发夹型单链RNA分子的制备方法与流程

文档序号：22625847发布日期：2020-10-23 19:33阅读：1201来源：国知局

本发明涉及发夹型单链rna分子的制备方法。

背景技术：

作为抑制基因表达的技术，例如已知有rna干扰(rnai)(非专利文献1)。在基于rna干扰的基因表达抑制中，大多利用使用被称为sirna(小干扰rna，smallinterferingrna)的短的双链rna分子的方法。另外，还报道了：使用通过分子内退火部分地形成了双链的环状rna分子的基因表达抑制技术(专利文献1)。

然而，由于sirna在体内的稳定性低，容易解离成单链rna，所以难以稳定地抑制基因表达。专利文献2报道了：利用使用环状胺衍生物形成的1个或2个接头将sirna的有义链和反义链连接成单链而得的发夹型单链长链rna分子可使sirna稳定化。然而，该单链长链rna分子无法通过使用tbdms亚酰胺(amidite)等通用型亚酰胺的亚磷酰胺法有效地合成，因此，在其合成中需要使用特别的rna亚酰胺(例如，专利文献2和3)。

专利文献4公开了：使用作为第三核酸链的辅助核酸和t4rna连接酶2来连接第一核酸链和第二核酸链的方法，但显示出辅助核酸越长则反应越慢，在该方法中带来良好的连接效率的辅助核酸受到限定。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2004/058886号；

专利文献2：国际公开wo2013/027843；

专利文献3：国际公开wo2016/159374；

专利文献4：国际公开wo2011/052013；

非专利文献

非专利文献1：fire等人,nature,(1998)feb19;391(6669):806-811。

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的课题在于：提供抑制标记基因表达的发夹型单链rna分子的有效的制备方法。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明人反复进行了深入研究，结果发现了：通过将包含针对靶基因的表达抑制序列的发夹型单链rna分子分割成具有非核苷酸性接头或核苷酸性接头等接头的2个单链寡rna分子进行合成，再将它们退火、连接，无需特别的rna亚酰胺或辅助核酸，即可有效地制备该发夹型单链rna分子；另外，通过调节连接条件，可进一步增加相对于酶使用量的发夹型单链rna分子的生产效率，从而完成了本发明。

即，本发明包含以下内容。

[1]发夹型单链rna分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子的制备方法，该制备方法包括以下工序：

退火工序，将第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子退火；以及

连接工序，通过rnl2家族的连接酶连接上述第1单链寡rna分子的3’末端和上述第2单链寡rna分子的5’末端，

其中，上述第1单链寡rna分子包含经由第1接头进行连接的第1rna部分和第2rna部分，第1rna部分和第2rna部分中的一方可与另一方互补性地结合，

上述第2单链寡rna分子包含经由第2接头进行连接的第3rna部分和第4rna部分，第3rna部分和第4rna部分中的一方可与另一方互补性地结合，

上述第1单链寡rna分子和上述第2单链寡rna分子可在5’末端或3’末端的互补序列间形成分子间双链，

在退火工序中，当上述第1单链寡rna分子和上述第2单链寡rna分子形成双链时，上述第1单链寡rna分子的3’末端的核糖核苷酸残基与上述第2单链寡rna分子的5’末端的核糖核苷酸残基生成切口，并且在上述第1单链寡rna分子的5’末端的核糖核苷酸残基与上述第2单链寡rna分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间存在1个以上的核糖核苷酸残基的缺口，

通过上述第1单链寡rna分子与上述第2单链寡rna分子的连接而生成的序列包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。

[2]上述[1]所述的制备方法，其中，上述第1单链寡rna分子由下述式(i)表示，上述第2单链寡rna分子由下述式(ii)表示：

5’-xs-lx1-xa-3’・・・式(i)

5’-ya1-ya2-ya3-lx2-ys-3’・・・式(ii)

式(i)和式(ii)中，xs、xa、ya1、ya2、ya3和ys表示1个或其以上的核糖核苷酸残基，

lx1和lx2分别表示第1接头和第2接头，

ya3与ys互补，

通过连接工序产生的xa-ya1与xs互补，

通过连接工序产生的xa-ya1-ya2-ya3包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。

[3]上述[1]或[2]所述的制备方法，其中，上述第1单链寡rna分子在3’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)，上述第2单链寡rna分子在5’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)。

[4]上述[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，第1接头和第2接头分别独立为：(i)非核苷酸性接头，其包含吡咯烷骨架(backbone，主链)和哌啶骨架的至少一者；或者(ii)核苷酸性接头。

[5]上述[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，rnl2家族的连接酶为t4rna连接酶2。

[6]上述[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，上述连接在ph7.4～8.6的反应液中进行。

[7]上述[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，上述连接在含有2～10mm的二价金属离子的反应液中进行。

[8]上述[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，第1接头和第2接头分别独立为下述式(vi)所表示的非核苷酸性接头：

[化学式1]

。

[9]上述[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，上述靶基因为tgf-β1基因、gapdh基因、lama1基因或lmna基因。

[10]上述[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述发夹型单链rna分子由seqidno:1所表示的核苷酸序列(塩基配列)构成，且第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，第50位和第51位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。

[11]上述[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，上述第1单链寡rna分子和上述第2单链寡rna分子为以下(1)～(6)中的任意一种组合：

(1)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；

(2)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；

(3)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；

(4)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；

(5)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接；

(6)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头进行连接。

[12]单链寡rna分子，其为以下(a)～(l)中的任意一种分子：

(a)由seqidno:7所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(b)由seqidno:6所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(c)由seqidno:19所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(d)由seqidno:18所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(e)由seqidno:27所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(f)由seqidno:26所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(g)由seqidno:29所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(h)由seqidno:28所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(i)由seqidno:31所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(j)由seqidno:30所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(k)由seqidno:33所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接；

(l)由seqidno:32所表示的核苷酸序列构成的单链寡rna分子，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由接头进行连接。

[13]用于抑制tgf-β1基因表达的发夹型单链rna分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(1)～(6)中的任意一种单链寡rna分子的组合：

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2018-070423号的公开内容。

发明效果

根据本发明，可有效地制备抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子。

附图说明

[图1]图1是本发明的一个实施方式的连接方法的概略图。

[图2]图2是sstbrna分子(seqidno:1)的示意图。p表示脯氨酸衍生物。seqidno:1的第29位(u)～第47位(c)相当于活性序列(针对tgf-β1基因的基因表达抑制序列；反义序列)。

[图3]图3显示表1所示的004～019的单链寡rna分子(链1和链2)组(对)在使用了t4rna连接酶2的退火和连接反应后的连接效率。

[图4]图4显示011、016和018的单链寡rna分子(链1和链2)的结构。各对的右侧为链1、左侧为链2。

[图5]图5显示在不同的寡rna浓度和不同的反应温度下连接016的寡核酸时的连接效率的经时性变化。

[图6]图6显示使用011、016和018的寡rna(100μm)，在不同的反应温度下进行连接时的连接效率的经时性变化。a显示25℃下的连接结果，b显示37℃下的连接结果。

[图7]图7显示在不同的atp浓度下连接011的寡rna时的变性page分析的结果。

[图8]图8显示在不同的atp浓度下连接011的寡rna时的连接效率。

[图9]图9显示在不同的寡rna浓度、不同的ph条件下连接016的寡rna时的连接效率的经时性变化。

[图10]图10显示在不同的ph条件下连接016的寡rna时的连接效率。

[图11]图11显示在不同的寡rna浓度、不同的mgcl2浓度下连接016的寡rna时的连接效率。a显示在10μm或100μm的寡rna的存在下的连接结果，b显示在10μm或200μm的寡rna的存在下的连接结果。

[图12]图12显示在不同的mgcl2浓度、不同的ph条件下连接016的寡rna时的连接效率。a显示ph7.5下的连接结果，b显示ph8.0下的连接结果。

[图13]图13显示使用不同的酶量、且添加peg进行连接时的连接效率。

[图14]图14显示使用了不同的寡rna浓度的连接反应的时间过程。

[图15]图15显示将初期寡rna浓度设为100μm、且边依次追加寡rna边进行的连接反应中的目标产物sstbrna分子的生成量。sstbrna分子的生成量(nmol)=(单链寡rna分子的添加量)×(flp(fulllengthproduct、全长产物)(%))/100。图的横轴的h表示连接开始后的时间。连接开始时的寡rna浓度为100μm(10nmol)、酶浓度为4单位/nmol寡rna，在最终添加后成为寡rna浓度为300μm(40nmol)、酶浓度为1单位/nmol寡rna。

[图16]图16显示将初期寡rna浓度设为200μm、且边依次追加寡rna边进行的连接反应中的目标产物sstbrna分子的生成量。sstbrna分子的生成量(nmol)=(单链寡rna分子的添加量)×(flp(%))/100。图的横轴的h表示连接开始后的时间。连接开始时的寡rna浓度为200μm(20nmol)、酶浓度为4单位/nmol寡rna，在最终添加后成为寡rna浓度为480μm(80nmol)、酶浓度为0.5单位/nmol寡rna。

[图17]图17显示包含针对gapdh基因、lama1基因或lmna基因的基因表达抑制序列的发夹型单链rna分子及其分割位置。(1)～(7)显示分割位置。针对各基因的基因表达抑制序列(活性序列/反义序列)显示在框中。

[图18]图18显示使用了单链寡rna分子对(链1和链2)的退火和连接反应后的连接效率，所述单链寡rna分子对是包含针对gapdh基因、lama1基因或lmna基因的基因表达抑制序列的发夹型单链rna分子的分割片段。

[图19]图19显示表1所示的链1和链2的组(对)在使用了t4rna连接酶的退火和连接反应后的连接效率。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。

本发明涉及抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子的制备方法。利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子具有如下的单链结构：包含基因表达抑制序列的双链rna的有义链的3’末端和反义链的5’末端经由包含非核苷酸性接头或核苷酸性接头等接头的序列连接，且在其反义链的3’末端进一步经由包含非核苷酸性接头或核苷酸性接头等接头的序列连接有1个以上的核糖核苷酸残基。利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子的5’末端和3’末端没有结合。在本说明书中，“发夹型”是指，单链rna分子通过分子内退火(自身退火)形成1个以上的双链结构。利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子中，典型的是，其包含5’末端的5’侧区域和包含3’末端的3’侧区域分别分开进行分子内退火而形成2个双链结构。在本说明书中，“rna”、“rna分子”、“核酸分子”和“核酸”可仅由核苷酸构成，也可由核苷酸和非核苷酸物质(例如，脯氨酸衍生物等环状胺衍生物)构成。

在本发明中，通过将抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子在2个接头(例如，非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们组合而得的接头)所夹持的序列中以分割成2个的片段的方式合成，再将它们退火、连接，即可制得。连接是指，将2个核酸(在本发明中，典型的是rna)通过使其末端的5’磷酸基和3’羟基结合(磷酸二酯键)而进行连接。在本发明的方法中，通过连接链较短的单链rna分子的对来制备链较长的发夹型单链rna分子，由此可实现该发夹型单链rna分子的高产量的制备。

更具体而言，本发明涉及发夹型单链rna分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子的制备方法，该制备方法包括以下工序：

退火工序，将第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子退火；以及

连接工序，通过rnl2家族的连接酶连接上述第1单链寡rna分子的3’末端和上述第2单链寡rna分子的5’末端，

其中，通过第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的连接而生成的序列包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列。

在本发明的方法中，第1单链寡rna分子包含经由第1接头进行连接的第1rna部分和第2rna部分，第1rna部分和第2rna部分中的一方可与另一方互补性地结合。通过其互补性的结合，第1接头形成环，第1rna部分和第2rna部分与该环相邻且可形成茎。在第1单链寡rna分子中，第1rna部分配置在5’末端侧，第2rna部分配置在3’末端侧。另外，第2单链寡rna分子包含经由第2接头进行连接的第3rna部分和第4rna部分，第3rna部分和第4rna部分中的一方可与另一方互补性地结合。通过其互补性的结合，第2接头形成环，第3rna部分和第4rna部分与该环相邻且可形成茎。在第2单链寡rna分子中，第3rna部分配置在5’末端侧，第4rna部分配置在3’末端侧。第1～第4rna部分分别包含1个或2个以上的核糖核苷酸残基。如此，第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子包含自身互补序列，可分别通过分子内退火(自身退火)而形成发夹结构。第1rna部分和第2rna部分优选其中一方具有较另一方长的核苷酸长度(塩基長)。另外，第3rna部分和第4rna部分优选其中一方具有较另一方长的核苷酸长度。在第1rna部分具有较第2rna部分长的核苷酸长度的情况下，第3rna部分优选具有较第4rna部分长的核苷酸长度。在第2rna部分具有较第1rna部分长的核苷酸长度的情况下，第4rna部分优选具有较第1rna部分长的核苷酸长度。在第1rna部分和第2rna部分中，具有较长的核苷酸长度的一方的rna部分优选与第1接头相邻且包含与具有较短的核苷酸长度的一方的rna部分互补的核糖核苷酸残基或其序列。在第3rna部分和第4rna部分中，具有较长的核苷酸长度的一方的rna部分优选与第2接头相邻且包含与具有较短的核苷酸长度的一方的rna部分互补的核糖核苷酸残基或其序列。

在本发明中，单链寡rna分子中所含的2个rna部分(第1和第2rna部分、或第3和第4rna部分)中的一方可与另一方“互补性地结合”是指，2个rna部分中的任意一方(通常是指具有较短的核苷酸长度的rna部分)的全长可与另一方的rna部分(通常是指具有较长的核苷酸长度的一方的rna部分)形成稳定的碱基配对而结合，这种情况下，前者的rna部分的全长与后者的rna部分内的对应的核糖核苷酸残基或其序列互补。单链寡rna分子中所含的2个rna部分的一方更优选与另一方的rna部分中的对应的核糖核苷酸残基或其序列完全互补(即，一方的rna部分的全部的核糖核苷酸残基与另一方的rna部分中的对应的核糖核苷酸残基没有错配)。或者，单链寡rna分子中所含的2个rna部分的一方只要可与另一方的rna部分形成稳定的碱基配对即可，可以包含1个以上、例如1个或2个核糖核苷酸残基的错配，这种情形也是“可互补性地结合”。然而，在本发明的方法中优选在所连接的分子末端的核糖核苷酸残基中不存在这种错配。

在一个实施方式中，第1rna部分和第4rna部分中的一方较另一方短，优选为1～7个核苷酸长度，例如为1～6个核苷酸长度、1～4个核苷酸长度、1～3个核苷酸长度、1个核苷酸长度或2个核苷酸长度。这种情况下，第1rna部分和第4rna部分中长的一方(另一方)可以是19～28个核苷酸长度，例如可以是19～27个核苷酸长度、19～25个核苷酸长度、19～23个核苷酸长度、20～28个核苷酸长度、21～27个核苷酸长度、20～25个核苷酸长度、22～27个核苷酸长度、23～26个核苷酸长度、24～28个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度。

在第1rna部分较第4rna部分长的情况下，第2rna部分并不受以下的限定，可以是1～20个核苷酸长度，例如可以是2～20个核苷酸长度、2～15个核苷酸长度、3～10个核苷酸长度、3～6个核苷酸长度、5～12个核苷酸长度或9～12个核苷酸长度。在第1rna部分较第4rna部分短的情况下，第2rna部分并不受以下的限定，可以是8～38个核苷酸长度，例如可以是8～36个核苷酸长度、12～36个核苷酸长度、14～34个核苷酸长度、14～33个核苷酸长度、14～36个核苷酸长度或20～34个核苷酸长度。

第1rna部分的核苷酸序列与接头相邻且可包含cc(胞嘧啶-胞嘧啶)，这种情况下，第2rna部分的核苷酸序列优选以与其序列互补的方式、与接头相邻且包含gg(鸟嘌呤-鸟嘌呤)。在一个实施方式中，第1rna部分的核苷酸序列与接头相邻且可包含acc(腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)、gcc(鸟嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)或ucc(尿嘧啶-胞嘧啶-胞嘧啶)，这种情况下，第2rna部分的核苷酸序列优选以与其序列互补的方式、与接头相邻且分别包含ggu(鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶)、ggc(鸟嘌呤-鸟嘌呤-胞嘧啶)或gga(鸟嘌呤-鸟嘌呤-腺嘌呤)。第3rna部分的核苷酸序列与接头相邻且可包含c(胞嘧啶)，这种情况下，第4rna部分的核苷酸序列优选以与其残基互补的方式、与接头相邻且包含g(鸟嘌呤)。

第1或第2单链寡rna分子的核苷酸长度、即2个rna部分的总计核苷酸长度(不包括接头部分)并不受以下的限定，但优选为13～48个核苷酸长度。在第1rna部分较第4rna部分长的情况下，第1单链寡rna分子的核苷酸长度、即第1rna部分和第2rna部分的总计核苷酸长度(不包括接头部分)优选为21～48个核苷酸长度，例如为21～45个核苷酸长度、25～45个核苷酸长度、26～35个核苷酸长度、26～30个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度或33～36个核苷酸长度。在第1rna部分较第4rna部分短的情况下，第1单链寡rna分子的核苷酸长度、即第1rna部分和第2rna部分的总计核苷酸长度(不包括接头部分)优选为13～45个核苷酸长度，例如为13～43个核苷酸长度、15～41个核苷酸长度、15～30个核苷酸长度、17～25个核苷酸长度或20～25个核苷酸长度。

在本发明的方法中，第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子在5’末端或3’末端的序列中彼此互补。第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子可在5’末端或3’末端的互补序列间(优选完全互补序列间)形成分子间双链。更具体而言，在一个实施方式中，形成了发夹结构的第1单链寡rna分子的5’末端的序列(第1rna部分的5’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)和形成了发夹结构的第2单链寡rna分子的5’末端的序列(第3rna部分的5’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)彼此互补，可形成分子间双链。在另一个实施方式中，形成了发夹结构的第1单链寡rna分子的3’末端的序列(第2rna部分的3’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)和形成了发夹结构的第2单链寡rna分子的3’末端的序列(第4rna部分的3’末端的、发夹结构的茎/环中不包含的序列)彼此互补，可形成分子间双链。在本发明的方法的退火工序中，第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子在5’末端或3’末端的互补序列间形成分子间双链，从而生成双链寡rna。

在一个实施方式中，在第1和第2单链寡rna分子间互补序列的长度(不包含后述的缺口部分)并不受以下的限定，通常为6个核苷酸长度以上，例如为7个核苷酸以上、10个核苷酸长度以上、12个核苷酸长度以上、14个核苷酸长度以上或18个核苷酸以上，例如可以是6～27个核苷酸长度、7～25个核苷酸长度、10～25个核苷酸长度、12～23个核苷酸长度、12～22个核苷酸长度、12～15个核苷酸长度或18～23个核苷酸长度。

在本发明的方法的退火工序中，当第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子形成双链时，第1单链寡rna分子的3’末端的核糖核苷酸残基和上述第2单链寡rna分子的5’末端的核糖核苷酸残基生成切口。更具体而言，在退火工序中，第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子除了在第1和第2单链寡rna分子间通过互补序列的分子间退火形成双链(分子间双链)以外，还在第1rna部分和第2rna部分、以及第3rna部分和第4rna部分中分别通过分子内退火形成双链(分子内双链、即发夹结构)，在第2rna部分和第3rna部分之间生成切口。在本发明中，“切口”是指，在核酸双链的一方的核苷酸链中2个核苷酸残基间的磷酸二酯键被切断使得3’羟基和5’磷酸基游离的状态。切口可通过连接反应来连接。

在本发明的方法的退火工序中，当第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子形成双链时，在第1单链寡rna分子的5’末端的核糖核苷酸残基与第2单链寡rna分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间存在1个以上的核糖核苷酸残基的缺口。该缺口无法通过连接反应来连接，因此第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子在连接反应后形成单链rna分子。1个以上的核糖核苷酸残基的缺口可以是1～4个残基(1、2、3或4个残基)的缺口。在该缺口部分不会形成碱基配对。

第1单链寡rna分子的5’末端的核糖核苷酸残基与第2单链寡rna分子的3’末端的核糖核苷酸残基之间的缺口，在第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子退火而得的双链中，可位于更接近第1接头的位置、或者可位于更接近第2接头的位置。

通过第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的连接而生成的序列包含针对靶基因的基因表达抑制序列。第1rna部分或第4rna部分可包含针对靶基因的基因表达抑制序列(有义序列或反义序列；例如有义序列)。通过连接使第2rna部分和第3rna部分连接而得的序列可包含针对靶基因的基因表达抑制序列(反义序列或有义序列；例如反义序列)。在一个实施方式中，第2rna部分或第3rna部分可包含针对靶基因的基因表达抑制序列(反义序列或有义序列；例如反义序列)。

在本发明的方法中，接头、例如第1接头和第2接头可以是非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。

在一个实施方式中，第1单链寡rna分子在3’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)，并且，第2单链寡rna分子在5’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)。这里，单链寡rna分子在3’末端或5’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)是指，单链寡rna分子的3’末端或5’末端的核糖核苷酸残基包含尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)作为碱基。具体而言，第1单链寡rna分子的3’末端的核糖核苷酸残基的碱基与第2单链寡rna分子的5’末端的核糖核苷酸残基的碱基的优选组合可以是u-a、u-u、a-u或a-a。

本发明的方法的一个实施方式的概略图见图1。图1中，lx1和lx2为接头(例如，非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合)。在本发明的方法中，通过连接链较短的单链rna分子的对来制备链较长的发夹型单链rna分子，由此可实现高产量。

在一个实施方式中，本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子的制备方法包括以下工序：

退火工序，将下述式(i)所表示的第1单链寡rna分子(图1中，链1)：

5’-xs-lx1-xa-3’・・・式(i)

和下述式(ii)所表示的第2单链寡rna分子(图1中，链2)：

5’-ya1-ya2-ya3-lx2-ys-3’・・・式(ii)

退火；以及连接工序，连接第1单链寡rna分子的3’末端和第2单链寡rna分子的5’末端。该连接可通过rnl2家族的连接酶来进行。

在另一个实施方式中，本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子的制备方法包括以下工序：

退火工序，将下述式(a)所表示的第1单链寡rna分子：

5’-xxs-lx1-xxa3-xxa2-xxa1-3’・・・式(a)

和下述式(b)所表示的第2单链寡rna分子：

5’-yya-lx2-yys-3’・・・式(b)

退火；以及连接工序，连接第1单链寡rna分子的3’末端和第2单链寡rna分子的5’末端。该连接可通过rnl2家族的连接酶来进行。

在本发明中，“寡rna”和“寡rna分子”是指，具有49个核苷酸长度以下(非核苷酸性接头和核苷酸性接头等接头部分的残基数不计算在内)的核苷酸序列的rna分子。本发明中，术语“寡rna”和“寡rna分子”通常互换使用。本发明所涉及的单链寡rna分子有时还称为单链寡rna、寡核酸、单链核酸分子、寡rna或寡rna分子。

式(i)和式(ii)中，xs、xa、ya1、ya2、ya3和ys表示1个或其以上的核糖核苷酸残基。式(i)和式(ii)中，lx1和lx2分别独立地表示接头、例如非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。

式(i)表示区域xs和xa经由lx1连接而得的结构。式(ii)表示区域ya1、ya2和ya3依次连接而得的核糖核苷酸序列(ya1-ya2-ya3)与区域ys经由lx2连接而得的结构。

式(a)和式(b)中，xxs、xxa3、xxa2、xxa1、yya和yys表示1个或其以上的核糖核苷酸残基。式(a)和式(b)中，lx1和lx2分别独立地表示接头、例如非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。

式(a)表示区域xxa3、xxa2和xxa1依次连接而得的核糖核苷酸序列(xxa3-xxa2-xxa1)与区域xxs经由lx1连接而得的结构。式(b)表示区域yya和yys经由lx2连接而得的结构。

xs、xa、ya1、ya2、ya3、ys、xxs、xxa3、xxa2、xxa1、yya和yys由核糖核苷酸残基构成。核糖核苷酸残基可以是具有选自腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶的任一种核酸碱基的残基。核糖核苷酸残基还可以是修饰核糖核苷酸残基，例如可具有被修饰的核酸碱基(修饰碱基)。作为修饰，可列举：荧光色素(染料)标记、甲基化、卤化、假尿苷化、氨基化、脱氨基、硫醇化、二羟基化等，但并不限于这些。xs、xa、ya1、ya2、ya3和ys可分别独立为仅由非修饰核糖核苷酸残基构成的残基，也可以是除非修饰核糖核苷酸残基以外还包含修饰核糖核苷酸残基的残基，还可以是仅由修饰核糖核苷酸残基构成的残基。xs可在5’末端包含修饰核糖核苷酸残基。ys可在3’末端包含修饰核糖核苷酸残基。同样，xxs、xxa3、xxa2、xxa1、yya和yys可分别独立为仅由非修饰核糖核苷酸残基构成的残基，也可以是除非修饰核糖核苷酸残基以外还包含修饰核糖核苷酸残基的残基，还可以是仅由修饰核糖核苷酸残基构成的残基。xxs可在5’末端包含修饰核糖核苷酸残基。yys可在3’末端包含修饰核糖核苷酸残基。

在本发明中，通过连接工序产生的xa-ya1(通过连接使xa和ya1连接而得的核苷酸序列)与xs互补。在一个实施方式中，xs可以是19～28个核苷酸长度，例如可以是19～27个核苷酸长度、19～25个核苷酸长度、19～23个核苷酸长度、20～28个核苷酸长度、21个核苷酸～27个核苷酸、21个核苷酸～25个核苷酸、22～27个核苷酸长度、23～26个核苷酸长度、24～28个核苷酸长度或26～28个核苷酸长度。

在本发明中，通过连接工序产生的xxa1-yya(通过连接使xxa1和yya连接而得的核苷酸序列)与yys互补。在一个实施方式中，yys可以是19～28个核苷酸长度，例如可以是19～27个核苷酸长度、19～25个核苷酸长度、19～23个核苷酸长度、20～28个核苷酸长度、21个核苷酸～27个核苷酸、21个核苷酸～25个核苷酸、22～27个核苷酸长度、23～26个核苷酸长度、24～28个核苷酸长度或26～28个核苷酸长度。

在本发明中，xa与xs内的对应的残基或序列互补。在一个实施方式中，式(i)中xs的核苷酸序列与接头相邻且可包含c(胞嘧啶)。这种情况下，xa的核苷酸序列以与xs互补的方式、与接头相邻且包含g(鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(i)中xs的核苷酸序列与接头相邻且可包含cc(胞嘧啶-胞嘧啶)。这种情况下，xa的核苷酸序列以与xs互补的方式、与接头相邻且包含gg(鸟嘌呤-鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(i)中xs的核苷酸序列与接头相邻且可包含acc(腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶)。这种情况下，xa的核苷酸序列以与xs互补的方式、与接头相邻且包含ggu(鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶)。在一个实施方式中，xa可在3’末端包含碱基尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)。xa可以是1～20个核苷酸长度，例如可以是2～20个核苷酸长度、2～15个核苷酸长度、3～10个核苷酸长度、3～6个核苷酸长度、5～12个核苷酸长度或9～12个核苷酸长度。

在本发明中，xxa3与xxs互补。在一个实施方式中，式(a)中xxs的核苷酸序列与接头相邻且可包含c(胞嘧啶)。这种情况下，xxa3的核苷酸序列以与xxs互补的方式、与接头相邻且包含g(鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(a)中xxs的核苷酸序列与接头相邻且可包含cc(胞嘧啶-胞嘧啶)。这种情况下，xxa3的核苷酸序列以与xxs互补的方式、与接头相邻且包含gg(鸟嘌呤-鸟嘌呤)。在一个实施方式中，式(a)中xxs的核苷酸序列与接头相邻且可包含acc(腺嘌呤-胞嘧啶-胞嘧啶；以5’→3’的方向)。这种情况下，xxa3的核苷酸序列以与xxs互补的方式、与接头相邻且包含ggu(鸟嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶；以5’→3’的方向)。在一个实施方式中，xxa1的核苷酸序列可在3’末端包含碱基尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)。xxa3和xxs优选为1～7个核苷酸长度，例如为1～4个核苷酸长度、1个核苷酸长度或2个核苷酸长度。在一个实施方式中，在yys为26～28个核苷酸长度的情况下，xxa3和xxs可以是1个核苷酸长度。

在本发明中，ya3与ys互补。在一个实施方式中，ya3的核苷酸序列与接头相邻且可包含c(胞嘧啶)。这种情况下，ys的核苷酸序列以与ya3互补的方式、与接头相邻且包含g(鸟嘌呤)。ya3和ys优选为1～7个核苷酸长度，例如为1～4个核苷酸长度、1个核苷酸长度或2个核苷酸长度。在一个实施方式中，在xs为26～28个核苷酸长度的情况下，ya3和ys可以是1个核苷酸长度。

在本发明中，yya与yys内的对应的残基或序列互补。在一个实施方式中，yya的核苷酸序列与接头相邻且可包含c(胞嘧啶)。这种情况下，yys的核苷酸序列以与yya互补的方式、与接头相邻且包含g(鸟嘌呤)。yya可以是2～20个核苷酸长度，例如可以是2～15个核苷酸长度、3～10个核苷酸长度、3～6个核苷酸长度、5～12个核苷酸长度或9～12个核苷酸长度。

在本发明中，“互补”是指，2个核酸或核苷酸在其间可形成稳定的碱基配对。互补的2个核酸具有相同的核苷酸长度。互补的2个核酸典型的是由彼此的互补序列(互补链)构成、即完全互补。或者，互补的2个核酸可分别含有：修饰碱基、和在退火时在对应的位置可与该修饰碱基形成碱基对的核酸碱基。

当连接后的本发明所涉及的发夹型单链rna分子发生分子内退火(自身退火)时，ya2不与xs或ys形成碱基配对。ya2优选为1～4个核苷酸长度，例如为1个、2个或3个核苷酸长度。同样，当连接后的本发明所涉及的发夹型单链rna分子发生分子内退火(自身退火)时，xxa2不与xxs或yys形成碱基配对。xxa2优选为1～4个核苷酸长度，例如为1个、2个或3个核苷酸长度。

在第1单链寡rna分子(链1)中，式(i)中的xs和xa的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为21～48个核苷酸长度，例如为21～45个核苷酸长度、25～45个核苷酸长度、26～35个核苷酸长度、26～30个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度或33～36个核苷酸长度。

在第2单链寡rna分子(链2)中，式(ii)中的ya1优选为6～27个核苷酸长度，例如为7～25个核苷酸长度、10～25个核苷酸长度、12～23个核苷酸长度、12～22个核苷酸长度、12～15个核苷酸长度或18～23个核苷酸长度。

在第2单链寡rna分子(链2)中，式(ii)中的ya1、ya2、ya3和ys的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为13～45个核苷酸长度，例如为13～43个核苷酸长度、15～41个核苷酸长度、15～30个核苷酸长度、17～25个核苷酸长度或20～25个核苷酸长度。

在第1单链寡rna分子(链1)中，式(a)中的xxs、xxa3、xxa2和xxa1的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为13～45个核苷酸长度，例如为13～43个核苷酸长度、15～41个核苷酸长度、15～30个核苷酸长度、17～25个核苷酸长度或20～25个核苷酸长度。

xxa1优选为6～27个核苷酸长度，例如为7～25个核苷酸长度、10～25个核苷酸长度、12～23个核苷酸长度、12～22个核苷酸长度、12～15个核苷酸长度或18～23个核苷酸长度。

在第2单链寡rna分子(链2)中，式(b)中的yya和yys的总计核苷酸长度(不包括非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合等接头部分)优选为21～48个核苷酸长度，例如为21～45个核苷酸长度、25～45个核苷酸长度、26～35个核苷酸长度、26～30个核苷酸长度、26～28个核苷酸长度或33～36个核苷酸长度。

在本发明中，对接头、例如第1接头和第2接头没有特别限定，例如可分别独立为非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合。核苷酸性接头由1个以上的核苷酸残基(核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基、优选核糖核苷酸残基)构成。非核苷酸性接头不含核苷酸残基。对本发明中使用的接头的构成单位没有特别限定，可以是核苷酸残基和/或非核苷酸残基。作为非核苷酸性接头与核苷酸性接头的组合的接头包含核苷酸残基和非核苷酸残基两者。本发明的接头例如可由以下(1)～(7)中的任意一种残基构成：

(1)非修饰核苷酸残基；

(2)修饰核苷酸残基；

(3)非修饰核苷酸残基与修饰核苷酸残基的组合；

(4)非核苷酸残基；

(5)非核苷酸残基与非修饰核苷酸残基的组合；

(6)非核苷酸残基与修饰核苷酸残基的组合；

(7)非核苷酸残基、非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基的组合。

在一个实施方式中，第1接头和第2接头均可为由核苷酸残基构成的接头(核苷酸性接头)，或者均可为由非核苷酸残基构成的接头(非核苷酸性接头)。或者，可以是第1接头和第2接头中的一方由核苷酸残基构成、而另一方由非核苷酸残基构成。第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2的接头)可为相同结构也可为不同结构。

在本发明中使用的接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)包含非核苷酸残基的情况下，对非核苷酸残基的个数没有特别限定，例如可以是1～8个、1～6个、1～4个、1个、2个或3个。“非核苷酸残基”是指，非核苷酸性接头的构成单位。非核苷酸残基并不限于以下的残基，例如可以是具有吡咯烷骨架或哌啶骨架的环状胺衍生物等。非核苷酸残基例如可以是以后述的式(iii)所表示的结构为单元(1个)的残基。

在本发明的一个实施方式中，接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)可以是包含1个以上的吡咯烷骨架和哌啶骨架中的至少一方的非核苷酸性接头。第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)可为相同结构也可为不同结构。第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)可分别独立地具有包含吡咯烷骨架的非核苷酸结构，也可具有包含哌啶骨架的非核苷酸结构，还可具有上述包含吡咯烷骨架的非核苷酸结构和上述包含哌啶骨架的非核苷酸结构的两者。利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子通过这样的接头使有义链和反义链连接，从而核酸酶耐性优异。

在本发明的发夹型单链rna分子中，吡咯烷骨架例如可以是构成吡咯烷的5元环的1个以上的碳原子被取代而得的吡咯烷衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为2位的碳原子(c-2)以外的碳原子。上述碳原子例如可被氮原子、氧原子或硫原子取代。吡咯烷骨架例如可在吡咯烷的5元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。在上述吡咯烷骨架中，构成吡咯烷的5元环的碳原子和氮原子例如可结合氢原子，也可结合如后所述的取代基。接头lx1例如可经由上述吡咯烷骨架的任何基团连接式(i)中的xs和xa、以及式(a)中的xxs和xxa3。接头lx2例如可经由上述吡咯烷骨架的任何基团连接式(ii)中的ya3和ys、以及式(b)中的yya和yys。它们可经由上述5元环的任意一个碳原子和氮原子、优选上述5元环的2位的碳原子(c-2)和氮原子进行连接。作为上述吡咯烷骨架，例如可列举脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。

上述哌啶骨架例如可以是构成哌啶的6元环的1个以上的碳被取代而得的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情况下，例如优选为c-2的碳原子以外的碳原子。上述碳原子例如可被氮原子、氧原子或硫原子取代。上述哌啶骨架例如可在哌啶的6元环内包含例如碳-碳双键或碳-氮双键。在上述哌啶骨架中，构成哌啶的6元环的碳原子和氮原子例如可结合氢原子，也可结合如后所述的取代基。接头lx1例如可经由上述哌啶骨架的任何基团连接式(i)中的xs和xa、以及式(a)中的xxs和xxa3。接头lx2例如可经由上述哌啶骨架的任何基团连接式(ii)中的ya3和ys、以及式(b)中的yya和yys。它们可经由上述6元环的任意一个碳原子和氮原子、优选上述6元环的2位的碳原子(c-2)和氮原子进行连接。

上述接头例如可以仅包含由上述的非核苷酸结构构成的非核苷酸残基。

上述接头区例如可由下述式(iii)表示、或者可包含1个或2个以上的下述式(iii)所表示的非核苷酸残基：

[化学式2]

上述式(iii)中，

x¹和x²分别独立为h2、o、s或nh；

y¹和y²分别独立为单键、ch2、nh、o或s；

r³为与环a上的c-3、c-4、c-5或c-6结合的氢原子或取代基；

l¹为由n个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被oh、or^a、nh2、nhr^a、nr^ar^b、sh或sr^a取代也可不被取代；或者

l¹为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，

这里，在y¹为nh、o或s的情况下，与y¹结合的l¹的原子为碳，与or¹结合的l¹的原子为碳，氧原子彼此不相邻；

l²为由m个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被oh、or^c、nh2、nhr^c、nr^cr^d、sh或sr^c取代也可不被取代；或者

l²为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，

这里，在y²为nh、o或s的情况下，与y²结合的l²的原子为碳，与or²结合的l²的原子为碳，氧原子彼此不相邻；

r^a、r^b、r^c和r^d分别独立为取代基或保护基；

l为1或2；

m为0～30的范围的整数；

n为0～30的范围的整数；

环a中，环a上的c-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子、硫原子取代，

在环a内可包含碳-碳双键或碳-氮双键，

这里，r¹和r²可存在也可不存在，在存在的情况下，r¹和r²分别独立为：由不存在r¹和r²的式(iii)表示的非核苷酸残基。

式(i)中的xs和xa、式(a)中的xxs和xxa3可经由式(iii)中的-or¹-或-or²-与接头lx1连接。在一个实施方式中，xs可经由-or¹-与接头lx1连接、而xa可经由-or²-与接头lx1连接。在另一个实施方式中，xs可经由-or²-与接头lx1连接、而xa可经由-or¹-与接头lx1连接。在又一个实施方式中，xxs可经由-or¹-与接头lx1连接、而xxa3可经由-or²-与接头lx1连接。在又一个实施方式中，xxs可经由-or²-与接头lx1连接、而xxa3可经由-or¹-与接头lx1连接。

式(ii)中的ya3和ys、式(b)中的yya和yys可经由式(iii)中的-or¹-或-or²-与接头lx2连接。在一个实施方式中，ya3可经由-or¹-与接头lx2连接、而ys可经由-or²-与接头lx2连接。在另一个实施方式中，ya3可经由-or²-与接头lx2连接、而ys可经由-or¹-与接头lx2连接。在又一个实施方式中，yya可经由-or¹-与接头lx2连接、而yys可经由-or²-与接头lx2连接。在又一个实施方式中，yya可经由-or²-与接头lx2连接、而yys可经由-or¹-与接头lx2连接。

在一个优选实施方式中，xs可经由-or²-与接头lx1连接、而xa可经由-or¹-与接头lx1连接，而且ya3可经由-or²-与接头lx2连接、而ys可经由-or¹-与接头lx2连接。在另一个优选实施方式中，xxs可经由-or²-与接头lx1连接、而xxa3可经由-or¹-与接头lx1连接，而且yya可经由-or²-与接头lx2连接、而yys可经由-or¹-与接头lx2连接。

上述式(iii)中，x¹和x²例如分别独立为h2、o、s或nh。在上述式(iii)中，x¹为h2是指，x¹和x¹所结合的碳原子一起形成ch2(亚甲基)。关于x²亦同。

上述式(iii)中，y¹和y²分别独立为单键、ch2、nh、o或s。

上述式(iii)中，在环a中，l为1或2。在l=1的情况下，环a为5元环，例如为上述吡咯烷骨架。上述吡咯烷骨架例如可列举脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，可例示它们的二价结构。在l=2的情况下，环a为6元环，例如为上述哌啶骨架。环a中，环a上的c-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代。另外，环a可在环a内包含碳-碳双键或碳-氮双键。环a例如可为l型和d型的任一种。

上述式(iii)中，r³为与环a上的c-3、c-4、c-5或c-6结合的氢原子或取代基。在r³为上述取代基的情况下，取代基r³可为1个也可为多个，还可以不存在，在为多个的情况下可相同也可不同。

取代基r³例如为卤素、oh、or⁴、nh2、nhr⁴、nr⁴r⁵、sh、sr⁴或氧代基(=o)等。

r⁴和r⁵例如分别独立为取代基或保护基，可相同也可不同。上述取代基例如可列举：卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基(cyclyl)烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基等。以下亦同。取代基r³可以是列举的这些取代基。

上述保护基例如为使反应性高的官能团转换为惰性的官能团，可列举已知的保护基等。上述保护基例如可引用文献(j.f.w.mcomie,“protectinggroupsinorganicchemistry”plenumpress,londonandnewyork,1973)的记载。对上述保护基没有特别限定，例如可列举：叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(ace)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(tom)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(cee)、2-氰基乙氧基甲基(cem)和甲苯基磺酰基乙氧基甲基(tem)、二甲氧基三苯甲基(dmtr)等。在r³为or⁴的情况下，对上述保护基没有特别限定，例如可列举：tbdms基、ace基、tom基、cee基、cem基和tem基等。除此之外，还可列举含甲硅烷基的基团。以下亦同。

上述式(iii)中，l¹为由n个原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可被oh、or^a、nh2、nhr^a、nr^ar^b、sh或sr^a取代，也可不被取代。或者，l¹可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。上述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，在y¹为nh、o或s的情况下，与y¹结合的l¹的原子为碳，与or¹结合的l¹的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在y¹为o的情况下，其氧原子与l¹的氧原子不相邻，or¹的氧原子与l¹的氧原子不相邻。

上述式(iii)中，l²为由m个原子构成的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可被oh、or^c、nh2、nhr^c、nr^cr^d、sh或sr^c取代，也可不被取代。或者，l²可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。需要说明的是，在y²为nh、o或s的情况下，与y²结合的l²的原子为碳，与or²结合的l²的原子为碳，氧原子彼此不相邻。即，例如在y²为o的情况下，其氧原子与l²的氧原子不相邻，or²的氧原子与l²的氧原子不相邻。

对l¹的n和l²的m没有特别限定，各自下限例如为0，上限也没有特别限定。n和m例如可根据接头lx1和lx2的所期望的长度而适当设定。从制备成本和收率等方面考虑，n和m例如分别优选0～30，更优选为0～20，进一步优选为0～15。n和m可以相同(n=m)也可不同。n+m例如为0～30，优选为0～20，更优选为0～15。

r^a、r^b、r^c和r^d例如分别独立为取代基或保护基。上述取代基和上述保护基例如与上述相同。

上述式(iii)中，氢原子例如可分别独立地被cl、br、f和i等卤素取代。

在优选的实施方式中，上述接头为下述式(iv-1)～(iv-9)的任一个所表示的接头，或者可以是包含1个或2个以上的下述式(iv-1)～(iv-9)所表示的非核苷酸残基的接头。在下述式中，q为0～10的整数。在下述式中，n和m与上述式(iii)相同。作为具体例子，可列举：式(iv-1)中n=8、式(iv-2)中n=3、式(iv-3)中n=4或8、式(iv-4)中n=7或8、式(iv-5)中n=3和m=4、式(iv-6)中n=8和m=4、式(iv-7)中n=8和m=4、式(iv-8)中n=5和m=4、式(iv-9)中q=1和m=4。

[化学式3]

在一个实施方式中，上述接头为下述式(v)或(vi)所表示的接头，或者可以是包含1个或2个以上的下述式(v)或(vi)所表示的非核苷酸残基的接头。

[化学式4]

[化学式5]

在一个实施方式中，第1rna部分(xs、xxs)可在式(vi)中的2位碳原子侧与接头lx1连接、而第2rna部分(xa、xxa3)可在式(vi)中的1位氮原子侧与接头lx1连接，第3rna部分(ya3、yya)可在2位碳原子侧与接头lx2连接、而第4rna部分(ys、yys)可在式(vi)中的1位氮原子侧与接头lx2连接。

式(vi)所表示的接头可以是下述式(vi-1)或(vi-2)所表示的光学活性体。

[化学式6]

[化学式7]

在第1和第2单链寡rna分子中，xa与xs的3’侧区互补，ya3与ys互补。因此，在第1单链寡rna分子中，xa朝向xs折叠，xa与xs通过自身退火形成双链。同样，在第2单链寡rna分子中，ys朝向ya3折叠，ys与ya3通过自身退火形成双链。

在第1和第2单链寡rna分子中，yya与yys的5’侧区互补，xxa3与xxs互补。因此，在第1单链寡rna分子中，xxa3朝向xxs折叠，xxa3与xxs通过自身退火形成双链。同样，在第2单链寡rna分子中，yya朝向yys折叠，yya与yys通过自身退火形成双链。

上述这样的接头容易形成β-转角结构。因此，认为式(i)的第1单链寡rna分子由于接头lx1而采取在β-转角侧折叠的结构，由此，当xa和xs进行自身退火时采取xa的3’末端容易接近式(ii)的第2单链寡rna分子的5’末端(ya1的5’末端)的结构。关于式(a)和(b)的第1和第2单链寡rna分子亦同。

在另一个实施方式中，接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)可以是由1个以上的核苷酸残基构成的核苷酸性接头。在接头为核苷酸性接头的情况下，对其长度没有特别限定，但优选为不会妨碍接头前后的序列、例如第1rna部分和第2rna部分、或者第3rna部分和第4rna部分的双链形成的长度。作为核苷酸性接头的第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)的长度(核苷酸数)和核苷酸序列可以相同也可不同。其核苷酸性接头的长度例如可以是1个核苷酸以上、2个核苷酸以上或3个核苷酸以上，并且，例如可以是100个核苷酸以下、80个核苷酸以下或50个核苷酸以下。这样的核苷酸性接头的长度例如可以是1～50个核苷酸、1～30个核苷酸、3～20个核苷酸、3～10个核苷酸或3～7个核苷酸，例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。核苷酸性接头优选为自身不互补、且在序列内部不会发生自身退火的结构。

在本发明中使用的接头、例如第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)包含非修饰核苷酸残基和修饰核苷酸残基(例如，修饰核糖核苷酸残基)的情况下，对修饰核苷酸残基的个数没有特别限定，例如可以是1～5个、1～4个、1～3个、例如1个或2个。

作为本发明中使用的核苷酸性接头的例子，可列举由5’-c-a-c-a-c-c-3’、5’-c-c-a-c-a-c-c-3’或5’-u-u-c-g-3’的rna序列构成的接头。在一个实施方式中，第1接头和第2接头(上述式中，lx1和lx2)分别独立地选自5’-c-a-c-a-c-c-3’、5’-c-c-a-c-a-c-c-3’和5’-u-u-c-g-3’。在一个实施方式中，第1接头由5’-c-a-c-a-c-c-3’的rna序列构成，而第2接头由5’-u-u-c-g-3’的rna序列构成。

第1和第2单链寡rna分子可利用本领域技术人员所已知的rna合成法进行制作。作为本领域技术人员所已知的rna合成法，例如可列举亚磷酰胺法或h-膦酸酯法等。在亚磷酰胺法中，将与载体的疏水性基团结合的核糖核苷通过其与rna亚酰胺(核糖核苷亚磷酰胺)的缩合反应而延伸，经过氧化和脱保护，再重复进行与rna亚酰胺的缩合反应，从而可进行rna合成。若以式(i)和(ii)的第1和第2单链寡rna分子为例进行说明，则本发明所涉及的第1和第2单链寡rna分子可如下制作：利用rna合成法、例如亚磷酰胺法进行从3’末端侧到接头之前的序列(xa、ys)的合成，之后结合具有吡咯烷骨架或哌啶骨架的环状胺衍生物这样的非核苷酸残基而形成接头，在其末端进一步依次进行从接头到5’末端的序列(xs；或ya3、ya2和ya1)的合成，从而即可制得。或者，本发明所涉及的第1和第2单链寡rna分子可如下制作：利用rna合成法、例如亚磷酰胺法进行从3’末端侧到核苷酸性接头之前的序列(xa、ys)的合成，接着合成核苷酸性接头的序列，再依次进行从核苷酸性接头之后到5’末端的序列(xs；或ya3、ya2和ya1)的合成，从而即可制得。在使用非核苷酸性接头与核苷酸性接头的组合的情况下和使用式(a)和(b)的第1和第2单链寡rna分子的情况下，也可按照上述方法进行制作。在本发明中，可使用任意的rna亚酰胺，例如还可使用在2位的羟基上具有叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(tom)、双(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ace)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(cee)、2-氰基乙氧基甲基(cem)、甲苯基磺酰基乙氧基甲基(tem)、二甲氧基三苯甲基(dmtr)等各种保护基的通用型rna亚酰胺。另外，在本发明中，在rna合成中，可使用聚苯乙烯系载体、丙烯酰胺系载体或玻璃载体等任意的固相载体。载体可以是珠、平板、碎片、管等任意形态。作为载体的例子，可列举聚苯乙烯珠、例如nittophase^(r)hlrg(ibu)或ru(kinovate)，但并不限于这些。

在上述接头中，用于形成非核苷酸性接头的环状胺衍生物为rna合成用的单体，例如具有下述式(vii)的结构。该环状胺衍生物基本上与上述的各接头结构对应，关于接头结构的说明也可引用到该环状胺衍生物中。形成接头的环状胺衍生物例如可用作自动核酸合成用的亚酰胺，例如可适用于普通的核酸自动合成装置。

[化学式8]

上述式(vii)中，

x¹和x²分别独立为h2、o、s或nh；

y¹和y²分别独立为单键、ch2、nh、o或s；

r¹和r²分别独立为h、保护基或磷酸保护基；

r³为与环a上的c-3、c-4、c-5或c-6结合的氢原子或取代基；

l¹为由n个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被oh、or^a、nh2、nhr^a、nr^ar^b、sh或sr^a取代，也可不被取代；或者

l¹为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链；

这里，在y¹为nh、o或s的情况下，与y¹结合的l¹的原子为碳，与or¹结合的l¹的原子为碳，氧原子彼此不相邻；

l²为由m个原子构成的亚烷基链，这里，亚烷基碳原子上的氢原子可被oh、or^c、nh2、nhr^c、nr^cr^d、sh或sr^c取代，也可不被取代；或者

l²为上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链；

这里，在y²为nh、o或s的情况下，与y²结合的l²的原子为碳，与or²结合的l²的原子为碳，氧原子彼此不相邻；

r^a、r^b、r^c和r^d分别独立为取代基或保护基；

l为1或2；

m为0～30的范围的整数；

n为0～30的范围的整数；

环a中，环a上的c-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代；

在环a内可包含碳-碳双键或碳-氮双键。

在上述式(vii)中，关于与上述式(iii)相同的位置，可引用上述式(iii)的说明。具体而言，在上述式(vii)中，例如x¹、x²、y¹、y²、r³、l¹、l²、l、m、n和环a可全部引用上述式(iii)的说明。

在上述式(vii)中，如上所述，r¹和r²分别独立为h、保护基或磷酸保护基。

上述保护基例如与上述式(iii)中的说明同样，作为具体例子，例如可选自组i。上述组i例如可列举：二甲氧基三苯甲基(dmtr)、tbdms基、ace基、tom基、cee基、cem基、tem基和下述式所示的含甲硅烷基的基团，其中，优选为dmtr基和上述含甲硅烷基的基团的任一种。

[化学式9]

上述磷酸保护基例如可由下式表示。

在上述式中，r⁶为氢原子或任意的取代基。r⁶例如优选烃基，上述烃基可被吸电子基团取代，也可不被取代。r⁶例如可列举：卤素、卤代烷基、杂芳基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基和烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基等烃等，而且，可被吸电子基团取代也可不被取代。具体而言，r⁶例如可列举：β-氰基乙基、硝基苯基乙基、甲基等。

r⁷和r⁸分别为氢原子或任意的取代基，可以相同也可不同。r⁷和r⁸例如优选烃基，上述烃基可进一步被任意的取代基取代，也可不被取代。上述烃基例如与上述的上述r⁶中的列举同样，优选为甲基、乙基、异丙基。这种情况下，具体而言，-nr⁷r⁸例如可列举二异丙基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基等。或者，取代基r⁷和r⁸成为一体，可与它们所结合的氮原子一起(即，-nr⁷r⁸成为一体)形成含氮环(例如，哌啶基、吗啉代基等)。

作为上述磷酸保护基的具体例子，例如可选自下述组ii。组ii例如可列举：-p(och2ch2cn)(n(i-pr)2)、-p(och3)(n(i-pr)2)等。在上述式中，i-pr表示异丙基。

在上述式(vii)中，例如，r¹和r²中的任意一方为h或保护基，而另一方为h或磷酸保护基。优选例如在r¹为上述保护基的情况下，r²优选h或上述磷酸保护基，具体而言，在r¹选自上述组i的情况下，r²优选选自h或上述组ii。另外，优选例如在r¹为上述磷酸保护基的情况下，r²优选h或上述保护基，具体而言，在r¹选自上述组ii的情况下，r²优选选自h或上述组i。

上述环状胺衍生物可以是下述式(vii-1)～(vii-9)的任一者所表示的物质。在下述式中，n和m与上述式(vii)相同。在下述式中，q为0～10的整数。作为具体例子，可列举：式(vii-1)中n=8、式(vii-2)中n=3、式(vii-3)中n=4或8、式(vii-4)中n=7或8、式(vii-5)中n=3和m=4、式(vii-6)中n=8和m=4、式(vii-7)中n=8和m=4、式(vii-8)中n=5和m=4、式(vii-9)中q=1和m=4。

[化学式10]

在一个实施方式中，上述环状胺衍生物可以是由下述式(viii)所表示的脯氨醇衍生物或下述式(ix)所表示的脯氨酸衍生物表示的物质。

[化学式11]

上述环状胺衍生物例如可包含标记物质、例如稳定同位素。

上述环状胺衍生物例如可按照国际公开wo2013/027843或国际公开wo2016/159374中记载的、核酸分子合成用单体的制备方法来合成。

在本发明的方法中，通过将上述的第1单链寡rna分子(例如，图1中的链1)和第2单链寡rna分子(例如，图1中的链2)退火、连接，可制备本发明所涉及的抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子。

在利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子中，通过连接工序产生的xa-ya1-ya2-ya3包含针对靶基因的基因表达抑制序列。基因表达抑制序列可包含在xa、xa-ya1、xa-ya1-ya2或xa-ya1-ya2-ya3中。同样，通过连接工序产生的xxa3-xxa2-xxa1-yya包含针对靶基因的基因表达抑制序列。基因表达抑制序列可包含在yya、xxa1-yya、xxa2-xxa1-yya或xxa3-xxa2-xxa1-yya中。基因表达抑制序列优选为由靶基因转录的mrna的整体或一部分的有义序列或反义序列。需要说明的是，由于通过连接工序产生的xa-ya1与xs互补，所以xs也可包含针对靶基因的基因表达抑制序列。同样，由于xxa1-yya与yys互补，所以yys也可包含针对靶基因的基因表达抑制序列。

上述发夹型单链rna分子可包含1个基因表达抑制序列，也可包含2个以上。上述发夹型单链rna分子例如可具有2个以上的针对相同靶基因的相同的基因表达抑制序列，也可具有2个以上的针对相同靶基因的不同的基因表达抑制序列，还可具有2个以上的针对不同靶基因的不同的基因表达抑制序列。具有2个以上的针对不同靶基因的基因表达抑制序列的发夹型单链rna分子可用于抑制2种以上的不同靶基因的表达。在本发明中，“基因”是指，转录成mrna的基因组区，可以是蛋白编码区，也可以是rna编码区。

本发明所涉及的发夹型单链rna分子具有经由基因表达抑制序列而抑制靶基因表达的能力。基于本发明所涉及的发夹型单链rna分子的靶基因的表达抑制，优选为基于rna干扰的表达抑制，但并不限于此。rna干扰通常是指下述现象：长的双链rna(dsrna)在细胞内被dicer切割成3’末端突出的19～21个碱基对左右的短的双链rna(sirna：smallinterferingrna(小干扰rna))，其中之一的单链rna与靶mrna结合而降解靶mrna，从而抑制靶mrna的翻译，由此抑制源自靶mrna的靶基因的表达。关于与靶mrna结合的sirna中所含的单链rna的序列，例如根据靶基因的种类已经报道了各种类型。本发明例如可使用sirna中所含的单链rna的序列(优选反义序列)作为基因表达抑制序列。利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子在体内被切割而生成sirna，从而可抑制靶基因的表达。本发明所涉及的发夹型单链rna分子可用于治疗或预防与靶基因的表达或表达增加有关的疾病或病症。

基因表达抑制序列优选为19～30个核苷酸长度，更优选为19～27个核苷酸长度，例如可以是19、20、21、22或23个核苷酸长度。基因表达抑制序列优选由与靶基因的mrna的至少一部分序列完全相同或完全互补的rna序列构成。基因表达抑制序列可针对靶基因的核苷酸序列通过常规方法进行设计。

靶基因可以是任意的基因，例如可以是任意的疾病相关基因。靶基因优选为源自与通过发夹型单链rna分子在生物体、细胞、组织或器官等中带来基因表达抑制的对象相同的生物种的基因，例如可以是源自动物、植物、真菌等的基因，所述动物包括：人、黑猩猩、大猩猩等灵长类，马、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、驴等家畜，狗、猫、兔等宠物，小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类等在内的哺乳动物；鱼类、昆虫等。作为靶基因，没有特别限定，例如可列举：tgf-β1基因、gapdh基因、lama1基因、lmna基因。人tgf-β1(转化生长因子-β1)基因的mrna序列例如可根据genbank(ncbi)登录号(accessionnumber)nm_000660来获取(ncbigeneid：7040)。人gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的mrna序列例如可根据genbank(ncbi)登录号nm_002046来获取(ncbigeneid：2597)。人lama1基因的mrna序列例如可根据genbank登录号nm_005559来获取(ncbigeneid：284217)。人lmna基因的mrna序列例如可根据genbank登录号nm_170707来获取(ncbigeneid：4000)。在靶基因为tgf-β1基因的情况下，利用本发明的方法制备的发夹型单链rna分子在体内抑制tgf-β1基因的表达。这样的发夹型单链rna分子可通过tgf-β1基因的基因表达抑制，而用于治疗或预防与tgf-β1基因的表达或表达增加有关的疾病或病症、例如肺纤维化或急性肺病。同样，抑制gapdh基因、lama1基因、lmna基因等其他靶基因表达的本发明所涉及的发夹型单链rna分子也可通过该靶基因的表达抑制，而用于治疗或预防与该靶基因的表达或表达增加有关的疾病或病症。

利用本发明的方法制备的、抑制靶基因表达的发夹型单链rna分子的1个例子为下述的rna分子：由seqidno:1所表示的核苷酸序列构成、并且第24位和第25位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由接头(lx1)连接、而第50位和第51位的核苷酸(核糖核苷酸残基)经由接头(lx2)连接的rna分子(例如，图2)。由seqidno:1所表示的核苷酸序列构成的这样的发夹型单链rna分子以5’末端→3’末端的方向包含：由seqidno:2所表示的核苷酸序列构成的rna序列、上述的接头(非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合；图1的lx1)、由seqidno:3所表示的核苷酸序列构成的rna序列、上述的接头(非核苷酸性接头、核苷酸性接头、或它们的组合；图1的lx2)和碱基g(鸟嘌呤)。由seqidno:1所表示的核苷酸序列构成的上述发夹型单链rna分子包含针对作为靶基因的tgf-β1基因的基因表达抑制序列。seqidno:1所表示的核苷酸序列的第29位～第47位的序列相当于基因表达抑制序列(活性序列；seqidno:50)。本发明提供：包含该基因表达抑制序列的发夹型单链rna分子的制备方法。

用于制备这样的rna分子的第1单链寡rna分子(链1)和第2单链寡rna分子(链2)的例子，列举在后述的表1中。在表1所列举的第1单链寡rna分子(链1)和第2单链寡rna分子(链2)的序列中，包含p(脯氨酸衍生物)的接头可取代成上述的其他非核苷酸性接头或核苷酸性接头等任意的接头。在一个实施方式中，第1单链寡rna分子优选在3’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)，并且，第2单链寡rna分子优选在5’末端具有尿嘧啶(u)或腺嘌呤(a)。

作为用于制备由seqidno:1所表示的核苷酸序列构成的发夹型单链rna分子的特别优选的第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的对，可列举以下的组合：

(1)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:7所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:6所表示的核苷酸序列构成，其中第10位和第11位的核糖核苷酸残基经由第2接头(lx2)进行连接；

(2)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:19所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:18所表示的核苷酸序列构成，其中第16位和第17位的核糖核苷酸残基经由第2接头(lx2)进行连接；

(3)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:27所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:26所表示的核苷酸序列构成，其中第20位和第21位的核糖核苷酸残基经由第2接头(lx2)进行连接；

(4)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:29所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:28所表示的核苷酸序列构成，其中第21位和第22位的核糖核苷酸残基经由第2接头(lx2)进行连接；

(5)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:31所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:30所表示的核苷酸序列构成，其中第22位和第23位的核糖核苷酸残基经由第2接头(lx2)进行连接；以及

(6)第1单链寡rna分子与第2单链寡rna分子的组合，所述第1单链寡rna分子由seqidno:33所表示的核苷酸序列构成，其中第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接，所述第2单链寡rna分子由seqidno:32所表示的核苷酸序列构成，其中第23位和第24位的核糖核苷酸残基经由第2接头(lx2)进行连接。这些第1单链寡rna分子在3’末端(xa的3’末端)包含u或a。这些第2单链寡rna分子在5’末端(ya1的5’末端)包含u或a。

这里，例如，关于(1)的第1单链寡rna分子，“第24位和第25位的核糖核苷酸残基经由第1接头(lx1)进行连接”是指，在第1单链寡rna分子中seqidno:19所表示的核苷酸序列的第24位的核糖核苷酸残基(碱基：c)与第25位的核糖核苷酸残基(碱基：g)经由第1接头lx1结合。需要说明的是，本发明中的关于单链寡rna分子和发夹型单链rna分子的“第x位和第y位的核糖核苷酸残基经由z连接”的表述也依据此来解释。

在(1)～(6)的第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子中，接头lx1和lx2优选为式(vi)、例如式(vi-1)或式(vi-2)所表示的接头。

在优选的实施方式中，(1)～(6)的第1单链寡rna分子和第2单链寡rna分子具有式(vi)所示的接头作为lx1和lx2，式(i)的xa可在式(vi)中的1位氮原子侧与接头lx1连接，而xs可在2位碳原子侧与接头lx1连接，ys可在式(vi)中的1位氮原子侧与接头lx2连接，而ya3可在2位碳原子侧与接头lx2连接。

为了按照本发明的方法制备发夹型单链rna分子，本发明提供单链寡rna分子，所述单链寡rna分子可用作第1单链寡rna分子或第2单链寡rna分子。

在一个实施方式中，作为用于制备抑制作为靶基因的tgf-β1基因表达的发夹型单链rna分子的单链寡rna分子的例子，可列举下述(a)～(l)，但并不限于这些：