括该方法的许多分子进行多种修饰,则该方法的各个和每种组合和排列以及可能的修饰都被特别考虑,除非特别指出相反。同样,这些的任何子集或组合也被特别考虑和公开。该概念适用于本公开的所有方面,包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此,如果存在可以执行的多种附加步骤,则应理解,这些附加步骤中的每一个可以与所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行,并且每个这样的组合或组合的子集都特别考虑且应视为已公开。
实施例
以下实施例仅用于说明性目的,并且不应解释为限制。存在着本领域技术人员可以使用的多种替代技术和程序,它们将类似地允许人们成功地执行以下实施例。
实施例1:使用5%的人类白蛋白洗涤细胞提高细胞收获的效率
图1显示了使用x-vivotm10或5%ha(人白蛋白)从大型生物反应器收获修饰的nk-
实施例2:在5%人白蛋白中解冻后的nk-
将冷冻的修饰的nk-
表3.在5%人白蛋白中解冻后的细胞存活力
结果表明,在5%人白蛋白中解冻的细胞具有86.5%的存活力,尽管不如x-vivotm10(94.4%)高,但显著高于在pbs中解冻的细胞的存活力(74.6%)。将在5%人白蛋白中解冻的细胞和在x-vivotm10中解冻的细胞分别转移至g-rex烧瓶生长培养基中进行扩增,且分别在xuri袋中的25l生长培养基和10l生长培养基中进一步扩增。
实施例3:修饰的nk-
收集在xuri袋中生长的修饰的nk-
结果显示,使用5%人白蛋白作为洗涤缓冲液收获的修饰nk-
表4.her2.tank细胞对bt-474靶细胞的细胞毒性
结果表明,使用5%白蛋白(人)作为洗涤缓冲液收获的修饰的nk-
表5.修饰的nk-
1修饰的nk-
结果显示,使用5%白蛋白(人)作为洗涤缓冲液收获的修饰的nk-
表6.修饰的nk-
1修饰的nk-
实施例4:在5%白蛋白(人)中连续离心收获的nk-
使用在x-vivotm10或5%白蛋白(人)中进行的连续离心收获修饰的nk-
表7.收获的修饰的nk-
实施例5:从5%白蛋白(人)中的连续离心收获的修饰nk-
使用在5%白蛋白(人)中的连续离心来收获修饰的nk-
表8.收获的cd19t-hank细胞的表型分型
1通过流式细胞术测定的细胞表面标志物阳性的cd19t-hank细胞的百分比(%)
表9.收获的修饰nk-
1通过流式细胞术测定的cd19.car表达阳性的cd19t-hank细胞的百分比
应当理解,本文描述的实施例和实施方式仅用于说明性目的,并且鉴于其的各种修改或改变将是本领域技术人员容易想到的,并且将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
非正式序列表
seqidno:1高亲和力变体免疫球蛋白γfc区受体iii-a核酸序列(全长形式)。
atgtggcagctgctgctgcctacagctctcctgctgctggtgtccgccggcatgagaaccgaggatctgcctaaggccgtggtgttcctggaaccccagtggtacagagtgctggaaaaggacagcgtgaccctgaagtgccagggcgcctacagccccgaggacaatagcacccagtggttccacaacgagagcctgatcagcagccaggccagcagctacttcatcgacgccgccaccgtggacgacagcggcgagtatagatgccagaccaacctgagcaccctgagcgaccccgtgcagctggaagtgcacatcggatggctgctgctgcaggcccccagatgggtgttcaaagaagaggaccccatccacctgagatgccactcttggaagaacaccgccctgcacaaagtgacctacctgcagaacggcaagggcagaaagtacttccaccacaacagcgacttctacatccccaaggccaccctgaaggactccggctcctacttctgcagaggcctcgtgggcagcaagaacgtgtccagcgagacagtgaacatcaccatcacccagggcctggccgtgtctaccatcagcagctttttcccacccggctaccaggtgtccttctgcctcgtgatggtgctgctgttcgccgtggacaccggcctgtacttcagcgtgaaaacaaacatcagaagcagcacccgggactggaaggaccacaagttcaagtggcggaaggacccccaggacaagtga
seqidno:2高亲和力变体免疫球蛋白γfc区受体iii-a氨基酸序列(全长形式)。位置176处的val加下划线。
mettrpglnleuleuleuprothralaleuleuleuleuvalseralaglymetargthrgluaspleuprolysalavalvalpheleugluproglntrptyrargvalleuglulysaspservalthrleulyscysglnglyalatyrserprogluaspasnserthrglntrpphehisasngluserleuileserserglnalasersertyrpheileaspalaalathrvalaspaspserglyglutyrargcysglnthrasnleuserthrleuseraspprovalglnleugluvalhisileglytrpleuleuleuglnalaproargtrpvalphelysglugluaspproilehisleuargcyshissertrplysasnthralaleuhislysvalthrtyrleuglnasnglylysglyarglystyrphehishisasnseraspphetyrileprolysalathrleulysaspserglysertyrphecysargglyleuvalglyserlysasnvalsersergluthrvalasnilethrilethrglnglyleualavalserthrileserserphepheproproglytyrglnvalserphecysleuvalmetvalleuleuphealavalaspthrglyleutyrpheservallysthrasnileargserserthrargasptrplysasphislysphelystrparglysaspproglnasplys
seqidno:3eril-2核酸序列
atgtaccggatgcagctgctgagctgtatcgccctgtctctggccctcgtgaccaacagcgcccctaccagcagcagcaccaagaaaacccagctgcagctggaacatctgctgctggacctgcagatgatcctgaacggcatcaacaactacaagaaccccaagctgacccggatgctgaccttcaagttctacatgcccaagaaggccaccgaactgaaacatctgcagtgcctggaagaggaactgaagcccctggaagaagtgctgaacctggcccagagcaagaacttccacctgaggcccagggacctgatcagcaacatcaacgtgatcgtgctggaactgaaaggcagcgagacaaccttcatgtgcgagtacgccgacgagacagctaccatcgtggaatttctgaaccggtggatcaccttctgccagagcatcatcagcaccctgaccggctccgagaaggacgagctgtga
seqidno:4eril-2(er保留信号带下划线)氨基酸序列
mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleuvalthrasnseralaprothrserserserthrlyslysthrglnleuglnleugluhisleuleuleuaspleuglnmetileleuasnglyileasnasntyrlysasnprolysleuthrargmetleuthrphelysphetyrmetprolyslysalathrgluleulyshisleuglncysleugluglugluleulysproleuglugluvalleuasnleualaglnserlysasnphehisleuargproargaspleuileserasnileasnvalilevalleugluleulysglysergluthrthrphemetcysglutyralaaspgluthralathrilevalglupheleuasnargtrpilethrphecysglnserileileserthrleuthrglyserglulysaspgluleu
seqidno:5pd-l1car的氨基酸序列
seqidno:6cd19car的氨基酸序列
seqidno:7her2car的氨基酸序列
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种收获
2.如权利要求1所述的方法,其中所述收集
3.如权利要求1所述的方法,进一步包括将所述洗涤的
4.如权利要求1所述的方法,其中所述洗涤通过离心所述细胞,和然后将所述细胞重悬浮于所述洗涤缓冲液中来进行。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述洗涤至少进行三次。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述洗涤进行4-6次。
7.如权利要求6所述的方法,其中所述方法回收至少80%的所述
8.如权利要求1所述的方法,其中所收获的细胞的存活力为至少90%。
9.如权利要求1所述的方法,其中已经收获的所述
10.如权利要求1所述的方法,其中已经收获的所述
11.如权利要求1所述的方法,其中已经收获的所述
12.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液包含2-5%的白蛋白。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液包含3-5%的白蛋白。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液包含5%的白蛋白。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液缺乏糖。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述缓冲液缺乏右旋糖酐。
17.如权利要求4所述的方法,其中所述离心是通过连续离心进行的。
18.如权利要求1所述的方法,其中所述白蛋白是人白蛋白,或者人血清来源的白蛋白,或人血浆来源的白蛋白。
19.如权利要求1所述的方法,其中所述
20.如权利要求19所述的方法,其中所述嵌合抗原受体是her2、cd19或pd-l1的受体。
21.如权利要求19所述的方法,其中所述嵌合抗原受体是表1中所列的任何肿瘤特异性抗原的受体。