相关专利申请的交叉引用本专利申请要求于2018年4月13日提交的国际专利申请号pct/cn2018/082945的优先权权益，其公开内容全文以引用方式并入本文中。本专利申请涉及癌症免疫疗法的领域。更具体而言，本专利申请提供用于使用肿瘤抗原特异性t细胞治疗个体中癌症的方法、组合物以及试剂盒。
背景技术：
：：人体具有精密的免疫系统，以保护自身来抵御疾病。发动身体自身的抗癌免疫力已是肿瘤学上长久以来的理想。肿瘤抗原会引发对肿瘤的天然免疫反应。抗原递呈细胞(antigenpresentingcell,apc)，尤其是树突细胞(dendriticcell,dc)，可处理并在其细胞表面上呈现肿瘤抗原。成熟之后，载有肿瘤抗原的dc可触发t细胞反应，该t细胞反应涉及细胞毒性t细胞、辅助t细胞、和功能上不同的效应t细胞和记忆t细胞，其对抗表达肿瘤抗原的癌细胞。一种特别强大的t细胞反应类型涉及生产细胞毒性t细胞，其可通过释放细胞因子、酶、和细胞毒素，或通过经由细胞间相互作用诱导促进细胞凋亡的信号传导级联反应，来杀死癌细胞。基于细胞的癌症免疫疗法寻求通过向患者施用免疫介导细胞来治疗癌症，此类免疫介导细胞经制备以靶向肿瘤抗原。fda所批准的(sipuleucel-t)是一种基于dc的疗法，其包括使患者的周边血液单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)暴露于融合蛋白，该融合蛋白包括耦合至细胞因子的肿瘤衍生抗原；然后向该患者输注此类pbmc，推测此类pbmc含有可向t细胞呈现该肿瘤衍生抗原的活化dc。参见美国专利号6,210,662。过继性t细胞疗法涉及自患者的肿瘤分离肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte,til)，体外扩增此类til，且在耗尽患者的天然非骨髓性淋巴细胞后将此类til输注回该患者。参见restifonpetal.(2012)nat.rev.immunol.12:269-81。具有经工程改造的t细胞受体的t细胞(tcr-t)或具有嵌合抗原受体的t细胞(car-t)是通过修饰t细胞-肿瘤相互作用的微环境，来进一步扩增过继性t细胞疗法方法的能力。最近，多抗原特异性细胞疗法(multipleantigenspecificcelltherapy,“masct”)方法已经设计以利用dc和活化t细胞两者的治疗能力，以便为癌症患者提供安全、持久且可定制的治疗。参见国际专利申请公布号wo2016145578a1。改良masct方法已描述于国际专利申请公布号pct/cn2018/081338中。在本文中所参照的所有出版物、专利、专利申请、和已公开专利申请的公开内容全文特此以引用方式并入本文中。技术实现要素：本专利申请提供制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法、和使用此类肿瘤抗原特异性t细胞治疗个体中癌症的方法。本专利申请的一个方面提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞群的方法，该方法包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一树突细胞(“dc”)群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽(例如，来自该多种肿瘤抗原肽的一肿瘤抗原肽、或该多种肿瘤抗原肽)的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，该第一共培养步骤在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至约3天、约2天、或约3天)。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该t细胞群与载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群之间的比率不大于约30:1(诸如约10:1至约20:1、或约15:1、或约20:1)。在一些实施方案中，载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群与该t细胞群在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体，诸如shr-1210)。在一些实施方案中，该第一共培养基包含il-2和抗pd-1抗体。在一些实施方案中，该第一共培养基包含il-2、il-7、il-15、和il-21、和抗pd-1抗体。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(apc，诸如pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，ifnγ)。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、约2:1、或约4:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与载有该多种肿瘤抗原肽的该第二dc群共培养约12至25天(诸如约15天至21天)。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二dc群与该经富集的活化t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子包括il-2。在一些实施方案中，该一种或多种细胞因子包括il-2、il-7、il-15、和il-21。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂为抗pd-1抗体(例如，shr-1210)。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽(例如，来自该多种肿瘤抗原肽的一肿瘤抗原肽、或该多种肿瘤抗原肽)的抗原递呈细胞(apc)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，此类apc为pbmc。在一些实施方案中，此类apc为dc，其中该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、约2:1、或约4:1)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第三dc群共培养约5至9天(诸如约7天)。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc群在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、和il-15)和抗cd3抗体(例如，okt3)。在一些实施方案中，该第三共培养基包含il-2和okt3。在一些实施方案中，该第三共培养基包含il-2、il-7、il-15、和okt3。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤，例如一次、两次、或三次。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该第一共培养步骤进一步包括使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群。在一些实施方案中，该第二共培养步骤进一步包括使dc群与来自多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的该第二dc群。在一些实施方案中，该第一共培养步骤包括在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群，该dc成熟培养基包含toll样受体(toll-likereceptor,tlr)激动剂。在一些实施方案中，该第二共培养步骤包括在dc成熟培养基中培养载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二dc群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，该dc成熟培养基包含infγ、mpla、和pge2。在一些实施方案中，通过诱导来自pbmc的单核细胞群分化来获得该dc群。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，该dc群和该t细胞群获自相同个体，例如正接受治疗的个体。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽为多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本。在一些根据上述方法中任一者的实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括(多种)一般肿瘤抗原肽、(多种)癌症类型特异性抗原肽、和/或新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽(例如，由新抗原肽组成)。在一些实施方案中，该多种肿瘤抗原肽包括至少约5种(例如，至少约10、20、30、40、或更多种)不同肿瘤抗原肽。本专利申请的另一个方面提供一种分离细胞群，其是使用上述方法中任一者制备。在一些实施方案中，该分离细胞群包括至少约3％的经该多种肿瘤抗原肽刺激时分泌inf-γ的肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，该分离细胞群包括至少约3％的经该多种肿瘤抗原肽刺激时分泌tnf-α的肿瘤抗原特异性t细胞。还提供的是一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过上述方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，dc和肿瘤抗原特异性t细胞是衍生自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，该方法进一步包括：冷冻此类肿瘤抗原特异性t细胞群，以获得冷冻储备液；将来自该冷冻储备液的经解冻的肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，dc或pbmc)群共培养，以提供第二肿瘤抗原特异性t细胞群；以及施用有效量的该第二肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，该方法包括一个或多个周期的下列者：(a)将来自此类肿瘤抗原特异性t细胞的储备液的肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，dc或pbmc)群共培养，以提供进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群；以及(b)施用有效量的来自该进一步群的肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，此类肿瘤抗原特异性t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下施用。在一些根据上述治疗方法中任一者的实施方案中，该个体是人类个体。在一些实施方案中，该个体先前已接受免疫疗法。在一些实施方案中，该个体对免疫疗法有免疫反应。在一些实施方案中，该免疫疗法是选自：免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、和其组合。在一些实施方案中，该个体能够发展出对该多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。在一些实施方案中，该个体已在临床上受益于多抗原刺激细胞疗法(multiple-antigensstimulatingcellulartherapy，masct，包括“改良masct”和其他变体masct方法)，该masct包括向该个体施用有效量的活化t细胞，此类活化t细胞是通过将t细胞群与载有该多种肿瘤抗原的dc群共培养而制备。在一些实施方案中，在接受该masct后，该个体具有部分反应(pr)、完全反应(cr)、或疾病稳定(sd)达至少约6个月(例如，至少一年、2年、或更多年)。进一步提供的是药物组合物、试剂盒、和制品，其用于上述方法中任一者。由随后的具体实施方式和随附权利要求书，本发明的这些和其他方面和优点将变得显而易见。应了解的是，本文所述的各种实施方案中的一项、一些、或所有性质可经组合以形成本发明的其他实施方案。附图说明图1显示经masct治疗的转移性子宫颈癌患者的临床数据。下图显示患者于2013年12月(进行任何masct治疗之前)、2016年11月(进行masct而达到疾病稳定状态之后)、和2017年11月进行的ect结果。箭头和圆圈指出右骶髂关节骨上的转移部位，其显示响应于masct治疗而转移性肿瘤减少且没有附加转移。图2a至图2b显示如elispot所判定，在经过定制masct治疗之后，患者的pbmc对子宫颈癌抗原肽池(肽池)、和该池中各肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。w/o＝未经过任何抗原肽刺激下的反应。env是指用不相关肽的实验。虚线指示无升高免疫反应的临限，如由每200,000个细胞的斑点数(反映ifnγ分泌水平)测量。图2b显示患者的pbmc对hpv18-e7、rgs-5、和cea肽的一致强烈免疫反应。图3显示如实施例2所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法。图4显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图5显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图6显示如实施例3所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法(“方法2”)。图7显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图8a至图8b显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图9显示如实施例3所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的图6示例性方法的优化(“方法2m”)。图10显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图11a至图11b显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图11c显示在各种共培养样本中的ifnγ+tnfα+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图12显示如实施例3所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的图9示例性方法的优化。图13显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图14a至图14c显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图15显示如实施例4所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法。图16显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图17a至图17b显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图17c显示在各种共培养样本中的ifnγ+tnfα+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图18显示自如实施例5所述的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法。图19显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图20a显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图20b显示在各种共培养样本中的ifnγ+tnfα+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图21a至图21b显示自通过如实施例5所述的方法2或方法2m制备的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法。图22显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图23a显示在各种共培养样本中的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图23b显示在各种共培养样本中的ifnγ+tnfα+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图24显示如实施例3所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法。图25a显示在肿瘤抗原特异性t细胞的制备中各时间点的细胞增殖。图25b显示在富集步骤之前和之后的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞的百分比。图26a至图26b显示在各种共培养样本中的肿瘤抗原特异性t细胞群的细胞增殖和百分比。图27显示如elispot所判定，在经过masct治疗之后，患者的pbmc对肿瘤抗原肽池、和该池中各肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。百分比指示减少的肽浓度。例如，1/20基本肽指示在20倍稀释下的一般肿瘤抗原肽池。图28显示用于使用来自患者smz的pbmc制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性两轮式方法的第1轮规程。图29a显示在第1轮中各时间点的细胞增殖。图29b显示在富集步骤之后的ifnγ+cd3+肿瘤抗原特异性t细胞群的百分比。图30a至图30e显示在第1轮的各种共培养样本中的肿瘤抗原特异性t细胞群的百分比。图30f显示在第1轮结束时所获得的ifnγ+cd4+肿瘤抗原特异性t细胞中的效应t细胞群。图31显示用于使用来自患者smz的pbmc制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性两轮式方法的第2轮规程。图32a显示在第2轮中各时间点的t细胞和肿瘤特异性t细胞数目。图32b至图32c显示在第2轮的各种共培养样本中的肿瘤抗原特异性t细胞群的百分比。图33显示在第1轮和第2轮中各时间点的t细胞和肿瘤抗原特异性t细胞数目。具体实施方式本专利申请提供制备用于癌症治疗的肿瘤抗原特异性t细胞的方法。本文所述方法包括富集来自t细胞与抗原负载树突细胞(“dc”)的共培养物的活化t细胞，随后将此类经富集的活化t细胞与抗原负载dc共培养，从而提供肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，将(例如，来自冷冻储备液的)肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(apc)进一步共培养，以提供进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。本文所述方法能够制备在共培养物中呈高浓度且具高产率的肿瘤抗原特异性t细胞，以满足在多抗原特异性细胞疗法方法(“masct”)或其变型中有效肿瘤抗原特异性t细胞的持续来源的需求。因此，本专利申请的一个方面提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞群的方法，该方法包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，该方法进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第三apc(例如，dc或pbmc)群共培养，以提供第二肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤一或多次。还提供使用本文所述方法制备的肿瘤抗原特异性t细胞、治疗癌症的方法、组合物、试剂盒、和制品。i.定义除非另有定义如下，否则术语在本文中是如所属
技术领域：
：中所通常使用般使用。如本文所用，“多种肿瘤抗原肽(apluralityoftumorantigenpeptides)”、“多种肿瘤抗原肽(multipletumorantigenpeptides)”、“肿瘤抗原肽的池(apooloftumorantigenpeptides)”、和“肿瘤抗原肽池(atumorantigenpeptidespool)”可互换使用，以指两种或更多种肿瘤抗原肽的组合。如本文所用，“载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigenpresentingcellsloadedwithapluralityoftumorantigenpeptides)”和“载有一种或多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(antigenpresentingcellsloadedwithoneormoretumorantigenpeptides)”还称为“抗原负载抗原递呈细胞(antigen-loadedantigenpresentingcells)”。载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(“apc”)是在多种肿瘤抗原肽中具有增强的一种或多种肿瘤抗原肽或其片段呈现的apc。在一些实施方案中，抗原负载apc是抗原负载dc。在一些实施方案中，抗原负载apc是抗原负载pbmc。如本文所用，“活化t细胞(activatedtcell)”是指具有识别至少一种肿瘤抗原肽的t细胞受体的单克隆(例如，编码相同tcr)或多克隆(例如，具有编码不同tcr的殖株)t细胞群。活化t细胞可含有一种或多种t细胞亚型，其包括但不限于细胞毒性t细胞、辅助t细胞、天然杀伤性t细胞、γδt细胞、调节性t细胞、和记忆t细胞。“肿瘤抗原特异性t细胞(tumorantigen-specifictcell)”和“肿瘤特异性t细胞(tumorspecifictcell)”在本文中可互换使用。如本文所用，“免疫检查点抑制剂(immunecheckpointinhibitor)”是指抑制或阻断在免疫细胞(诸如t细胞)或肿瘤细胞上的抑制性免疫检查点分子的药剂(包括抗体)。“免疫检查点分子(immunecheckpointmolecule)”包括提升对肿瘤细胞的免疫信号的分子(即，“共刺激分子(co-stimulatorymolecule)”)、或降低对肿瘤细胞的免疫信号的分子(即，“抑制性免疫检查点分子(inhibitoryimmunecheckpointmolecule)”)。如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方式。针对本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于下列中的一者或多者：减少又一种疾病所导致的症状、消减疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的发生或复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的(部分或完全)缓解、降低一种或多种治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加生活质量、和/或延长存活。“治疗(treatment)”还涵盖的是癌症病理结果的减少。本发明的方法设想到这些治疗方面中的任一者或多者。如本文所用，“延迟(delaying)”癌症的发展意指推迟、阻碍、减缓、推迟、稳定、和/或延后疾病的发展。此延迟可为不同时间长度，其取决于疾病史和/或正接受治疗的个体。如对于所属领域技术人员而言为明显的，足够或显著的延迟实际上可涵盖预防，因为个体不会发展疾病。“延迟”癌症发展的方法当与未使用该方法比较时，是降低给定时段中疾病发展的可能性和/或降低给定时段中疾病程度的方法。此模拟较一般是基于临床研究、使用统计上显著的个体数。可使用标准方法检测癌症发展，标准方法包括但不限于计算机断层扫描(cat扫描)、磁共振成像(mri)、腹部超音波、凝血测试、动脉摄影、或活检。发展也可指最初可能为不可检测的癌症进展，且包括发生、复发和发作。术语“个体(individual)”、“受试者(subject)”、和“患者(patient)”在本文中可互换使用，以描述哺乳动物，包括人类。个体包括但不限于人类、牛、马、猫、犬、啮齿动物、或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，个体罹患诸如癌症的疾病。在一些实施方案中，个体需要治疗。如所属
技术领域：
：中所了解，“有效量(effectiveamount)”是指足以产生期望的治疗成果(例如，降低一种或多种癌症症状的严重性或减少其持续时间、稳定一种或多种癌症症状的严重性、或消除一种或多种癌症症状)的组合物(例如抗原负载dc、或肿瘤抗原特异性t细胞)的量。就治疗用途而言，有益或期望的结果包括例如减少一种或多种疾病导致的症状(生物化学、组织学、和/或行为方面)，该症状包括在疾病发展期间呈现的并发症和中间病理表型；增加罹患疾病者的生活质量；降低其他治疗疾病所需药物的剂量；增强另一种药物的效果；延迟疾病的进展；和/或延长患者的存活。“辅助性治疗(adjuvantsetting)”是指其中个体已具有癌症病史且通常(但不一定)已对疗法有反应的临床环境(clinicalsetting)，疗法包括但不限于手术(例如，手术切除)、放射疗法、和化疗。然而，由于其癌症病史，将这些个体视为处于疾病发展的风险。“辅助性治疗(adjuvantsetting)”中的治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如，在辅助性治疗中的个体视为“高风险”或“低风险”时)是取决于数个因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。“新辅助性治疗(neoadjuvantsetting)”是指其中方法是在主要/决定性疗法之前进行的临床环境。如本文所用，“组合疗法(combinationtherapy)”意指第一药剂是与另一种药剂配合施用。“与……配合(inconjunctionwith)”是指一种治疗型态在除了另一种治疗型态之外下施用，诸如本文所述的肿瘤抗原特异性t细胞在除了另一种药剂(诸如免疫检查点抑制剂)之外下施用至相同个体。因此，“与……配合”是指一种治疗型态在另一种治疗型态递送至个体之前、期间、或之后施用。将此类组合视为属于单一治疗方案(regimen或regime)的部分。如本文所用，术语“同时施用(simultaneousadministration)”意指在组合疗法中的第一疗法和第二疗法是以不多于约15分钟(诸如不多于约10、5、或1分钟中的任一者)的时间间隔施用。当第一疗法和第二疗法同时施用时，第一疗法和第二疗法可含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或不同组合物(例如，第一疗法在一种组合物中，而第二疗法是含在另一种组合物中)中。如本文所用，术语“依序施用(sequentialadministration)”意指在组合疗法中的第一疗法和第二疗法是以多于约15分钟(诸如多于约20、30、40、50、60、或更多分钟中的任一者)的时间间隔施用。可先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法可含在不同组合物中，此类不同组合物可含在相同或不同包装或试剂盒中。如本文所用，术语“并行施用(concurrentadministration)”意指组合疗法中的第一疗法的施用与第二疗法的施用彼此重迭。如本文所用，以“医药上可接受(pharmaceuticallyacceptable)”或“药理上相容(pharmacologicallycompatible)”意指不是在生物或其他方面上非期望的材料，例如，可将该材料并入施用至个体的药物组合物中，而不会造成任何显著非期望的生物作用，或以有害方式与含有其的组合物中的任何其他组分相互作用。医药上可接受的载剂或赋形剂优选地已符合所需毒物测试标准和制造测试标准，和/或包括于美国食品药物管理局(u.s.foodanddrugadministration)所制作的非活性成分指南(inactiveingredientguide)。以下定义可用于评估基于目标病变的反应：“完全反应(completeresponse)”或“cr”是指所有目标病变消失；“部分反应(partialresponse)”或“pr”是指目标病变的最长直径总和(sld)减少至少30％，其是以基线sld作为参考；“疾病稳定(stabledisease)”或“sd”是指目标病变的缩小不足以符合pr的条件，其增加还不足以符合pd的条件，其是以自治疗开始以来的最低点(nadir)sld作为参考；且“疾病进展(progressivedisease)”或“pd”是指目标病变的sld增加至少20％(其是以自治疗开始以来所记录的最低点sld作为参考)，或是存在一个或多个新病变。以下反应评估的定义可用于评估非目标病变：“完全反应(completeresponse)”或“cr”是指所有非目标病变消失；“疾病稳定(stabledisease)”或“sd”是指不符合cr或pd的条件的一个或多个非目标病变持续存在；且“疾病进展(progressivedisease)”或“pd”是指现有(多个)非目标病变的“明确进展(unequivocalprogression)”，或者将一个或多个新病变的出现视为疾病进展(如果完全基于(多个)非目标病变的进展针对一时间点来评估个体的pd，则需要符合附加的标准)。如本文所用，术语“细胞(cell)”、“细胞系(cellline)”、和“细胞培养物(cellculture)”可互换使用，且所有此类名称皆包括子代。据了解，由于人为或意外的突变，所有子代的dna含量可能不完全相同。具有与原始细胞相同的功能或生物活性的变体子代包括在内。术语“肽(peptide)”是指不多于约100个氨基酸的氨基酸聚合物(包括蛋白质的片段)，其可为直链或支链，包括经修饰氨基酸，和/或以非氨基酸间隔。该术语还涵盖经过自然修饰或介入修饰的氨基酸聚合物，其包括例如双硫键形成、醣基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵或修饰。还包括在此术语内的是(例如)含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的肽、以及所属
技术领域：
：中已知的其他修饰。本文所述的肽可天然存在，即，获自或衍生自天然来源(例如血液)，或经过合成(例如，经化学合成、或通过重组dna技术合成)。本文中所使用的术语“抗体(antibody)”是以最广泛的意义使用，且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要其展现期望的生物活性。“抗体片段(antibodyfragment)”包括完整抗体的部分，优选地包括其抗原结合区。抗体片段的示例包括fab、fab'、f(ab')2、和fv片段；双价抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；以及自抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，术语“特异性结合至(specificallybindsto)”、“识别(recognizes)”、“特异性识别(specificallyrecognizes)”、“靶向(targets)”、或“对……具特异性(specificfor)”是指可测量且可再现的相互作用，诸如目标与抗体之间、或受体与配体之间、或受体与表位/mhc复合物之间的结合，其判定在分子(包括生物分子)的异质群体存在下目标的存在。例如，结合至或特异性结合至目标(其可为表位)的抗体是以较大亲合性、结合性、更加容易地、和/或以更长持续时间结合此目标(相较于其结合至其他目标)的抗体。在一个实施方案中，如所测量(例如通过放射免疫测定法(ria))，抗体与不相关目标的结合程度小于抗体与目标的结合的约10％。在某些实施方案中，特异性结合至抗原肽(或表位)的抗体具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、或≤0.1nm的解离常数(kd)。在某些实施方案中，抗体特异性结合至来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在另一实施方案中，特异性结合可包括但不需要排他性结合。据了解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“由……所组成(consisting)”和/或“基本上由……所组成(consistingessentiallyof)”方面和实施方案。本文中所提及的“约(about)”一值或参数包括(并描述)关于该值或参数本身的变动。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。本文所使用的术语“约x至y(aboutx-y)”具有与“约x至约y(aboutxtoabouty)”相同的意义。如本文所用，提及“不/非(not)”为一值或参数通常意指并描述一值或参数“以外(otherthan)”。例如，该方法不用于治疗x类型的癌症意指该方法是用于治疗x以外的类型的癌症。如本文及随附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”和“该(the)”皆包括复数指称，除非上下文另有明确说明。ii.制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法本专利申请提供制备肿瘤抗原特异性t细胞群的方法，其包括将经富集的活化t细胞群或储备肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(apc)(在本文中称为“抗原负载apc”)群共培养。在一些实施方案中，此类apc是dc。在一些实施方案中，此类apc是pbmc。在一些实施方案中，t细胞和apc是获自先前已接受masct的个体。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括将经富集的活化t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的dc群共培养，其中通过使第一共培养物经受富集过程来制备该经富集的活化t细胞群，且其中该第一共培养物包含t细胞群和载有包括该一种或多种肿瘤抗原肽的多种肿瘤抗原肽的第一dc群。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始共培养基中将该抗原负载dc群与该经富集的活化t细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；以及将抗cd3抗体(例如，okt-3)添加至该共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)使第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群，其中该第一共培养物包含载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群和t细胞群；以及b)将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括将该第二抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第二共培养物，其是在包括免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)中共培养；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)使第一dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群；b)第一共培养步骤，其包括将载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；c)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；d)使第二树突细胞群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群；以及e)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二dc群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)使第一dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的第一dc群；b)在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂；c)第一共培养步骤，其包括：在第一共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群与该t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)、免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；d)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子；e)使第二dc群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得第二抗原负载dc群；f)在dc成熟培养基中培养该第二抗原负载dc群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂；以及g)第二共培养步骤，其包括：在第二初始共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有该多种肿瘤抗原肽的该第二dc群共培养，以获得第二共培养物，该第二初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)添加至该第二共培养物，以提供肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，该dc成熟培养基包含infγ、mpla、和pge2。在一些实施方案中，通过诱导来自pbmc的单核细胞群分化来获得第一dc群和/或第二dc群。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：将肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc、dc、或细胞系apc)群共培养。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞群是获自肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用上述方法中任一者制备。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞是获自已在临床上受益于masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞群与该抗原负载apc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、1:2、或1:4)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性t细胞群与该抗原负载apc群共培养约5至9(例如，约7)天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞群与该抗原负载apc群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、和il-15)和抗cd3抗体(例如，okt3)。在一些实施方案中，重复共培养，例如一次或两次。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞群是获自肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：将经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc、dc、或细胞系apc)群共培养，其中此类冷冻肿瘤抗原特异性t细胞是通过冷冻肿瘤抗原特异性t细胞制备，此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过上述方法中任一者制备。在一些实施方案中，冷冻肿瘤抗原特异性t细胞是通过下列制备：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群；以及d)冷冻该肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得第一肿瘤抗原特异性t细胞群；d)第三共培养步骤，其包括将来自该第一肿瘤抗原特异性t细胞群的肿瘤抗原特异性t细胞亚群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第三apc(例如，dc或pbmc)群共培养，从而提供此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞亚群与该第三抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1、1:2、或1:4)。在一些实施方案中，将该肿瘤抗原特异性t细胞亚群与该第三抗原负载dc群共培养约5至9(例如，约7)天。在一些实施方案中，该肿瘤抗原特异性t细胞亚群与该第三抗原负载dc群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、和il-15)和抗cd3抗体(例如，okt3)。在一些实施方案中，重复该第三共培养步骤，例如一次、两次、或三次。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞亚群是获自第一肿瘤抗原特异性t细胞群的冷冻储备液。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，抗原负载dc和t细胞是衍生自相同个体，例如来自先前已接受masct的个体的pbmc。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的示例性方法示出于图3、图6、图9、图12、图15、图18、和图21a至图21b中，并描述于实施例2至6中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：(a)使衍生自来自个体的pbmc群的dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得第一抗原负载dc群；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将t细胞群(例如，存在于pbmc中)与该第一抗原负载dc群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；以及在该第一共培养开始后不多于约7天(例如，约5天)，将抗cd3抗体添加至该第一共培养物，以获得第一共培养物；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，以获得经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有该多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，从而提供此类肿瘤抗原特异性t细胞，该共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)、和抗cd3抗体。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该t细胞群与该抗原负载dc群共培养约13至14天。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约2:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约9至13天。示例性方法显示于图3中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：(a)使衍生自来自个体的pbmc群的dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将t细胞群(例如，存在于pbmc中)与第一抗原负载dc群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，以获得经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在共培养基中将该经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群共培养，从而提供此类肿瘤抗原特异性t细胞，该共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)、和抗cd3抗体。在一些实施方案中，在dc成熟培养基中培养此类抗原负载dc，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，该dc成熟培养基包含infγ、mpla、和pge2。在一些实施方案中，将此类抗原负载dc在该dc成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率为约15:1。在一些实施方案中，将该t细胞群与该抗原负载dc群共培养约3至4天。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约2:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约13至23天。示例性方法显示于图6中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：(a)使衍生自来自个体的pbmc群的dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将t细胞群(例如，存在于pbmc中)与第一抗原负载树突细胞群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，以获得经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及在该第二共培养步骤开始后约1至3天(例如，约2天)，将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，从而提供此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，在dc成熟培养基中培养此类抗原负载dc，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，该dc成熟培养基包含infγ、mpla、和pge2。在一些实施方案中，将此类抗原负载dc在该dc成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该t细胞群与该抗原负载dc群共培养约2至3天。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约15至20天(例如，约16天)。示例性方法显示于图9中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：(a)使衍生自来自个体的pbmc群的dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc；(b)第一共培养步骤，其包括：在初始第一共培养基中将t细胞群(例如，存在于pbmc中)与第一抗原负载dc群共培养，该初始第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；(c)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，以获得经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)；(d)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群共培养，以获得第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及在该第二共培养开始后约1天至约3天(例如，约2天)，将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，从而提供此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，在dc成熟培养基中培养此类抗原负载dc，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，该dc成熟培养基包含infγ、mpla、和pge2。在一些实施方案中，将此类抗原负载dc在该dc成熟培养基中培养约8至约12天。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率为约20:1。在一些实施方案中，将该t细胞群与该抗原负载dc群共培养约2至3天。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约15至20天(例如，约16天)。示例性方法显示于图9和图12中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：(a)使pbmc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得经刺激pbmc群；(b)使用配体自该经刺激pbmc群分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)，以获得经富集的活化t细胞群；以及(c)共培养步骤，其包括：在初始共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的dc群共培养，以获得第一共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；以及在第一共培养开始后约1天至约3天(例如，约1天或2天)，将抗cd3抗体(例如，okt3)添加至该第一共培养物，从而提供此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，pbmc是获自先前已接受masct的个体。在一些实施方案中，pbmc是获自已在临床上受益于masct的个体。在一些实施方案中，pbmc是来自冷冻储备液。在一些实施方案中，pbmc是自个体新鲜获得。在一些实施方案中，通过使pbmc群与多种肿瘤抗原肽接触，制备抗原负载dc。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该抗原负载dc群之间的比率为约1:1。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该抗原负载dc群共培养约7至约21天。示例性方法显示于图15中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：在共培养基中将肿瘤抗原特异性t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc或dc)群共培养，从而提供第二肿瘤抗原特异性t细胞群，该共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1)、和抗cd3抗体。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞群是获自肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液。在一些实施方案中，抗原负载apc群与肿瘤抗原特异性t细胞群之间的比率为至少约1:20。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载apc群共培养约5至10天(例如，约8天)。示例性方法显示于图18中。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：(a)在共培养基中将肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的第一apc(例如，pbmc、dc、或细胞系apc)群共培养约5至9天(例如，约7天)，以获得第一肿瘤抗原特异性t细胞群，该共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和抗cd3抗体；以及(b)将该第一肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的第二apc群共培养约5至9天(例如，约7天)，从而提供第二肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，重复刺激步骤一次。在一些实施方案中，该方法进一步包括：将该第二肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的第三apc群共培养约5至9天(例如，约7天)，从而提供第三肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，apc是lcl细胞，其具有或不具有喂养细胞(feedercell)。在一些实施方案中，apc是dc。在一些实施方案中，apc载有单一肿瘤抗原肽(包括其片段)，该单一肿瘤抗原肽引发肿瘤抗原特异性t细胞的特异性免疫反应。在一些实施方案中，apc载有多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，该共培养基包含il-2和okt3。在一些实施方案中，该共培养基包含il-2、il-7、il-15、和okt3。在一些实施方案中，抗原负载apc与第一、第二、或第三肿瘤抗原特异性t细胞群之间的比率为约1:1至约1:10(例如，约1:4)。示例性方法显示于图21a至图21b中。所意欲的是，可将本文所述的用于制备抗原负载dc、第一、第二、和第三共培养步骤、和富集步骤等的任何步骤和参数彼此组合，犹如每一个组合经个别描述。肿瘤抗原特异性t细胞本专利申请进一步提供的是一种分离细胞群，其是通过本文所述方法的任何实施方案制备。还提供的是一种冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群，其是通过本文所述方法的任何实施方案制备。在一些实施方案中，提供一种共培养物，其包括经富集的活化t细胞群、和载有一种或多种肿瘤抗原肽的dc群。在一些实施方案中，提供一种共培养物，其包括经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群、和载有一种或多种肿瘤抗原肽的dc群。在一些实施方案中，t细胞群和抗原负载dc群是衍生自相同个体，诸如正接受治疗的个体。在一些实施方案中，个体先前已接受masct。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。在一些实施方案中，提供一种分离细胞群，其是通过包括下列的方法制备：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养。分离细胞群包括高百分比的肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，分离细胞群包括至少约3％、5％、6％、8％、10％、15％、20％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高水平中任一者的肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，分离群中约3％至10％、5％至15％、10％至15％、10％至20％、20％至50％、10％至50％、10％至70％、50％至90％、或20％至60％中任一者的细胞是肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，分离细胞群的任何实施方案中的肿瘤抗原特异性t细胞能够在体内或体外引发对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞能够在人类个体中增加对多于一种肿瘤抗原肽的细胞毒性t细胞活性。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞的特征在于经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后，促炎性信号分子的高表达或分泌水平。在一些实施方案中，通过以下判定表达或分泌水平：将肿瘤抗原特异性t细胞经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后的分子(诸如促炎性信号分子)的表达或分泌水平与经不相关肽刺激后的表达或分泌水平进行比较。在一些实施方案中，分子的对照表达或分泌水平是在相同测定条件下测量的对照t细胞群中分子的表达或分泌水平。在一些实施方案中，对照t细胞群是经一种或多种不相关肽(诸如未对应于t细胞受体抗原的肽、或随机肽)诱导的t细胞群。在一些实施方案中，分子的对照表达或分泌水平是多个对照t细胞群中分子的平均或中位数表达或分泌水平。在一些实施方案中，在肿瘤抗原特异性t细胞中分子的高表达或分泌水平是对照表达或分泌水平的至少约1.5、2、2.5、3、4、5、10、20、50、100、1000、或更多倍中任一者。在一些实施方案中，经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后，肿瘤抗原特异性t细胞表达多种促炎性分子，诸如ifnγ、tnfα、颗粒酶b、穿孔素、或其任何组合。在一些实施方案中，经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后，至少约3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原特异性t细胞分泌inf-γ。在一些实施方案中，经一种或多种肿瘤抗原肽刺激后，至少约3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原特异性t细胞分泌tnf-α。当施用至个体时，本文所述的分离细胞群可用来产生该个体中的特异性免疫记忆。在一些实施方案中，在施用分离细胞群后约2周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、12个月、或更长中任一者之后，个体具有记忆t细胞，此类记忆t细胞可引发对多种肿瘤抗原肽的特异性t细胞反应。本文所述的分离细胞群也可用于在体内改变免疫抑制性信号。在一些实施方案中，当施用至个体时，分离细胞群降低t细胞(诸如细胞毒性t细胞或辅助t细胞)上的免疫抑制性分子(诸如pd-1)表达频率。在一些实施方案中，分离细胞群降低个体中癌细胞的免疫耐受性或免疫逃脱。因此，提供一种降低个体的t细胞中免疫抑制性分子(诸如pd-1)的表达频率的方法，其包括向该个体施用有效量的本文所述的分离细胞群的任何实施方案。本文还提供的是一种免疫治疗组合物，其包括分离细胞群的任何实施方案，该分离细胞群包括肿瘤抗原特异性t细胞；以及该分离细胞群的任何实施方案于药剂制造中的用途，该药剂是用于治疗个体中癌症。本节所述的分离细胞群和共培养物可用于治疗癌症，诸如实体肿瘤。包括分离细胞群或共培养物的免疫治疗组合物有用于治疗癌症、预防肿瘤进展或转移、或降低癌症免疫逃脱，且提供于本文中。分离细胞群或共培养物也可用于制造用于治疗癌症、预防肿瘤进展或转移、或降低癌症免疫逃脱的药剂。共培养本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法和masct方法包括一个或多个(诸如1、2、3、或更多个)共培养步骤。在一些实施方案中，该方法包括第一共培养步骤，该第一共培养步骤包括将t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的dc群共培养。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中，将t细胞群与第一抗原负载dc群共培养不多于约7天，诸如约1、2、3、4、5、6、或7天中任一者。在一些实施方案中，将t细胞群与第一抗原负载dc群共培养约1至3天，诸如约2至3天。在一些实施方案中，第一共培养步骤包括在第一共培养基中将第一抗原负载dc群与该t细胞群共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第一共培养基包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，第一共培养基不包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，第一共培养步骤包括：在第一初始共培养基中将第一抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第一共培养物，该第一初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；以及将抗cd3抗体添加至该第一共培养物。在一些实施方案中，该方法包括第二共培养步骤，该第二共培养步骤包括将经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的dc群共培养。在一些实施方案中，在第二共培养步骤中，将经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群共培养总共至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、或30天中任一者。在一些实施方案中，将经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群共培养约12天至约25天，诸如约12至15、15至18、18至21、15至20、20至25、15、18、19、20、21、或22天中任一者。在一些实施方案中，将经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群在抗cd3抗体存在下共培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、或更多天中任一者。在一些实施方案中，将经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群在抗cd3抗体存在下共培养约8至18、10至20、1至25、或12至25天中任一者。在一些实施方案中，经富集的活化t细胞群与第二抗原负载dc群最初是在不具有抗cd3抗体下共培养约1至5天，诸如约1、2、或3天。在一些实施方案中，第二共培养步骤包括在第二共培养基中将第二抗原负载dc群与该经富集的活化t细胞群共培养，该第二共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第二共培养基包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，第二共培养基不包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，第二共培养步骤包括：在第二初始共培养基中将第二抗原负载dc群与该经富集的活化t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该第二初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；以及将抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法包括：(1)第一共培养步骤，其包括将t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群共培养；以及(2)第二共培养步骤，其包括将经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养。在一些实施方案中，该方法包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将肿瘤抗原特异性t细胞群(诸如经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群)与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群共培养。在一些实施方案中，重复第三共培养步骤一或多次(诸如1、2、3、4、5、6、或更多次)，以获得进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。各进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群可施用至需要治疗的个体。在一些实施方案中，重复第三共培养步骤包括：将自第三共培养步骤获得的肿瘤抗原特异性t细胞的一部分与第二抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群共培养。在一些实施方案中，重复第三共培养步骤包括：以每隔约5至9天(例如，约7天)的间隔，向第三共培养物添加新鲜的抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群。在一些实施方案中，在第三共培养步骤中，将肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群共培养至少约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或14天中任一者。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群共培养约5天至约15天，诸如约5至9、7至10、10至12、12至15、7、8、9、10、11、12、13、或15天中任一者。在一些实施方案中，第三共培养步骤包括在第三共培养基中将抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群与肿瘤抗原特异性t细胞群共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第三共培养基不包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，第三共培养基包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，第三共培养步骤包括：在第三初始共培养基中将抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群与肿瘤抗原特异性t细胞群共培养，以提供第三共培养物，该第三初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；以及将抗cd3抗体添加至该第三共培养物。用于各培养步骤的共培养基或初始共培养基可相同或不同。除非另有指示，否则如“共培养”小节中所论述的“共培养基”包括第一、第二、和第三共培养基；如本小节中所论述的“初始共培养基”包括第一、第二、和第三初始共培养基。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、或更多种)细胞因子。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含多种细胞因子(在本文中还称为“细胞因子混合物”)。示例性细胞因子包括但不限于il-2、il-7、il-15、il-21等。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含il-2。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含il-2、il-7、il-15、和il-21。在一些实施方案中，il-2是以至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、6000、或更高iu/ml中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，il-2是以不大于约1000、500、200、100、50、20、或更低iu/ml中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，第一共培养基以不大于约200iu/ml(诸如约150、100、或50iu/ml)的浓度包含il-2。在一些实施方案中，第二共培养基以至少约2000iu/ml(诸如约3000、5000、或6000iu/ml)的浓度包含il-2。在一些实施方案中，il-7是以至少约1、2、5、10、20、50、或100ng/ml中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，il-15是以至少约1、2、5、10、20、50、或100ng/ml中任一者的浓度存在于共培养基(包括初始共培养基)中。细胞因子可促进t细胞的活化、成熟、和/或增殖，以为t细胞稍后分化为记忆t细胞作准备，和/或抑制共培养物中treg的百分比。在一些实施方案中，共培养基(包括初始共培养基)包含一种或多种(诸如1、2、3、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂。可使用任何已知的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制性免疫检查点分子的天然或经工程改造的配体，其包括例如ctla-4的配体(例如，b7.1、b7.2)、tim-3的配体(例如，半乳糖凝集素-9)、a2a受体的配体(例如，腺苷、瑞加德松(regadenoson))、lag-3的配体(例如，mhci类或mhcii类分子)、btla的配体(例如，hvem、b7-h4)、kir的配体(例如，mhci类或mhcii类分子)、pd-1的配体(例如，pd-l1、pd-l2)、ido的配体(例如，nktr-218、因多莫得(indoximod)、nlg919)、和cd47的配体(例如，sirpα受体)。免疫检查点抑制剂可属于任何合适的分子型态，包括但不限于小分子、核酸(诸如dna、rnai、或适体)、肽、或蛋白质(诸如抗体)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是靶向抑制性免疫检查点蛋白的抗体(诸如拮抗剂抗体)，其是选自：抗ctla-4(例如，伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、kahr-102)、抗tim-3(例如，f38-2e2、enum005)、抗lag-3(例如，bms-986016、imp701、imp321、c9b7w)、抗kir(例如，利利单抗(lirilumab)和iph2101)、抗pd-1(例如，尼沃鲁单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、派姆单抗(pembrolizuma)、bms-936559、阿替珠单抗(atezolizumab)、派姆单抗、mk-3475、amp-224、amp-514、sti-a1110、tsr-042、shr1210)、抗pd-l1(例如，ky-1003(ep20120194977)、mcla-145、rg7446、bms-936559、medi-4736、msb0010718c、aur-012、sti-a1010、pct/us2001/020964、mpdl3280a、amp-224、聚乙二醇化达匹珠单抗(dapirolizumabpegol)(cdp-7657)、medi-4920)、抗cd73(例如，ar-42(osu-hdac42,hdac-42,ar42,ar42,osu-hdac42,osu-hdac-42,nscd736012,hdac-42,hdac42,hdac42,nscd736012,nsc-d736012)、medi-9447)、抗b7-h3(例如，mga271、ds-5573a、8h9)、抗cd47(例如，cc-90002、tti-621、vlst-007)、抗btla、抗vista、抗a2ar、抗b7-1、抗b7-h4、抗cd52(诸如阿仑单抗(alemtuzumab))、抗il-10、抗il-35、和抗tgf-β(诸如夫苏木单抗(fresolumimab))。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体是选自下列的抗原结合片段：fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、bite、纳米抗体(nanobody)、和全长抗体的其他抗原结合子序列或其经工程改造的组合。在一些实施方案中，抗体是人类抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。示例性抗pd-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、bms-936559、和阿替珠单抗、派姆单抗、mk-3475、amp-224、amp-514、sti-a1110、tsr-042、和shr-1210。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是shr-1210。在一些实施方案中，初始共培养基包含il-2和抗pd-1抗体(例如，shr-1210)。在一些实施方案中，初始共培养基包含il-2、il-7、il-15、和il-21、和抗pd-1抗体(例如，shr-1210)。在共培养基(包括初始共培养基)中的免疫检查点抑制剂(例如抗pd-1抗体)的合适浓度包括但不限于至少约1、2、5、10、15、20、25、或更大μg/ml中任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)是以约1μg/ml至约10μg/ml、约10μg/ml至约20μg/ml、约1μg/ml至约25μg/ml、或约5μg/ml至约20μg/ml中任一者存在于共培养基(包括初始共培养基)中。抗cd3抗体可在共培养开始时存在于共培养物中，或者在抗原负载dc与t细胞、经富集的活化t细胞、或肿瘤抗原特异性t细胞群的共培养开始之后被添加至共培养物。在一些实施方案中，抗cd3抗体包含于共培养基(包括初始共培养基)中。在一些实施方案中，初始共培养基不包含抗cd3抗体。在一些实施方案中，在第二共培养开始后不多于约5、4、3、2、或1天中任一者，将抗cd3抗体添加至第二共培养物，该第二共培养物包含经富集的活化t细胞群和第二抗原负载dc群。在一些实施方案中，在第二共培养开始后约1、2、或3天，将抗cd3抗体添加至第二共培养物，该第二共培养物包含经富集的活化t细胞群和第二抗原负载dc群。可使用任何合适的抗cd3抗体，包括但不限于okt3。在细胞数目方面，t细胞(例如，t细胞、经富集的活化t细胞群、或肿瘤抗原特异性t细胞)和抗原负载apc(诸如pbmc或dc)可以适当比率存在于共培养物中。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中的t细胞群与第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、或5:1中任一者。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中的t细胞群与第一抗原负载dc群之间的比率为至少约5:1、8:1、10:1、15:1、20:1、25:1、或更大中任一者。在一些实施方案中，在第一共培养步骤中的t细胞群与第一抗原负载dc群之间的比率为约5:1至约10:1、约5:1至约20:1、约10:1至约20:1、约20:1至约30:1、或约5:1至约30:1中任一者。在一些实施方案中，经富集的t细胞群与第二抗原负载dc群之间的比率为至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1中任一者。在一些实施方案中，经富集的t细胞群与第二抗原负载dc群之间的比率不大于约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、或1:1中任一者。在一些实施方案中，经富集的t细胞群与第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1、约1:1至约10:1、约1:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约10:1至约20:1、约1:1至约1:3、约1:1至约2:1、或约2:1至约5:1中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群之间的比率为至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群之间的比率不大于约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、或1:1中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载apc(例如，pbmc或dc，诸如固定pbmc)群之间的比率为约1:1至约20:1、约1:1至约10:1、约1:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约10:1至约20:1、约1:3至约3:1、约1:1至约3:1、约1:1至约2:1、或约2:1至约5:1中任一者。在一些实施方案中，t细胞和apc(例如，pbmc或dc)是衍生自相同个体，诸如患有癌症的个体(例如，低至中等级癌症)。在一些实施方案中，t细胞、apc(例如，pbmc或dc)、或两者是衍生自自体来源，即衍生自接受肿瘤抗原特异性t细胞、抗原负载dc、或两者的个体。在一些实施方案中，t细胞、apc(例如，pbmc、dc、或细胞系apc)、或两者并非衍生自自体来源。在一些实施方案中，t细胞和/或apc(例如，pbmc或dc)是获自先前已接受免疫疗法的个体。在一些实施方案中，个体对免疫疗法有免疫反应。对免疫疗法“有免疫反应(immunologicallyresponsive)”意指个体响应于免疫疗法而对一种或多种肿瘤抗原已发展出特异性免疫反应。在一些实施方案中，t细胞和/或apc(例如，pbmc或dc)是获自已在临床上受益于免疫疗法的个体。“临床上受益(clinicallybenefitted)”于疗法的个体已展示对该疗法的临床反应(如医师所评估)。示例性临床反应包括但不限于完全反应(“cr”)、部分反应(“pr”)、和疾病稳定(“sd”)。免疫疗法包括但不限于免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法(例如，过继性t细胞疗法、cik、til、car-t、和tcr-t疗法)、癌症疫苗、溶瘤病毒、和其组合。在一些实施方案中，t细胞和/或apc(例如，pbmc或dc)是获自先前已接受masct的个体。在一些实施方案中，该个体能够在masct中发展出对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用所属
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：中已知的测定法(诸如elispot测定)来判定对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。在一些实施方案中，个体已在临床上受益于masct。用于本文所述方法的任何实施方案中的t细胞群可衍生自各种来源。方便的t细胞来源是来自人类周边血液的pbmc。t细胞群可自pbmc分离，或者替代地，富含t细胞的pbmc群(诸如通过添加t细胞特异性抗体和细胞因子)可用于共培养物中。在一些实施方案中，用于第一共培养步骤中的t细胞群是获自周边血液单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)。在一些实施方案中，通过周边血液样本的密度梯度离心来获得pbmc。在一些实施方案中，用于第一共培养步骤中的t细胞群存在于pbmc中。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞群(诸如使用任何本文所述方法制备的肿瘤抗原特异性t细胞的亚群)是用于共培养中，以获得进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，使用肿瘤抗原特异性t细胞的新鲜储备液的亚群，以获得进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，来自使用任何所述方法制备的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液的经解冻的肿瘤抗原特异性t细胞群是用于共培养中，以获得进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液可通过冷冻(诸如急速冷冻)肿瘤抗原特异性t细胞获得，此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过将经富集的活化t细胞群与抗原负载dc群共培养制备。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液储存于约-20℃至-70℃下。在一些实施方案中，在制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群之前，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液储存至少约1个月、3个月、6个月、12个月、2年、3年、或更长中任一者。在一些实施方案中，在制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群之前，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液储存不多于约5年、4年、3年、2年、1年、或更短中任一者。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液解冻一次，以用于制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液解冻不多于3或2次，以用于制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液等分成多种冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群，其中将各等分试样解冻一次以制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。活化t细胞的富集本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法包括富集步骤，该富集步骤包括富集来自共培养物的活化t细胞，该共培养物包含第一抗原负载dc群和t细胞群。在一些实施方案中，该方法包括富集步骤，该富集步骤包括富集来自经一种或多种肿瘤抗原肽或其片段刺激的pbmc的活化t细胞，其中此类pbmc是获自先前已接受masct的个体。在一些实施方案中，富集过程包括：基于响应于一种或多种肿瘤抗原肽或其片段刺激的共培养物的一种或多种(诸如1、2、3、或更多种中的任一者)t细胞活化生物标记来选择活化t细胞。在一些实施方案中，使用载有多种肿瘤抗原肽的apc(诸如pbmc)来刺激共培养物中的活化t细胞。在一些实施方案中，富集过程包括：自共培养物分离表达一种或多种生物标记(诸如细胞表面分子或分泌分子)的活化t细胞。在一些实施方案中，富集过程包括自共培养物分离表达或分泌一种或多种细胞因子的活化t细胞，该共培养物已经过一种或多种肿瘤抗原肽或其片段刺激。在一些实施方案中，富集步骤包括：使第一共培养物与抗原负载pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子。示例性细胞因子包括但不限于ifnγ和tnfα。可使用特异性识别细胞因子的配体(诸如该细胞因子的抗体或受体)来分离经富集的活化t细胞群。在一些实施方案中，富集步骤包括：使第一共培养物与抗原负载pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞表面分子，诸如4-1bb(还称为cd137)。在一些实施方案中，提供一种富集来自共培养物的活化t细胞的方法，该共培养物包含t细胞群、和载有一种或多种肿瘤抗原肽的dc群，该方法包括：使该共培养物与载有该一种或多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子或细胞表面分子。在一些实施方案中，细胞因子是ifnγ。在一些实施方案中，细胞表面分子是4-1bb。在一些实施方案中，富集过程包括在通过一种或多种肿瘤抗原肽或其片段刺激后，自共培养物分离分泌ifnγ的活化t细胞。在一些实施方案中，富集过程包括在通过一种或多种肿瘤抗原肽或其片段刺激后，自共培养物分离cd3+ifnγ+细胞。在一些实施方案中，富集过程包括：(1)使包括载有一种或多种肿瘤抗原肽或其片段的第一dc群和t细胞群的共培养物，与载有一种或多种肿瘤抗原肽或其片段的pbmc接触约10至24小时(诸如约1天)，以获得经刺激的共培养物；以及(2)使用特异性识别ifnγ的配体自该经刺激的共培养物分离活化t细胞。在一些实施方案中，在与抗原负载pbmc接触之前，已将第一抗原负载dc群与t细胞群共培养约1至7天(诸如约2至3天)。在一些实施方案中，在分离之前，使共培养物和抗原负载pbmc接触至少约2、4、6、12、18、24、或更多小时中任一者。可使用所属
技术领域：
：中任何已知的方法，自经刺激的共培养物分离或富集表达细胞因子(诸如ifnγ)的活化t细胞。例如，市售试剂盒可用于分离分泌ifnγ的t细胞，此类市售试剂盒包括来自miltenyibiotec的ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit。在一些实施方案中，通过下列分离分泌ifnγ的活化t细胞：(1)使共培养物与特异性结合至t细胞上的细胞表面抗原和ifnγ的ifnγ捕获试剂接触；(2)使经ifnγ捕获试剂处理的共培养物与抗ifnγ抗体(例如，缀合至r-藻红蛋白(r-phycoerthrin)或pe的抗ifnγ抗体)接触；(3)使经抗ifnγ抗体处理的共培养物与磁珠接触，该磁珠包括识别抗ifnγ抗体的二级抗体(例如，抗pe抗体)；以及(4)使用磁场(例如，使用macstm分离柱)分离磁珠，从而获得经富集的活化t细胞群。在一些实施方案中，通过下列分离表达细胞表面生物标记的活化t细胞：(1)使共培养物与针对细胞表面生物标记的荧光标示抗体接触；以及(2)通过流式细胞术自共培养物分离结合至荧光标示抗体的细胞。基于pbmc的方法在一些实施方案中，该方法使用自先前已接受免疫疗法(例如，masct)的个体获得的pbmc，以制备肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，提供一种制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法，其包括：a)使第一pbmc群与多种肿瘤抗原肽接触，以提供载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc群；b)使载有该多种肿瘤抗原肽的该pbmc群经受富集过程，以提供经富集的活化t细胞群；c)可选地使apc(例如，pbmc或dc)群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以提供抗原负载apc群；d)共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与该抗原负载apc群共培养，从而获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该富集过程之前，此类pbmc是与该多种肿瘤抗原肽接触不多于约5、4、3、2、或1天。在一些实施方案中，该富集过程包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的pbmc接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，该共培养步骤包括：在共培养基中将该经富集的活化t细胞群与该抗原负载apc群共培养，该共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)、免疫检查点抑制剂、和抗cd3抗体。在一些实施方案中，该共培养步骤包括：在初始共培养基中将该经富集的活化t细胞群与该抗原负载apc群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；以及将抗cd3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，在该共培养开始后约1至3天，将该抗cd3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该抗原负载apc群共培养总共约12至25天。在一些实施方案中，pbmc是新鲜获得。在一些实施方案中，pbmc是通过将pbmc的冷冻储备液解冻而获得。在一些实施方案中，pbmc是自体的，即获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，来自个体的周边血液具有少量dc或t细胞。在一些实施方案中，使pbmc与细胞因子(诸如il-2、gm-csf等)接触，以同时或于该接触步骤之后在此类pbmc中诱导某些细胞(诸如dc、t细胞、或其组合)的分化、成熟、或增殖。在一些实施方案中，在接触步骤后，将多种肿瘤抗原肽移除。apc的抗原负载本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法和masct方法使用载有一种或多种肿瘤抗原肽的apc(诸如pbmc、树突细胞、或细胞系apc)。在一些实施方案中，抗原负载apc(例如，抗原负载dc)是新鲜制备，以用于一个或多个共培养步骤。在一些实施方案中，抗原负载apc(例如，抗原负载dc)是新鲜制备，以用于各共培养步骤。在一些实施方案中，抗原负载apc(例如，抗原负载dc)经制备、培养于dc成熟培养基中、并用于一个或多个共培养或刺激步骤。用于第一、第二、和第三共培养步骤中的抗原负载dc可自单批次或分开批次的抗原负载dc获得。除非另有指示，否则本节中针对apc(例如，dc)所述的特征适用于各共培养步骤中使用的所有apc(例如，dc)；且本节中针对抗原负载apc(例如，dc)所述的方法和特征适用于第一群、第二群、和第三群的抗原负载apc和其他类型的apc。apc包括但不限于pbmc、dc、b细胞、或巨噬细胞。本文所述的apc可为初代细胞，或是衍生自细胞系。在一些实施方案中，此类apc是pbmc。在一些实施方案中，apc是固定pbmc。固定pbmc可破坏pbmc的增殖能力，同时维持pbmc的抗原呈现能力。用于各共培养步骤中的抗原负载dc可载有相同肿瘤抗原肽池或不同肿瘤抗原肽池。在一些实施方案中，第一共培养步骤中第一dc群所载有的肿瘤抗原肽池与第二共培养步骤中用来负载第二dc群的肿瘤抗原肽池相同。在一些实施方案中，第二共培养步骤中第二dc群载有第一共培养步骤中用来负载第一dc群的肿瘤抗原肽池的子集。在一些实施方案中，第三共培养步骤中第三dc群载有第一共培养步骤中用来负载第一dc群的肿瘤抗原肽池的子集和/或第二共培养步骤中用来负载第二dc群的肿瘤抗原肽池的子集。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽池的子集包括肿瘤抗原肽的片段及其组合。在一些实施方案中，使用单一肿瘤抗原肽或其片段，以负载用于第二共培养步骤和第三共培养步骤中的apc(诸如dc)。在一些实施方案中，使用个体于先前masct中使用的多种肿瘤抗原肽，制备用于第一共培养步骤的第一抗原负载dc群。在一些实施方案中，使用个体于先前masct中对其有特异性免疫反应的一种或多种肿瘤抗原肽，制备用于第一共培养步骤的第一抗原负载dc群。在一些实施方案中，针对衍生自个体的pbmc、活化t细胞、或肿瘤抗原特异性t细胞的特异性免疫反应，筛选(例如，通过elispot)来自多种肿瘤抗原肽或其片段的个别肿瘤抗原肽、和其组合，以识别用于后续制备肿瘤抗原特异性t细胞的一种或多种肿瘤抗原肽(包括其片段)。在一些实施方案中，在各共培养步骤之前，制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法包括下列步骤中的一者或多者：(1)自个体获得pbmc；(2)自pbmc获得单核细胞群；(3)诱导该单核细胞群分化为未成熟dc；(4)使此类未成熟dc与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc群；以及(5)在dc成熟培养基中培养该抗原负载dc群，该dc成熟培养基包含tlr激动剂(诸如mpla)。在一些实施方案中，抗原负载dc是通过下列制备：(a)使dc群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc群；以及(b)在dc成熟培养基中培养抗原负载dc群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。示例性tlr激动剂包括但不限于mpla(单磷酰脂a)、聚肌胞苷酸、雷西莫特(resquimod)、嘎德莫特(gardiquimod)、和cl075。可将细胞因子和其他适当分子(诸如infγ和pge2(前列腺素e2))进一步包括于成熟步骤中的培养基中。在一些实施方案中，抗原负载dc是通过下列制备：(a)使dc群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc群；以及(b)在dc成熟培养基中培养抗原负载dc群，该dc成熟培养基包含mpla、infγ、和pge2。在一些实施方案中，抗原负载dc是通过下列制备：(a)诱导单核细胞群分化为未成熟dc；(b)使未成熟dc群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得抗原负载dc群；以及(c)在dc成熟培养基中培养该抗原负载dc群，该dc成熟培养基包含mpla、infγ、和pge2。在一些实施方案中，单核细胞群是获自pbmc。在一些实施方案中，通过使pbmc群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，制备抗原负载pbmc。在一些实施方案中，通过使细胞系apc(例如，lcl)群与一种或多种肿瘤抗原肽接触，制备抗原负载细胞系apc。dc成熟培养基可包括合适浓度的mpla、infγ、和/或pge2。在一些实施方案中，dc成熟培养基以至少约0.5μg/ml的浓度包含mpla，诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更大μg/ml中任一者。在一些实施方案中，dc成熟培养基以约0.5至10、1至5、5至10、或2.5至7.5μg/ml中任一者的浓度包含mpla。在一些实施方案中，dc成熟培养基以至少约100iu/ml的浓度包含infγ，诸如至少约150、200、250、300、400、500、600、800、1000、或更大iu/ml中任一者。在一些实施方案中，dc成熟培养基以约100至1000、100至250、250至500、500至1000、或250至750iu/ml中任一者的浓度包含infγ。在一些实施方案中，dc成熟培养基以至少约0.1μg/ml的浓度包含pge2，诸如至少约0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、或更大μg/ml中任一者。在一些实施方案中，dc成熟培养基以约0.1至0.5、0.1至0.3、0.25至0.5、或0.2至0.4μg/ml中任一者的浓度包含pge2。可通过tlr激动剂诱导载有一种或多种肿瘤抗原肽的未成熟dc成熟至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20天中任一者。在一些实施方案中，诱导载有一种或多种肿瘤抗原肽的dc成熟约8、9、10、11、或12天。在一些实施方案中，抗原负载dc是呈现一种或多种肿瘤抗原肽的成熟dc。由本文所述的任何方法制备的成熟dc可呈现至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽。相较于天然dc、或尚未载有多种肿瘤抗原肽的dc，多抗原负载dc可具有增强的至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽的呈现水平。在一些实施方案中，成熟dc具有增强的多于10种肿瘤抗原肽的呈现水平。在一些实施方案中，成熟dc具有增强的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或更多种中任一者的肿瘤抗原肽的呈现水平，该肿瘤抗原肽是衍生自选自下列的蛋白质：htert、p53、存活素、ny-eso-1、cea、ccnd1、rgs5、mmp7、vegfr1、vegfr2、muc1、her2、mage-a1、mage-a3、cdca1、wt1、kras、parp4、mll3、mthfr、hbcag、hbv聚合酶、gpc3、ssx、和afp。在一些实施方案中，通过将一种或多种肿瘤抗原肽脉冲至apc群中，制备抗原负载apc(例如，dc或pbmc)。在一些实施方案中，通过将一种或多种肿瘤抗原肽脉冲至dc群中，制备抗原负载dc，此类dc诸如未成熟dc、或含在或衍生(诸如经分化)自pbmc的dc。如所属
技术领域：
：中已知的，脉冲(pulsing)是指将细胞(诸如apc(例如，pbmc或dc))与含有抗原肽的溶液混合、和可选地随后自混合物移除抗原肽的程序。可使dc群与一种或多种肿瘤抗原肽接触数秒、数分钟、数几小时，诸如约下列中的至少任一者：30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、5小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、10天、或更长。用于接触步骤中的各肿瘤抗原肽的浓度可为至少约0.1、0.5、1、2、3、5、或10μg/ml中任一者。在一些实施方案中，肿瘤抗原肽的浓度为约0.1至200μg/ml，包括例如约0.1至0.5、0.5至1、1至10、10至50、50至100、100至150、或150至200μg/ml中任一者。在一些实施方案中，apc(例如，dc或pbmc)群与一种或多种肿瘤抗原肽是在组合物存在下接触，该组合物促进apc(例如，dc或pbmc)摄取该一种或多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，化合物、材料、或组合物可包含于一种或多种肿瘤抗原肽的溶液中，以促进apc(例如，dc或pbmc)摄取肽。促进apc(例如，dc或pbmc)摄取一种或多种肿瘤抗原肽的化合物、材料、或组合物包括但不限于脂质分子并具有多个带正电氨基酸的肽。在一些实施方案中，apc(例如，dc或pbmc)群摄取多于约50％、60％、70％、80％、90％、或95％中任一者的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，群中多于约50％、60％、70％、80％、90％、或95％中任一者的apc(例如，dc或pbmc)摄取至少一种肿瘤抗原肽。树突细胞(诸如未成熟dc)可获自各种来源，包括自体来源，即来自接受治疗的个体。方便的dc细胞来源是来自周边血液的pbmc。例如，单核细胞(一种白血球)大量存在于pbmc中，其构成约5％至30％的总pbmc。可使用细胞因子诱导单核细胞分化为dc，诸如未成熟dc。在一些实施方案中，未成熟dc是通过下列制备：获得pbmc群；自pbmc群获得单核细胞群；以及使单核细胞群与一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)接触，以获得未成熟dc群。可用于诱导单核细胞分化的示例性细胞因子包括但不限于gm-csf和il-4，其中诱导是在所属
技术领域：
：中已知的条件(诸如浓度、温度、co2水平等)下进行。pbmc的黏附部分含有pbmc中大多数的单核细胞。在一些实施方案中，使来自pbmc黏附部分的单核细胞与细胞因子接触，以获得未成熟dc群。可通过将周边血液样本离心、或使用血球分离(apheresis)方法自个体收集，方便地获得pbmc。在一些实施方案中，通过人类周边血液样本的密度梯度离心来获得pbmc群。在一些实施方案中，样本是来自接受下列者的个体：多抗原负载dc、肿瘤抗原特异性t细胞、或其他使用多抗原负载dc制备的免疫治疗组合物。本专利申请进一步提供的是一种分离dc群，其是通过本文所述方法的任何实施方案制备。在一些实施方案中，分离dc群能够在体内或体外引发mhc限制性t细胞反应。在一些实施方案中，mhc限制性t细胞反应是由mhci类和mhcii类分子介导。在一些实施方案中，分离dc群能够诱导肿瘤抗原特异性t细胞分化和增殖。肿瘤抗原肽本文所述方法和masct方法使用一种或多种肿瘤抗原肽，以制备抗原负载apc(诸如抗原负载dc)、活化t细胞、和肿瘤抗原特异性t细胞(可体外和在体内触发特异性免疫反应)。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本(诸如裂解细胞组合物)。如本文所用，“来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽(oneormoretumorantigenpeptidesfromthepluralityoftumorantigenpeptides)”是指该多种肿瘤抗原肽中的子选择或所有肿瘤抗原肽，其包括此类肿瘤抗原肽的片段及其组合。在一些实施方案中，各肿瘤抗原肽包括至少约1、2、3、4、5、或10种中任一者的表位，该表位是来自单一蛋白质抗原(包括新抗原)。在一些实施方案中，在多种肿瘤抗原肽中的各肿瘤抗原肽包括至少一种可由t细胞受体识别的表位。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括来自单一蛋白质抗原的至少2个表位的肿瘤抗原肽。肿瘤抗原肽可为来自含有一个或多个表位的蛋白质抗原的自然衍生肽片段、或具有一个或多个天然表位序列的人工设计肽，其中连接肽可选地可置于相邻表位序列之间。在一些优选实施方案中，含在相同肿瘤抗原肽中的表位是衍生自相同的蛋白质抗原。肿瘤抗原肽可含有至少一种mhc-i表位、至少一种mhc-ii表位、或(多种)mhc-i表位和(多种)mhc-ii表位两者。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括mhc-i表位的肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种包括mhc-ii表位的肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽中的至少一种肿瘤抗原肽包括mhc-i表位和mhc-ii表位两者。可将特殊设计策略应用于肿瘤抗原肽(包括新抗原肽)的序列，以优化对载有肿瘤抗原肽的dc的免疫反应。一般而言，较确切表位肽为长的肽可增加肽至dc中的摄取。在一些实施方案中，根据具有表位的蛋白质的天然序列，将mhc-i或mhc-ii表位序列在n端或c端或两端延伸，以获得延伸序列，其中该延伸序列适于由i类和ii类两者mhc分子呈现、和由不同个体中不同亚型的mhc分子呈现。在一些实施方案中，将表位序列在一端或两端延伸至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或20个中任一者的氨基酸残基，以产生延伸表位。在一些实施方案中，包括mhc-i或mhc-ii表位的肽进一步包括在n端、c端、或两端的侧接表位的附加氨基酸。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽中的各肿瘤抗原肽为至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100个中任一者的氨基酸长。多种肿瘤抗原肽中的不同肿瘤抗原肽可具有相同长度或不同长度。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽为各自约20至40个氨基酸长。在一些实施方案中，本专利申请中用于设计肿瘤抗原肽的一个或多个表位肽的氨基酸序列是基于所属
技术领域：
：中已知的序列或可得自公共数据库的序列，公共数据库诸如peptidedatabase(vigneronn.etal.cancerimmunity,13:15(2013))。在一些实施方案中，使用用于t细胞表位预测的生物信息工具，基于抗原蛋白的序列，预测一个或多个表位肽的氨基酸序列。用于t细胞表位预测的示例性生物信息工具是所属
技术领域：
：中已知的，例如参见yangx.和yux.(2009)的“anintroductiontoepitopepredictionmethodsandsoftware”rev.med.virol.19(2):77-96。在一些实施方案中，抗原蛋白的序列为所属
技术领域：
：中已知的或可得自公共数据库。在一些实施方案中，通过对正接受治疗的个体的样本(诸如肿瘤样本)进行定序，判定抗原蛋白的序列。本专利申请设想到衍生自所属
技术领域：
：中已知的任何肿瘤抗原和表位(包括新抗原和新表位(neoepitope))的肿瘤抗原肽、或由发明人使用生物信息工具特别开发或预测的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽进一步包括第二组的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，新抗原肽是癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、和第二组的癌症类型特异性抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽仅由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽、和一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、第二组的癌症类型特异性抗原肽、和一种或多种新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽进一步包括第二组的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，新抗原肽是癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、和第二组的癌症类型特异性抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽仅由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括第一核心组的一般肿瘤抗原肽、和一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由第一核心组的一般肿瘤抗原肽、第二组的癌症类型特异性抗原肽、和一种或多种新抗原肽组成。第一核心组的一般肿瘤抗原肽是衍生自常由各种不同类型癌症过度表达的肿瘤抗原。因此，第一核心组的一般肿瘤抗原肽有用于制备树突细胞和/或活化t细胞，以用于治疗患有不同癌症类型的个体。例如，在一些实施方案中，第一核心组的一般肿瘤抗原肽有用于本文所述的用于治疗各种癌症的方法，此类癌症诸如肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰脏癌、卵巢癌、乳癌、神经胶质瘤、食道癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肾癌、或肝细胞癌。第一核心组的示例性肿瘤抗原肽包括但不限于衍生自下列的肽：htert、p53、存活素、ny-eso-1、cea、ccnd1、met、muc1、her2、magea1、magea3、wt-1、rgs5、mmp7、vegfr(诸如vegfr1和vegfr2)、和cdca1。第一核心组可包括衍生自至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的肿瘤抗原的肽。第一核心组可包括至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、或更多种中任一者的一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包括多于一种一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，第一核心组包括约10至约20种一般肿瘤抗原肽。第二组的癌症类型特异性抗原肽是衍生自仅在一种或有限数目的癌症类型中过度表达的肿瘤抗原。因此，第二组的癌症类型特异性抗原肽有用于制备树突细胞和/或活化t细胞，以用于治疗患有特定癌症类型的个体。用于治疗肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)的示例性癌症类型特异性抗原肽包括但不限于衍生自ssx、afp、和gpc3的肽。在一些实施方案中，一种或多种癌症特异性抗原肽是衍生自病毒的病毒特异性抗原肽，该病毒可诱导癌症，或者在感染个体时涉及个体内的癌症发展。在一些实施方案中，病毒特异性抗原肽对感染个体的病毒亚型具特异性。用于治疗合并hbv感染的hcc患者的示例性病毒特异性抗原肽包括但不限于衍生自hbv核心抗原(hbcag)、和hbvdna聚合酶的肽。在一些实施方案中，第二组包括衍生自hbv抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法是用于治疗个体中的肝细胞癌。在一些实施方案中，第二组包括衍生自hpv抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法是用于治疗个体中的子宫颈癌。在一些实施方案中，第二组包括衍生自ebv抗原的病毒特异性抗原肽，其中该方法是用于治疗个体中的鼻咽癌。第二组的癌症类型特异性抗原肽可包括衍生自至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多种中任一者的癌症类型特异性抗原的肽。第二组癌症类型特异性抗原肽可包括至少约1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多种中任一者的癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包括多于一种癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，第二组包括约1至约10种癌症类型特异性抗原肽。在一些实施方案中，癌症类型特异性抗原肽所靶向的癌症类型是选自基本上由下列所组成的群组：肝细胞癌、子宫颈癌、鼻咽癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、乳癌、子宫内膜癌、和淋巴瘤。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中任一者)新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽是由新抗原肽组成。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽，且未包括一般肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种一般肿瘤抗原肽、和一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括一种或多种一般肿瘤抗原肽、一种或多种癌症类型特异性抗原肽、和一种或多种新抗原肽。新抗原肽是衍生自新抗原。新抗原是存在于个体(诸如正接受癌症治疗的个体)的肿瘤细胞中的最新取得并表达的抗原。在一些实施方案中，新抗原是衍生自突变蛋白质抗原，此类突变蛋白质抗原仅存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中。新抗原可独特地存在于经癌症治疗的个体的肿瘤细胞(诸如所有肿瘤细胞或部分肿瘤细胞)中，或者在患有类似的癌症类型的个体接受治疗时存在于该个体中。在一些实施方案中，新抗原是克隆性(clonal)新抗原。在一些实施方案中，新抗原是次克隆性(subclonal)新抗原。在一些实施方案中，新抗原存在于个体中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的肿瘤细胞中。在一些实施方案中，新抗原肽包括mhc-i限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括mhc-ii限制性新表位。在一些实施方案中，新抗原肽经设计以促进i类和ii类两者mhc分子呈现新表位，例如通过在n端和c端两者延伸新表位。示例性新抗原肽包括但不限于衍生自下列的新表位：突变体kras(例如，krasg12a)、parp4(例如，parp4t1170i)、mll3(例如，mll3c988f)、和mthfr(例如，mthfra222v)。可基于正接受治疗的个体的一个或多个肿瘤部位的基因轮廓(geneticprofile)选择新抗原肽，且新抗原不会表达于在正常组织中。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括全长基因组的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括外显子的序列信息。在一些实施方案中，肿瘤样本的基因轮廓包括癌症相关基因的序列信息。适用于本专利申请的新抗原肽可衍生自肿瘤细胞中的任何突变蛋白，诸如由突变癌症相关基因编码的突变蛋白。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自癌症相关基因的单一新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自癌症相关基因的多于一种(诸如2、3、或更多种)新表位。在一些实施方案中，新抗原肽包括衍生自多于一种(诸如2、3、或更多种)癌症相关基因的多于一种(诸如2、3、或更多种)新表位。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原包括衍生自单一癌症相关基因的多种新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原包括衍生自多于一种(诸如2、3、4、5、或更多种中任一者)癌症相关基因的多种新抗原肽。癌症相关基因是过度表达于癌细胞中的基因，但此类基因是以低水平表达于正常细胞中。示例性癌症相关基因包括但不限于abl1、akt1、akt2、akt3、alk、alox12b、apc、ar、araf、arid1a、arid1b、arid2、asxl1、atm、atrx、aurka、aurkb、axl、b2m、bap1、bcl2、bcl2l1、bcl2l12、bcl6、bcor、bcorl1、blm、bmpr1a、braf、brca1、brca2、brd4、brip1、bub1b、cadm2、card11、cbl、cblb、ccnd1、ccnd2、ccnd3、ccne1、cd274、cd58、cd79b、cdc73、cdh1、cdk1、cdk2、cdk4、cdk5、cdk6、cdk9、cdkn1a、cdkn1b、cdkn1c、cdkn2a、cdkn2b、cdkn2c、cebpa、chek2、ciita、crebbp、crkl、crlf2、crtc1、crtc2、csf1r、csf3r、ctnnb1、cux1、cyld、ddb2、ddr2、depdc5、dicer1、dis3、dmd、dnmt3a、eed、egfr、ep300、epha3、epha5、epha7、erbb2、erbb3、erbb4、ercc2、ercc3、ercc4、ercc5、esr1、etv1、etv4、etv5、etv6、ewsr1、ext1、ext2、ezh2、fam46c、fanca、fancc、fancd2、fance、fancf、fancg、fas、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、fh、fkbp9、flcn、flt1、flt3、flt4、fus、gata3、gata4、gata6、gli1、gli2、gli3、gna11、gnaq、gnas、gnb2l1、gpc3、gstm5、h3f3a、hnf1a、hras、id3、idh1、idh2、igf1r、ikzf1、ikzf3、insig1、jak2、jak3、kcnip1、kdm5c、kdm6a、kdm6b、kdr、keap1、kit、kras、linc00894、lmo1、lmo2、lmo3、map2k1、map2k4、map3k1、mapk1、mcl1、mdm2、mdm4、mecom、mef2b、men1、met、mitf、mlh1、mll(kmt2a)、mll2(ktm2d)、mpl、msh2、msh6、mtor、mutyh、myb、mybl1、myc、mycl1(mycl)、mycn、myd88、nbn、negr1、nf1、nf2、nfe2l2、nfkbia、nfkbiz、nkx2-1、notch1、notch2、npm1、nprl2、nprl3、nras、ntrk1、ntrk2、ntrk3、palb2、park2、pax5、pbrm1、pdcd1lg2、pdgfra、pdgfrb、phf6、phox2b、pik3c2b、pik3ca、pik3r1、pim1、pms1、pms2、pnrc1、prame、prdm1、prf1、prkar1a、prkci、prkcz、prkdc、prpf40b、prpf8、psmd13、ptch1、pten、ptk2、ptpn11、ptprd、qki、rad21、raf1、rara、rb1、rbl2、recql4、rel、ret、rfwd2、rheb、rhpn2、ros1、rpl26、runx1、sbds、sdha、sdhaf2、sdhb、sdhc、sdhd、setbp1、setd2、sf1、sf3b1、sh2b3、slitrk6、smad2、smad4、smarca4、smarcb1、smc1a、smc3、smo、socs1、sox2、sox9、sqstm1、src、srsf2、stag1、stag2、stat3、stat6、stk11、sufu、suz12、syk、tcf3、tcf7l1、tcf7l2、terc、tert、tet2、tlr4、tnfaip3、tp53、tsc1、tsc2、u2af1、vhl、wrn、wt1、xpa、xpc、xpo1、znf217、znf708、和zrsr2。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少一种(诸如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或更多种中任一者)肿瘤抗原肽，其各包括由癌症相关基因编码的一个或多个表位，该癌症相关基因是选自：htert、p53、存活素、ny-eso-1、cea、ccnd1、rgs5、mmp7、vegfr1、vegfr2、muc1、her2、mage-a1、mage-a3、cdca1、wt1、kras、parp4、mll3、mthfr、hbcag、hbv聚合酶、gpc3、ssx、和afp。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括至少10种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括衍生自下列的肿瘤抗原肽：htert、p53、存活素、ny-eso-1、cea、ccnd1、muc1、her2、magea1、magea3、wt-1、rgs5、vegfr1、vegfr2、和cdca1。在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原肽存在于组合物中，该组合物具有至少约95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、或更高百分比中任一者的肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原肽的纯度为至少约98％。在一些实施方案中，为了将肿瘤抗原肽脉冲至dc中，一种或多种肿瘤抗原肽于培养基中的溶解度为至少约80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.9％、或更高中任一者。在一些实施方案中，为了将肿瘤抗原肽脉冲至apc中，一种或多种肿瘤抗原肽为约100％可溶于培养基中。masct在一些实施方案中，用于本文所述的制备肿瘤抗原特异性肽的方法的t细胞、pbmc、和dc是获自先前已接受masct的个体。在一些实施方案中，例如如elispot所判定，个体已对用于本文所述的制备肿瘤抗原特异性肽的方法中的多种肿瘤抗原肽发展出特异性反应。如本文所用，“masct”或“多抗原特异性细胞疗法(multipleantigenspecificcelltherapy)”是指过继性t细胞疗法的方法，其包括向个体施用有效量的活化t细胞，此类活化t细胞是通过将t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的dc群共培养而制备。masct方法已描述于例如国际专利申请公布号wo2016145578a1和国际专利申请公布号pct/cn2018/081338中，其内容全文以引用方式并入本文中。第一代masct、精准masct(precisionmasct)、基于pbmc的masct、定制masct、基于新抗原的masct、改良masct、和与masct的组合疗法(例如，免疫检查点抑制剂和masct)均在本专利申请的masct的范围内。本专利申请或国际专利申请公布号wo2016145578a1和pct/cn2018/081338中所述的用于抗原负载dc制备、活化t细胞制备、富集步骤、和共培养步骤的任何合适特征和参数可在masct治疗中组合。个体可能已接受单一类型的masct、或不同类型的masct的组合，例如定制masct和改良masct。个体可能已接受一个或多个周期的masct。在一些实施方案中，个体已接受至少约2、5、10、15、20、或更多个周期中任一者的masct。在一些实施方案中，个体已接受经过至少约3个月、6个月、9个月、12个月、2年、3年、或更长中任一者的masct。在一些实施方案中，该masct包括：向该个体施用有效量的活化t细胞，其中此类活化t细胞是通过将t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如dc)群共培养而制备。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，先前已对个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞。在一些实施方案中，该方法包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(诸如dc)。在一些实施方案中，在施用活化t细胞之前约7天至约21天(诸如约7天至约14天、或约14天至约21天)，施用抗原递呈细胞。在一些实施方案中，施用抗原递呈细胞至少三次。在一些实施方案中，抗原递呈细胞经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，活化t细胞和抗原递呈细胞群是来自相同个体。在一些实施方案中，活化t细胞和/或抗原递呈细胞群是来自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，抗原递呈细胞群是dc、b细胞、或巨噬细胞的群。在一些实施方案中，抗原递呈细胞是dc。在一些实施方案中，masct进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，该masct包括：(a)向该个体施用有效量的载有多种肿瘤抗原肽的dc；(b)将载有该多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群共培养，以获得活化t细胞群；以及(c)向该个体施用有效量的此类活化t细胞。在一些实施方案中，dc施用与活化t细胞施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天、或约14天)。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下施用。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，将t细胞群与载有多种肿瘤抗原肽的dc群共培养约7天至约21天(诸如约7天至约10天、约10天至约15天、约15天至约21天、约14天至约21天、或约10天)。在一些实施方案中，t细胞群是衍生自周边血液单核细胞(pbmc)群的非黏附部分。在一些实施方案中，共培养进一步包括使活化t细胞与一种或多种细胞因子(诸如多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、il-21、或其任何组合)和可选地抗cd3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间，使t细胞群与免疫检查点抑制剂(诸如pd-1、pd-l1、或ctla-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，通过使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，制备载有多种肿瘤抗原肽的dc群。在一些实施方案中，t细胞群和dc群是衍生自相同个体。在一些实施方案中，t细胞群、dc群、pbmc群、或其任何组合是衍生自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，masct进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，该masct包括：(a)诱导单核细胞群分化为dc群；(b)使该dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的dc群；(c)向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的此类dc；(d)将载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群与非黏附pbmc群共培养，以获得活化t细胞群；以及(e)向该个体施用有效量的此类活化t细胞，其中该单核细胞群和该非黏附pbmc群是获自pbmc群。在一些实施方案中，dc施用与活化t细胞施用之间的间隔为约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、约10天、或约14天)。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下施用。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，共培养历时约7天至约21天(诸如约7天至约14天、约14天至约21天、或约10天)。在一些实施方案中，共培养进一步包括使活化t细胞与一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子，诸如il-2、il-7、il-15、il-21、或其任何组合)和可选地抗cd3抗体接触。在一些实施方案中，在共培养之前和/或期间，使非黏附pbmc群与免疫检查点抑制剂(诸如pd-1、pd-l1、或ctla-4的抑制剂)接触。在一些实施方案中，pbmc群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，masct进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，masct包括：使周边血液单核细胞(pbmc)群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得活化pbmc群；以及向个体施用有效量的活化pbmc。在一些实施方案中，pbmc群与多种肿瘤抗原肽是在组合物存在下接触，该组合物促进pbmc中抗原递呈细胞(诸如dc)摄取多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，pbmc群与多种肿瘤抗原肽是在免疫检查点抑制剂存在下接触，该免疫检查点抑制剂诸如pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、tim-3、btla、vista、和lag-3的抑制剂。在一些实施方案中，使活化pbmc群与il-2接触。在一些实施方案中，施用活化pbmc至少三次。在一些实施方案中，各活化pbmc施用之间的间隔为约2周至约5个月(诸如约3个月)。在一些实施方案中，活化pbmc经静脉内施用。在一些实施方案中，pbmc群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，masct进一步包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂同时施用，诸如以相同组合物施用。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，该masct包括：(a)在初始共培养基中将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；b)在该共培养开始后约3至7天，将抗cd3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化t细胞群；以及(c)向该个体施用有效量的此类活化t细胞。在一些实施方案中，多种细胞因子包括il-2、il-7、il-15、和il-21。在一些实施方案中，il-2以至少约500iu/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体以至少约10μg/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗cd3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群在抗cd3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，dc群和t细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，该masct包括：a)使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的dc群；b)在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群，该dc成熟培养基包含mpla；c)将载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群与t细胞群共培养，从而获得该活化t细胞群；以及d)向该个体施用有效量的此类活化t细胞。在一些实施方案中，步骤c)包括在共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群与t细胞群共培养，该共培养基包含介白素混合物、免疫检查点抑制剂、和抗cd3抗体。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群在抗cd3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，dc成熟培养基包含infγ和mpla。在一些实施方案中，dc成熟培养基进一步包括pge2。在一些实施方案中，mpla以至少约0.5μg/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，infγ以至少约100iu/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，pge2以至少约0.1μg/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括il-2、il-7、il-15、和il-21。在一些实施方案中，il-2以至少约500iu/ml的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体以至少约10μg/ml的浓度存在于共培养基中。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群在抗cd3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，dc群和t细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，该masct包括：a)使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的dc群；b)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群与t细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；c)在该共培养开始后约3至7天，将抗cd3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化t细胞群；以及d)向该个体施用有效量的此类活化t细胞。在一些实施方案中，步骤(a)进一步包括在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。在一些实施方案中，tlr激动剂是选自mpla、聚肌胞苷酸、雷西莫特、嘎德莫特、和cl075。在一些实施方案中，dc成熟培养基包含pge2。在一些实施方案中，多种细胞因子包括il-2、il-7、il-15、和il-21。在一些实施方案中，il-2以至少约500iu/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体以至少约10μg/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，在共培养开始后约5天，将抗cd3抗体添加至共培养物。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群在抗cd3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，dc群和t细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，该masct包括：a)使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的dc群；b)在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群，该dc成熟培养基包含mpla；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群与t细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(例如，多种细胞因子)和免疫检查点抑制剂；d)将抗cd3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化t细胞群；以及e)向该个体施用有效量的此类活化t细胞。在一些实施方案中，在该共培养开始时，将该抗cd3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，在该共培养开始后，将该抗cd3抗体添加至该共培养物。在一些实施方案中，dc成熟培养基包含infγ和mpla。在一些实施方案中，dc成熟培养基进一步包括pge2。在一些实施方案中，mpla以至少约0.5μg/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，infγ以至少约100iu/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，pge2以至少约0.1μg/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，多种细胞因子包括il-2、il-7、il-15、和il-21。在一些实施方案中，il-2以至少约500iu/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。在一些实施方案中，抗pd-1抗体以至少约10μg/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群在抗cd3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，dc群和t细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下、皮内、或静脉内施用。在一些实施方案中，该masct包括：a)使dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的dc群；b)在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群，该dc成熟培养基包含mpla、infγ、和pge2；c)在初始共培养基中将载有该多种肿瘤抗原肽的该dc群与t细胞群共培养，以提供共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，该多种细胞因子包括il-2、il-7、il-15、和il-21)和抗pd-1抗体；d)在该共培养开始后约3至7天(例如，约5天)，将抗cd3抗体添加至该共培养物，从而获得该活化t细胞群；以及e)向该个体施用有效量的此类活化t细胞。在一些实施方案中，mpla以至少约0.5μg/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，infγ以至少约100iu/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，pge2以至少约0.1μg/ml的浓度存在于dc成熟培养基中。在一些实施方案中，il-2以至少约500iu/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，抗pd-1抗体以至少约10μg/ml的浓度存在于初始共培养基中。在一些实施方案中，将载有多种肿瘤抗原肽的dc群与t细胞群在抗cd3抗体存在下共培养至少约10天。在一些实施方案中，dc群和t细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，向个体施用活化t细胞至少三次。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc。在一些实施方案中，施用载有多种肿瘤抗原肽的dc至少三次。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下、皮内、或静脉内施用。大致上，可根据个体的大小和状况，并根据标准医药实务，判定本文所述的活化t细胞和载有多种肿瘤抗原肽的dc群的剂量、时程、和施用途径。示例性施用途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、膀胱内(intravesicular)、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内(intrathecal)、或经皮。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下施用。在一些实施方案中，活化t细胞经静脉内施用。施用至个体的细胞剂量可根据下列而变化：例如所施用的细胞的具体类型、施用途径、和所治疗的癌症的具体类型和阶段。该量应足以产生期望的反应，诸如对癌症的治疗反应，但没有严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，待施用的活化t细胞或dc的量是治疗有效量。在一些实施方案中，细胞(诸如多抗原负载dc、或活化t细胞)的量是足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数目、或降低肿瘤生长速率的量，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应肿瘤大小、癌细胞数目、或肿瘤生长速率，或相较于未接受治疗的其他个体的对应活性。可使用标准方法来测量此效应的量值，诸如采用纯化酶的体外测定法、基于细胞的测定法、动物模型、或人体试验。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×105、5×105、1×106、1.5×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、或5×107个细胞/个体。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至2×106、2×106至3×106、3×106至4×106、4×106至5×106、5×106至6×106、6×106至7×106、7×106至8×106、8×106至1×108、1×106至3×106、3×106至5×106、5×106至7×106、2×106至2×107、5×106至2×107、或1×106至2×107个细胞/个体。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约1×106个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约1.5×106至约1.5×107个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×104、2.5×104、5×104、1×105、2×105、2.5×105、4×105、6×105、8×105、1×106、2×106、或1×107个细胞/kg。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至2×105、2×105至4×105、4×105至6×105、6×105至8×105、8×105至1×106、1×106至2×106、2×106至1×107、1×104至1×105、1×105至1×106、1×106至1×107、1×104至1×106、或1×105至1×107个细胞/kg。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以至少约2×105个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，抗原负载树突细胞是以约2.5×104至约2.5×105个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，活化t细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、或5×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，活化t细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、3×109至7×109、1×1010至2×1010、或1×109至1×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，活化t细胞是以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化t细胞是以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，活化t细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，活化t细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×107至1×108、1×107至5×107、2×107至4×107、5×107至1×108、1×108至2×108、5×107至1×108、1×108至2×108、2×108至5×108、1×108至1×109、或1×107至1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，活化t细胞是以至少约6×107个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，活化t细胞是以约1.5×107至约2×108个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，masct特别适用于在个体癌症中具有低总突变负荷的个体。在一些实施方案中，masct特别适用于在个体癌症中具有癌症相关基因中低突变负荷的个体。在一些实施方案中，masct特别适用于在个体癌症中具有t细胞反应相关免疫基因中低突变负荷的个体。在一些实施方案中，masct特别适用于在个体癌症中具有mhc基因中低突变负荷的个体。突变负荷可为在下列中的突变负荷：所有癌细胞、或癌细胞的子集，诸如原发性或转移性肿瘤部位，例如肿瘤活检样本中的细胞。在一些实施方案中，一个或多个基因的低突变负荷是在该一个或多个基因上累积的突变数量少。在一些实施方案中，不多于约500、400、300、200、100、50、40、30、20、10、5、或更少中任一者的突变的总数指示低突变负荷。在一些实施方案中，在一个或多个mhc基因中不多于约50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1个中任一者的突变指示该一个或多个mhc基因的低突变负荷。在一些实施方案中，一个或多个基因的低突变负荷是在该一个或多个基因(诸如mhc基因)上累积的突变数量与在所选基因集(诸如癌症相关基因)或全基因组中的突变总数之间的低比率。在一些实施方案中，一个或多个mhc基因包括mhci类基因(或基因座)。在一些实施方案中，一个或多个mhc基因包括mhcii类基因(或基因座)。在一些实施方案中，其中个体是人类个体，一个或多个mhc基因是选自hla-a、hla-b、hla-c、和b2m。示例性突变包括但不限于缺失、移码、插入、插入或缺失(indel)、误义突变、无意义突变、点突变、拷贝数变异、单一核苷酸变异(singlenucleotidevariation,snv)、缄默突变、剪接位突变、剪接变体、基因融合、和易位。在一些实施方案中，mhc基因的拷贝数变异是由基因组的结构性重排造成，其包括染色体或其片段的缺失、重复、倒位、和易位。在一些实施方案中，一个或多个mhc基因中的突变是选自点突变、移码突变、基因融合、和拷贝数变异。在一些实施方案中，突变是在mhc基因的蛋白质编码区中。在一些实施方案中，突变是非同义突变。在一些实施方案中，突变不具多型性。在一些实施方案中，突变存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变不存在于个体的正常细胞中。在一些实施方案中，突变影响由受影响基因编码的mhc分子的生理化学或功能性质，诸如稳定性或结合亲和力。在一些实施方案中，突变导致mhc分子中不可逆的缺陷。在一些实施方案中，突变降低mhc分子对t细胞表位和/或t细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是功能丧失型突变。在一些实施方案中，突变导致mhc分子中可逆的缺陷。在一些实施方案中，突变不影响mhc分子对t细胞表位和/或t细胞受体的结合亲和力。在一些实施方案中，突变是体细胞突变。在一些实施方案中，突变是生殖系突变。计入突变负荷的突变可存在于所有癌细胞中或癌细胞的子集中。在一些实施方案中，突变存在于个体的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变存在于肿瘤部位的所有癌细胞中。在一些实施方案中，突变为克隆性。在一些实施方案中，突变为次克隆性。在一些实施方案中，突变存在于个体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的癌细胞中。某些mhc基因中和/或一个或多个mhc基因的某些域或位置中的突变可能对个体对本文所述治疗方法的临床反应具有更深远的影响。例如，功能丧失型突变可发生在hla分子之前导肽序列、a3域(其结合t细胞的cd8辅受体)、a1肽结合域、或a2肽结合域中；参见例如shuklas.etal.naturebiotechnology33,1152-1158(2015)，其以引用方式并入本文中。b2m(β2-巨球蛋白)基因中的突变也可启动肿瘤逃脱表型。参见例如monicabetal.cancerimmunol.immu.,(2012)61:1359-1371。在一些实施方案中，在一个或多个mhc基因的功能区中存在任何数量(诸如1、2、3、4、5、或更多个)的突变指示高突变负荷，此类功能区诸如前导肽序列、a1域、a2域、或a3域。在一些实施方案中，在一个或多个mhc基因(诸如人类个体中的hla-a、hla-b、或hla-c基因)中存在任何数量(诸如1、2、3、4、5、或更多个)的功能丧失型突变指示高突变负荷。在一些实施方案中，一个或多个mhc基因中的低突变负荷在功能区中不包括突变，此类功能区包括该一个或多个mhc基因(诸如hla-a、hla-b、或hla-c基因)之前导肽序列、a1域(例如，与cd8辅受体直接接触的残基)、a2域、和a3域(例如，与表位直接接触的残基)。在一些实施方案中，在b2m基因中存在任何数量的突变(诸如功能丧失型突变)指示高突变负荷。在一些实施方案中，在一个或多个mhc基因中的低突变负荷在b2m基因中不包括突变。可通过所属
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：中任何已知的方法来判定一个或多个基因(诸如mhc基因)的突变负荷，此类方法包括但不限于基因组dna定序、外显子定序、或其他使用桑格定序或次世代定序平台的基于dna定序的方法；聚合酶连锁反应测定；原位杂交测定；以及dna微数组。在一些实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本定序，判定一个或多个mhc基因的突变负荷。在一些实施方案中，定序是次世代定序。在一些实施方案中，定序是全基因组定序。在一些实施方案中，定序是外显子定序，诸如全外显子定序(wholeexomesequencing,“wes”)。在一些实施方案中，定序是rna定序。在一些实施方案中，定序是候选基因(诸如癌症相关基因加上hla基因)的靶向定序。例如，oncogxonetmplus(admerahealth)可用于对癌症相关基因和hla基因座定序，且具有高定序深度。在一些实施方案中，可使用相同的定序数据来判定一个或多个mhc基因的突变负荷并识别个体中的新抗原。在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如细针穿刺的肿瘤细胞、或由腹腔镜术获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤基质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得。在一些实施方案中，肿瘤样本经冷冻。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(formaldehydefixed-paraffinembedded,ffpe)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包括循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过将来自血液的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,ctc)分类，获得肿瘤样本。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取核酸(诸如dna和/或rna)，以用于定序分析。在一些实施方案中，将肿瘤样本的定序数据与参考样本(诸如来自相同个体的健康组织样本、或健康个体的样本)的定序数据比较，以识别突变并判定肿瘤细胞中的突变负荷。在一些实施方案中，将肿瘤样本的定序数据与来自基因组数据库的参考序列比较，以识别突变并判定肿瘤细胞中的突变负荷。任何masct方法可包括使用在多种肿瘤抗原肽中的一种或多种新抗原肽。在一些实施方案中，该masct进一步包括基于个体中具有一种或多种(诸如至少5种)新抗原而选择用于治疗方法的个体的步骤、和/或下列步骤：(i)识别该个体的新抗原；以及(ii)将衍生自该新抗原的新抗原肽并入该多种肿瘤抗原肽，以用于该治疗方法。在一些实施方案中，该masct包括：(a)识别该个体的新抗原；(b)将新抗原肽并入多种肿瘤抗原肽，其中该新抗原肽包括该新抗原中的新表位；(c)可选地施用有效量的载有该多种肿瘤抗原肽的dc；(d)通过将抗原负载dc与t细胞群共培养来制备活化t细胞群；以及(e)向该个体施用有效量的活化t细胞，其中该个体具有一种或多种新抗原。个体可具有任何数量(诸如至少约1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、100、或更多种中任一者)的新抗原，以受益于masct方法，该方法使用包括新抗原肽的多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，masct方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多种中任一者的新抗原的个体。在一些实施方案中，新抗原包括一个或多个新表位。在一些实施方案中，masct方法特别适用于具有至少约4、5、6、7、8、10、15、20、50、100、或更多个中任一者的新表位的个体。在一些实施方案中，t细胞表位是mhc-i限制性表位。在一些实施方案中，相较于对应的野生型t细胞表位，新表位对个体的mhc分子具有较高的亲和性。在一些实施方案中，相较于对应的野生型t细胞表位，新表位对模型t细胞受体具有较高的亲和性。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是克隆性新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是次克隆性新抗原。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)存在于个体中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更多中任一者的肿瘤细胞中。masct可用于单一疗法、以及与另一种药剂的组合疗法。例如，可将任何本文所述的治疗方法与一种或多种(诸如1、2、3、4、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂的施用组合。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自：pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、tim-3、btla、vista、和lag-3的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。示例性抗pd-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、bms-936559、和阿替珠单抗、派姆单抗、mk-3475、amp-224、amp-514、sti-a1110、和tsr-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是shr-1210。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-l1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-l1抗体。示例性抗pd-l1抗体包括但不限于ky-1003、mcla-145、rg7446、bms935559、mpdl3280a、medi4736、阿维鲁单抗(avelumab)、或sti-a1010。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是ctla-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。示例性抗ctla-4抗体包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗、和kahr-102。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(例如，)。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂同时施用。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是以单一组合物施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂存在于第一、第二、或第三共培养物中。在一些实施方案中，在施用前(诸如紧接在施用前)将活化t细胞和免疫检查点抑制剂混合。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是经由不同组合物同时施用。在一些实施方案中，活化t细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用活化t细胞之前施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用活化t细胞之后施用。免疫检查点抑制剂的示例性施用途径包括但不限于肿瘤内、膀胱内、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、颅内、胸膜内、皮下、和表皮途径，或经递送至已知含有此类活癌细胞的淋巴腺、身体空间、器官、或组织中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经静脉内施用在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是通过输注施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、或更长中任一者内输注。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与活化t细胞相同的施用途径施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与活化t细胞不同的施用途径施用。合适的免疫检查点抑制剂剂量包括但不限于约下列中任一者：1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、20mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、750mg/m2、1000mg/m2、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1至约5mg/m2、约5至约10mg/m2、约10至约20mg/m2、约20至约50mg/m2、约50至约100mg/m2、约100mg/m2至约200mg/m2、约200至约300mg/m2、约300至约400mg/m2、约400至约500mg/m2、约500至约750mg/m2、或约750至约1000mg/m2。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是约下列中任一者：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每日施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以一周至少约1x、2x、3x、4x、5x、6x、或7x(即每日)中任一者施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用且没有中断；每周(三周中有两周)；每周(四周中有三周)；每两周一次；每3周一次；每4周一次；每6周一次；每8周、每月、或每二至12个月一次。在一些实施方案中，各施用之间的间隔少于约下列中任一者：6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天。在一些实施方案中，各施用之间的间隔多于约下列中任一者：1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、或12个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每3个月施用一次。在一些实施方案中，给药时程没有中断。在一些实施方案中，各施用之间的间隔不多于约一周。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与活化t细胞相同的给药时程施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与活化t细胞不同的给药时程施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在每个masct治疗周期中施用。例如，每个masct治疗周期可施用免疫检查点抑制剂约1、2、3、4、5、6、或更多次中的任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂并未在每个masct治疗周期中施用。例如，免疫检查点抑制剂可约每1、2、3、4、5、或更多个masct治疗周期施用一次。可在延长时段(诸如约一个月到至多约七年)内施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在至少约下列中任一者的期间内施用免疫检查点抑制剂：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是单次施用。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂直到疾病进展。新抗原的数量可与其他生物标记或选择标准组合，以为本文所述masct方法中任一者选择个体。在一些实施方案中，masct方法特别适用于以下的个体：在癌细胞中具有低突变负荷(诸如在一个或多个mhc基因中)，和/或具有至少约4、5、6、7、8、10、或更多种中任一者的新抗原(诸如具有高亲和性mhc-i限制性新表位的新抗原)。可基于个体的新抗原设计任何数量(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种中任一者)的新抗原肽，并将其并入用于任何本文所述的治疗方法的多种肿瘤抗原肽中。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括单一新抗原肽。在一些实施方案中，多种肿瘤抗原肽包括多种新抗原肽。各新抗原肽可包括一个或多个新表位，该新表位是来自个体的新抗原。在一些实施方案中，新表位是t细胞表位。基于新抗原设计新抗原肽的方法描述于“多种肿瘤抗原肽”一节中。可使用所属
技术领域：
：中任何已知的方法，识别个体中的新抗原。在一些实施方案中，基于来自个体的肿瘤样本的基因轮廓识别新抗原。各新抗原包括一个或多个新表位。在一些实施方案中，基于肿瘤样本的基因轮廓，识别新抗原中的一个或多个新表位。可使用任何已知的基因解析方法(诸如次世代定序(ngs)方法、微数组、或蛋白质体方法)来提供肿瘤样本的基因轮廓。在一些实施方案中，通过对来自个体的肿瘤样本定序，识别新抗原。在一些实施方案中，定序是次世代定序。在一些实施方案中，定序是全基因组定序。在一些实施方案中，定序是外显子定序，诸如全外显子定序(“wes”)。在一些实施方案中，定序是rna定序。在一些实施方案中，定序是候选基因(诸如癌症相关基因)的靶向定序。许多市售ngs癌症组(例如oncogxonetmplus(admerahealth))可用于对癌症相关基因定序，且具有高定序深度。在一些实施方案中，肿瘤样本是组织样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是肿瘤活检样本，诸如细针穿刺的肿瘤细胞、或由腹腔镜术获得的肿瘤细胞(诸如包括肿瘤基质)。在一些实施方案中，肿瘤样本是新鲜获得。在一些实施方案中，肿瘤样本经冷冻。在一些实施方案中，肿瘤样本是甲醛固定石蜡包埋(formaldehydefixed-paraffinembedded,ffpe)样本。在一些实施方案中，肿瘤样本是细胞样本。在一些实施方案中，肿瘤样本包括循环转移性癌细胞。在一些实施方案中，通过将来自血液的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,ctc)分类，获得肿瘤样本。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取核酸(诸如dna和/或rna)，以用于定序分析。在一些实施方案中，自肿瘤样本萃取蛋白质，以用于定序分析。在一些实施方案中，将肿瘤样本的基因轮廓与参考样本(诸如来自相同个体的健康组织样本、或健康个体的样本)的基因轮廓比较，以识别肿瘤细胞中的候选突变基因。在一些实施方案中，将肿瘤样本的基因轮廓与来自基因组数据库的参考序列比较，以识别肿瘤细胞中的候选突变基因。在一些实施方案中，候选突变基因是癌症相关基因。在一些实施方案中，各候选突变基因包括：一个或多个突变，诸如非同义取代、插入或缺失(indel/insertionordeletion)、或基因融合，其可产生新抗原。常见的单核苷酸多型性(singlenucleotidepolymorphism,snp)是排除在候选突变之外。在一些实施方案中，自候选突变蛋白识别新抗原中的新表位。在一些实施方案中，以计算机仿真预测新表位。用于t细胞表位预测的示例性生物信息工具是所属
技术领域：
：中已知的，例如参见yangx.和yux.(2009)的“anintroductiontoepitopepredictionmethodsandsoftware”rev.med.virol.19(2):77-96。t细胞表位预测算法中所考虑的因素包括但不限于个体的mhc亚型、t细胞表位的序列衍生的生理化学性质、mhc结合模体、蛋白酶体裂解模式、抗原处理相关转运蛋白(transporterassociatedwithantigenprocessing,tap)转运效率、mhc结合亲和力、肽-mhc稳定性、和t细胞受体结合亲和力。在一些实施方案中，新表位是mhc-i限制性表位。在一些实施方案中，新表位是mhc-ii限制性表位。在一些实施方案中，新表位对个体的mhc分子具有高亲和性。在一些实施方案中，该方法进一步包括判定个体的mhc亚型(例如，自定序数据判定)，以识别个体的一种或多种mhc分子。在一些实施方案中，该方法进一步包括判定新表位对mhc分子(诸如mhci类分子)的亲和性。在一些实施方案中，该方法包括判定新表位对个体的一种或多种mhc(诸如mhci类)分子的亲和性。在一些实施方案中，将新表位对个体的一种或多种mhc分子的亲和性，与对应野生型表位对个体的一种或多种mhc分子的亲和性比较。在一些实施方案中，选择相较于对应野生型表位，对个体的一种或多种mhc分子(诸如mhc-i分子)具有较高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)亲和性的新表位。在一些实施方案中，使用所属
技术领域：
：中任何已知的工具或方法，以计算机仿真预测mhc结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验判定mhc结合亲和力，诸如使用体外结合测定。在一些实施方案中，该masct进一步包括判定复合物对t细胞受体的亲和性，该复合物包括新表位和mhc分子(诸如个体的mhci类分子)。在一些实施方案中，将包括新表位和mhc分子的复合物对t细胞受体的亲和性，与包括对应野生型表位和mhc分子的复合物的亲和性比较。在一些实施方案中，mhc分子是来自个体。在一些实施方案中，t细胞受体是在个体的一个或多个t细胞的表面上。在一些实施方案中，选择相较于对应野生型表位，在复合物中对t细胞受体模型具有较高(诸如至少约1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、或更多倍中任一者)亲和性的新表位，该复合物包括新表位和mhc分子。在一些实施方案中，使用所属
技术领域：
：中任何已知的任何工具或方法，以计算机仿真预测tcr结合亲和力。在一些实施方案中，通过实验判定tcr结合亲和力，例如通过判定t细胞对新表位的反应。在一些实施方案中，进一步基于肿瘤样本中新抗原(或新表位)的表达水平，识别该新抗原(或新表位)。可使用所属
技术领域：
：中任何已知的mrna或蛋白质水平定量方法，诸如rt-pcr、基于抗体的测定法、和质谱术，判定新抗原(或新表位)的表达水平。在一些实施方案中，自肿瘤样本的定序数据，判定新抗原(或新表位)的表达水平。在一些实施方案中，新抗原(或新表位)是以至少约10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、104、或更多个中任一者拷贝/细胞的水平表达于肿瘤细胞中。在一些实施方案中，相较于对应野生型蛋白质(或对应野生型表位)，新抗原(或新表位)是以多于约1.5、2、5、10、20、50、100、或更多倍中任一者的水平表达于肿瘤细胞中。在一些实施方案中，通过包括下列的步骤选择或识别新抗原肽：(a)对来自个体的肿瘤样本定序以识别新抗原；(b)识别新抗原中的新表位；可选地(c)判定该个体的mhc亚型(例如，使用定序数据判定)，以识别该个体的mhc分子；可选地(d)判定该新表位对该个体的该mhc分子的亲和性；可选地(e)判定复合物对t细胞受体的亲和性，该复合物包括该新表位和该mhc分子；以及(f)获得包括该新表位的肽，以提供该新抗原肽。在一些实施方案中，相较于包括对应野生型t细胞表位和mhc分子的复合物，新表位对个体的mhc分子(诸如mhc-i分子)具有较高亲和性，和/或在包括该新表位和该mhc分子的复合物中对tcr具有较高亲和性。在一些实施方案中，根据具有表位的新抗原的天然序列，将新表位在n端或c端或两端延伸，以获得延伸序列，其中该延伸序列适于由i类和ii类两者mhc分子呈现。使用一种或多种新抗原肽的任何本文所述的治疗方法可进一步包括任一个或多个新抗原选择/识别步骤。iii.治疗方法本专利申请提供治疗个体中癌症的基于细胞的免疫治疗方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用第ii节所述的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，该方法是用于作为个体先前所接受的masct的维持疗法。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过包括下列的步骤制备：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群；以及d)向该个体施用有效量的此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与抗原负载apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，抗原负载dc经皮下施用。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过包括下列的步骤制备：a)使第一dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群；b)第一共培养步骤，其包括将载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；c)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；d)使第二树突细胞群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群；以及e)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二dc群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：a)使第一dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有多种肿瘤抗原肽的第一dc群；b)第一共培养步骤，其包括将载有该多种肿瘤抗原肽的该第一dc群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；c)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；d)使第二树突细胞群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二dc群；以及e)第二共培养步骤，其包括：在初始第二共培养基中将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二dc群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群；以及f)向该个体施用有效量的此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行不多于约7天(诸如约1至3天，例如约3天)。在一些实施方案中，该t细胞群与该第一抗原负载dc群之间的比率不大于约30:1(例如，约20:1、15:1、或10:1)。在一些实施方案中，该第一抗原负载dc群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)。在一些实施方案中，该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群之间的比率为约1:1至约20:1(例如，约1:1或约2:1)。在一些实施方案中，在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。在一些实施方案中，该富集步骤包括：使该第一共培养物与抗原负载apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(诸如ifnγ)或细胞表面分子。在一些实施方案中，将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养约12至25天。在一些实施方案中，该方法包括：在初始第二共培养基中将该第二抗原负载dc群与该t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)和可选地一种或多种细胞因子(例如，il-2或多种细胞因子)添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，抗原负载dc经皮下施用。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过下列制备：将(例如，来自冷冻储备液的)肿瘤抗原特异性t细胞群与载有一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc或dc)群共培养，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过本文所述的用于制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，apc群和肿瘤抗原特异性t细胞群是衍生自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，抗原负载dc经皮下施用。除了(多个)施用步骤之外，治疗方法的一些实施方案进一步包括下列细胞制备步骤中的一者或多者：1)自该个体获得pbmc；2)自此类pbmc获得dc群(例如，通过诱导来自此类pbmc的单核细胞群分化)；3)自此类pbmc获得t细胞群；4)制备载有一种或多种肿瘤抗原肽的dc群；5)在dc成熟培养基中诱导该抗原负载dc群成熟；6)将第一抗原负载dc群与t细胞群共培养；7)使共培养物经受富集过程，以提供经富集的活化t细胞群，该共培养物包含该第一抗原负载dc群和该t细胞群；8)将第二抗原负载dc群与经富集的活化t细胞群共培养；9)冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群；10)将肿瘤抗原特异性t细胞群解冻；以及11)将载有一种或多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc或dc)群与来自冷冻储备液的经解冻的肿瘤抗原特异性t细胞群共培养。因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)自该个体获得pbmc群；(b)自该pbmc群获得第一dc群；(c)使该第一dc群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得第一抗原负载dc群；(d)在dc成熟培养基中培养该第一抗原负载dc群，该dc成熟培养基包含mpla、infγ、和pge2；(e)可选地向该个体施用有效量的此类抗原负载dc；(f)第一共培养步骤，其包括：在共培养基中将该第一抗原负载dc群与t细胞群(例如，在pbmc存在下)共培养，以提供包括活化t细胞的第一共培养物，该共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；(g)富集步骤，其包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的apc(例如，pbmc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子(例如，ifnγ)或细胞表面分子；(h)可选地使第二dc群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得第二抗原负载dc群；(i)第二共培养步骤，其包括：在初始共培养基中将该经富集的活化t细胞群与该第二抗原负载dc群共培养，以提供第二共培养物，该初始共培养基包含一种或多种细胞因子(诸如il-2、或多种细胞因子，例如il-2、il-7、il-15、和il-21)和免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-1抗体)；以及将抗cd3抗体(例如，okt3)添加至该第二共培养物，以提供肿瘤抗原特异性t细胞；以及(j)向该个体施用有效量的此类肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，第一dc群和第二dc群、和t细胞群是获自正接受治疗的个体。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞经静脉内施用。在一些实施方案中，抗原负载dc经皮下施用。在一些实施方案中，该方法进一步包括：冷冻此类肿瘤抗原特异性t细胞群，以获得冷冻储备液；将来自该冷冻储备液的经解冻的肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第三dc群共培养，以提供第二肿瘤抗原特异性t细胞群；以及施用有效量的该第二肿瘤抗原特异性t细胞群。本文所述方法适用于治疗各种癌症，包括液体和实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症是选自：肝细胞癌、子宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、肾癌、乳癌、胰脏癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、和脑癌。此类方法适用于所有期别的癌症，包括早期、晚期、和转移性癌症。在一些实施方案中，该方法降低与癌症相关联的一种或多种症状的严重性，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应症状，或相较于未接受该治疗方法的其他个体的对应症状。在一些实施方案中，该方法延迟癌症的进展。在一些实施方案中，该方法是用于治疗肝细胞癌(hcc)。在一些实施方案中，hcc是早期hcc、非转移性hcc、原发性hcc、晚期hcc、局部晚期hcc、转移性hcc、缓解中hcc、或复发性hcc。在一些实施方案中，hcc是局部可切除的(即，局限于肝脏的一部分而允许完全手术切除的肿瘤)、局部无法切除的(即，因为涉及至关重要的血管结构，或者因为肝脏受损，局部肿瘤可能无法切除)、或无法切除的(即，肿瘤涉及所有肝叶，和/或已扩散而涉及其他器官(例如肺部、淋巴结、骨骼))。在一些实施方案中，根据tnm分类，hcc是第i期肿瘤(单个肿瘤无血管侵犯)、第ii期肿瘤(单个肿瘤有血管侵犯，或多个肿瘤皆未大于5cm)、第iii期肿瘤(多个肿瘤且任一个大于5cm，或肿瘤涉及门静脉或肝静脉的主要分支)、第iv期肿瘤(肿瘤直接侵犯胆囊以外的邻近器官，或具有内脏腹膜穿孔)、n1肿瘤(区域淋巴结转移)、或m1肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，根据ajcc(美国癌症联合委员会(americanjointcommissiononcancer))分期标准，hcc为tl、t2、t3、或t4期hcc。在一些实施方案中，hcc是肝细胞癌、hcc的纤维板层变体、混合型肝细胞胆管癌(mixedhepatocellularcholangiocarcinoma)中任一者。在一些实施方案中，hcc是由b型肝炎病毒(hbv)感染引起。在一些实施方案中，该方法是用于治疗肺癌。在一些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)。ncslc的示例包括但不限于大细胞癌(例如，大细胞神经内分泌癌、复合型大细胞神经内分泌癌、基底细胞样癌、淋巴上皮瘤样癌、透明细胞癌、和具类横纹肌表型的大细胞癌)、腺癌(例如，腺泡、乳突(例如，细支气管肺泡癌，非黏液性、黏液性、混合型黏液性和非黏液性、和未定型细胞类型)、实体腺癌(具黏液素)、具混合亚型的腺癌、分化良好的胎儿型腺癌、黏液性(胶状)腺癌、黏液性囊腺癌、印环状腺癌、和透明细胞腺癌)、神经内分泌肺部肿瘤、和鳞状细胞癌(例如，乳突、透明细胞、小细胞、和基底细胞样)。在一些实施方案中，根据tnm分类，nsclc可为t期肿瘤(原发性肿瘤)、n期肿瘤(区域淋巴结)、或m期肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，肺癌是类癌(典型或非典型)、腺鳞状细胞癌、圆柱瘤、或唾液腺的癌(例如，腺样囊状癌或黏液类上皮癌)。在一些实施方案中，肺癌是具有多形性、肉瘤状、或肉瘤部分的癌(例如，具有梭状细胞和/或巨细胞的癌、梭状细胞癌、巨细胞癌、癌肉瘤、或肺母细胞瘤)。在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(smallcelllungcancer,sclc；还称为燕麦细胞癌)。小细胞肺癌可为局限期、扩散期、或复发性小细胞肺癌。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有怀疑或显示与肺癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，sash1、lats1、igf2r、park2、kras、pten、kras2、krag、pas1、ercc1、xpd、il8ra、egfr、α1-ad、ephx、mmp1、mmp2、mmp3、mmp12、il1β、ras、和/或akt)，或者具有一个或多个附加拷贝的与肺癌相关联的基因。在一些实施方案中，该方法是用于治疗子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是早期子宫颈癌、非转移性子宫颈癌、局部晚期子宫颈癌、转移性子宫颈癌、缓解中子宫颈癌、无法切除的子宫颈癌、于辅助性治疗中的子宫颈癌、或于新辅助性治疗中的子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是由人类乳突病毒(hpv)感染引起。在一些实施方案中，根据tnm分类，子宫颈癌可为t期肿瘤(原发性肿瘤)、n期肿瘤(区域淋巴结)、或m期肿瘤(远处转移)。在一些实施方案中，子宫颈癌是下列中任一者：第0期、第i期(tis、n0、m0)、第ia期(t1a、n0、m0)、第ib期(t1b、n0、m0)、第iia期(t2a、n0、m0)、第iib期(t2b、n0、m0)、第iiia期(t3a、n0、m0)、第iiib期(t3b、n0、m0，或t1至t3、n1、m0)、第iva期(t4、n0、m0)、或第ivb期(t1至t3、n0至n1、m1)子宫颈癌。在一些实施方案中，子宫颈癌是子宫颈鳞状细胞癌、子宫颈腺癌、或腺鳞状细胞癌。在一些实施方案中，该方法是用于治疗乳癌。在一些实施方案中，乳癌是早期乳癌、非转移性乳癌、局部晚期乳癌、转移性乳癌、激素受体阳性转移性乳癌、缓解中乳癌、于辅助性治疗中的乳癌、乳管原位癌(ductalcarcinomainsitu,dcis)、侵袭性乳管癌(invasiveductalcarcinoma,idc)、或于新辅助性治疗中的乳癌。在一些实施方案中，乳癌是激素受体阳性转移性乳癌。在一些实施方案中，乳癌(其可为her2阳性或her2阴性)是晚期乳癌。在一些实施方案中，乳癌是乳管原位癌。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有与乳癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，brca1、brca2、atm、chek2、rad51、ar、diras3、erbb2、tp53、akt、pten、和/或pi3k)，或者具有一个或多个附加拷贝的与乳癌相关联的基因(例如，一个或多个附加拷贝的her2基因)。在一些实施方案中，该方法是用于治疗胰脏癌。在一些实施方案中，胰脏癌包括但不限于浆液性微囊性腺瘤、胰管内乳突状黏液性肿瘤、黏液性囊性肿瘤、实体伪乳突状肿瘤、胰脏腺癌、胰管腺癌、或胰母细胞瘤。在一些实施方案中，胰脏癌是早期胰脏癌、非转移性胰脏癌、原发性胰脏癌、经切除的胰脏癌、晚期胰脏癌、局部晚期胰脏癌、转移性胰脏癌、无法切除的胰脏癌、缓解中胰脏癌、复发性胰脏癌、于辅助性治疗中的胰脏癌、或于新辅助性治疗中的胰脏癌中任一者。在一些实施方案中，该方法是用于治疗卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢上皮细胞癌。示例性卵巢上皮细胞癌组织学分类包括：浆液性囊瘤(例如，浆液性良性囊腺瘤、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的浆液性囊腺瘤、或浆液性囊腺癌)、黏液性囊瘤(例如，黏液性良性囊腺瘤、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的黏液性囊腺瘤、或黏液性囊腺癌)、子宫内膜样肿瘤(例如，子宫内膜样良性囊肿、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的子宫内膜样肿瘤、或子宫内膜样腺癌)、透明细胞(中肾样)肿瘤(例如，良性透明细胞肿瘤、具上皮细胞增殖活性和核异常但无浸润性破坏性生长的透明细胞肿瘤、或透明细胞囊腺癌)、无法指派至上述群组中的一者的未分类肿瘤、或其他恶性肿瘤。在各种实施方案中，卵巢上皮细胞癌是第i期(例如，第ia、ib、或ic期)、第ii期(例如，第iia、iib、或iic期)、第iii期(例如，第iiia、iiib、或iiic期)、或第iv期。在一些实施方案中，个体可为符合以下条件的人类：具有与卵巢癌相关联的基因、基因突变、或多型性(例如，brca1或brca2)，或者具有一个或多个附加拷贝的与卵巢癌相关联的基因(例如，一个或多个附加拷贝的her2基因)。在一些实施方案中，卵巢癌是卵巢生殖细胞肿瘤。示例性组织学亚型包括：恶性胚胎瘤或其他生殖细胞肿瘤(例如，内胚窦瘤(诸如肝样或肠肿瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、或混合型肿瘤)。示例性畸胎瘤是未成熟畸胎瘤、成熟畸胎瘤、实体畸胎瘤、和囊性畸胎瘤(例如，皮样囊肿，诸如成熟囊性畸胎瘤、和具恶性转化的皮样囊肿)。一些畸胎瘤是单胚层且高度特异性的，诸如甲状腺肿样卵巢瘤、类癌、甲状腺肿样卵巢瘤和类癌、或其他者(例如，恶性神经外胚层和室管膜瘤)。在一些实施方案中，卵巢生殖细胞肿瘤是第i期(例如，第ia、ib、或ic期)、第ii期(例如，第iia、iib、或iic期)、第iii期(例如，第iiia、iiib、或iiic期)、或第iv期。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法不适用于患有t细胞来源的癌症(诸如t细胞淋巴瘤)的患者。数种病毒与人类的癌症有关。例如，b型肝炎病毒(hbv)可能引发慢性肝脏感染，而增加个体罹患肝癌、或肝细胞癌(hcc)的可能性。人类乳突病毒(hpv)是具有多于150种相关病毒的群组，当其感染并生长于皮肤或黏膜(诸如口腔、咽喉、或阴道)时，会引起乳突瘤、或疣。已知数种类型的hpv(包括第16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、和6型)会引起子宫颈癌。hpv还在诱导或引起其他生殖器癌症上扮演角色，并与口腔和咽喉的一些癌症相关。艾司坦-巴尔病毒(ebv)是一种疱疹病毒，其长期感染并保持潜伏于b淋巴细胞中。ebv感染增加个体发展鼻咽癌和某些类型快速生长淋巴瘤(诸如burkitt氏淋巴瘤)的风险。ebv还与霍奇金氏淋巴瘤(hodgkinlymphoma)和一些胃癌病例相关。除了引起癌症或增加发展癌症的风险之外，病毒感染(诸如hbv、hpv、和ebv感染)可导致组织或器官损伤，其可能增加罹患癌症的个体的疾病负担，并促成癌症进展。所属
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：中已知的是，可诱导人体发动有效且特异性免疫反应，此类免疫反应包括对数种癌症相关病毒的细胞毒性t细胞反应，此类病毒诸如hbv、hpv、和ebv(包括其各种亚型)。因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中病毒相关癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备此类肿瘤抗原特异性t细胞，其中该多种肿瘤抗原肽包括衍生自该病毒的一种或多种肿瘤抗原肽。在一些实施方案中，癌症是hbv相关的肝细胞癌、hpv相关的子宫颈癌、或ebv相关的鼻咽癌。本文所述方法可用于下列目的中任一者或多者：减轻癌症的一种或多种症状、延迟癌症的进展、缩小癌症肿瘤大小、扰乱(诸如破坏)癌症基质、抑制癌症肿瘤生长、延长整体存活、延长无疾病存活、延长至癌症疾病进展的时间、预防或延迟癌症肿瘤转移、减少(诸如根除)先前存在的癌症肿瘤转移、减少先前存在的癌症肿瘤转移的发生率或负担、预防癌症复发、和/或改善癌症的临床效益。在一些实施方案中，提供一种抑制个体中癌细胞增殖(诸如肿瘤生长)的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)的细胞增殖。在一些实施方案中，提供一种抑制个体中肿瘤转移的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，抑制至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)的转移。在一些实施方案中，提供抑制转移至淋巴结的方法。在一些实施方案中，提供一种减小个体中肿瘤大小的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，肿瘤大小减小至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、或100％中任一者)。在一些实施方案中，提供一种延长个体中癌症无进展存活的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，该方法将至疾病进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周中任一者。在一些实施方案中，提供一种延长患有癌症的个体的存活的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，该方法将至疾病进展的时间延长至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12周中任一者。在一些实施方案中，该方法延长个体存活至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、或24个月中任一者。在一些实施方案中，提供一种在患有癌症的个体中减少不良效应(adverseeffect,ae)和严重不良效应(severeadverseeffect,sae)的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是使用本文所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，该方法进一步包括向该个体施用有效量的抗原负载dc。在一些实施方案中，该方法可预测和/或导致客观反应(诸如部分反应或完全反应)。在一些实施方案中，该方法可预测和/或导致生活质量改善。除了通常与其他癌症疗法相关联的常见不良事件之外，一些癌症免疫疗法与免疫相关不良事件(immune-relatedadverseevent,irae)相关联。irae通常与命中目标(on-target)t细胞毒性或偏离目标(off-target)效应呈机械式相关，该命中目标t细胞毒性对抗表达于正常非肿瘤组织中的目标抗原，即所谓的命中目标偏离肿瘤(on-targetoff-tumor)效应，该偏离目标效应诸如自身耐受性破坏或表位交叉反应。irae可导致在下列的严重症状和病况：皮肤、胃肠、内分泌、肝、眼、神经、和其他组织或器官。所属
技术领域：
：中已知的针对癌症免疫治疗方法所报导的一般irae包括：致命免疫介导的皮肤炎、肺炎、结肠炎、淋巴细胞性垂体炎、胰脏炎、淋巴腺病、内分泌病症、cns毒性等。在一些实施方案中，治疗方法与不良事件(诸如irae)的低发生率相关联。在一些实施方案中，少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％中任一者的个体经历irae，诸如第2至5级irae。大致上，可根据个体的大小和状况，并根据标准医药实务，判定肿瘤抗原特异性t细胞和载有多种肿瘤抗原肽的dc群的剂量、时程、和施用途径。示例性施用途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、膀胱内(intravesicular)、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内(intrathecal)、或经皮。在一些实施方案中，载有多种肿瘤抗原肽的dc经皮下施用。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞经静脉内施用。施用至个体的细胞剂量可根据下列而变化：例如所施用的细胞的具体类型、施用途径、和所治疗的癌症的具体类型和阶段。该量应足以产生期望的反应，诸如对癌症的治疗反应，但没有严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，待施用的肿瘤抗原特异性t细胞或dc的量是治疗有效量。在一些实施方案中，细胞(诸如多抗原负载dc、或肿瘤抗原特异性t细胞)的量是足以减小肿瘤大小、减少癌细胞数目、或降低肿瘤生长速率的量，其差异为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％中任一者，此是相较于相同个体在治疗前的对应肿瘤大小、癌细胞数目、或肿瘤生长速率，或相较于未接受治疗的其他个体的对应活性。可使用标准方法来测量此效应的量值，诸如采用纯化酶的体外测定法、基于细胞的测定法、动物模型、或人体试验。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×108、5×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、1.5×1010、2×1010、或5×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、3×109至7×109、1×1010至2×1010、或1×109至1×1010个细胞/个体。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以至少约3×109个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以约1×109至约1×1010个细胞/个体的剂量施用。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以至少约下列中任一者的剂量施用：1×107、2×107、4×107、6×107、8×107、1×108、2×108、4×108、6×108、8×108、1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以约下列中任一者的剂量施用：1×107至1×108、1×107至5×107、2×107至4×107、5×107至1×108、1×108至2×108、5×107至1×108、1×108至2×108、2×108至5×108、1×108至1×109、或1×107至1×109个细胞/kg。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以至少约6×107个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是以约1.5×107至约2×108个细胞/kg的剂量施用。在一些实施方案中，稳定剂或赋形剂(诸如人类白蛋白)是与肿瘤抗原特异性t细胞和/或抗原负载dc一起使用可基于施用医师的判断，在治疗过程中调整治疗方法中细胞的剂量和给药时程。在一些实施方案中，施用肿瘤抗原特异性t细胞，而未施用抗原负载dc。在一些实施方案中，在施用载有多种肿瘤抗原肽的dc后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或1个月中任一者，施用肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞是与dc同时施用。在一些实施方案中，在施用dc后约14至21天，施用肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，在施用dc后约14天，施用肿瘤抗原特异性t细胞。治疗方法可包括单一治疗或重复治疗。在一些实施方案中，施用肿瘤抗原特异性t细胞至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10次中任一者。在一些实施方案中，施用肿瘤抗原特异性t细胞至少3次。在一些实施方案中，施用dc至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10次中任一者。在一些实施方案中，施用dc至少3次。在一些实施方案中，在dc、肿瘤抗原特异性t细胞、或两者重复施用之前，重复一个或多个细胞(诸如抗原负载树突细胞或肿瘤抗原特异性t细胞)制备步骤。在一些实施方案中，治疗方法是每周重复一次、2周重复一次、3周重复一次、4周重复一次、每月重复一次、每2个月重复一次、每3个月重复一次、每4个月重复一次、每5个月重复一次、每6个月重复一次、每7个月重复一次、每8个月重复一次、每9个月重复一次、或每年重复一次。在一些实施方案中，dc、或肿瘤抗原特异性t细胞的各施用之间的间隔为约1周至2周、2周至1个月、2周至2个月、1个月至2个月、1个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至一年中任一者。在一些实施方案中，dc、或肿瘤抗原特异性t细胞的各施用之间的间隔为约0.5至约5个月，诸如约2周至约2个月、或约2个月至约5个月。在一些实施方案中，如果个体具有疾病稳定，则在前6个月治疗期间每月、在第二回6个月治疗期间每两个月、和前12个月治疗后每半年，重复治疗方法的所有步骤一次。在一些实施方案中，重复治疗包括：使用先前所制备的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液来制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群；以及向该个体施用有效量的该进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。在重复治疗全程期间，本文所述的治疗方法的任何实施方案可与该治疗方法的任何其他实施方案组合。本文提供的疗法方法可用于作为第一疗法、第二疗法、第三疗法、或与所属
技术领域：
：中已知的其他类型的癌症疗法的组合疗法，诸如化疗、手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、标靶治疗、冷疗、超音波疗法、光动力疗法、射频烧灼等，其在辅助性疗法或新辅助性疗法中。在一些实施方案中，该疗法方法是用于作为第一疗法。在一些实施方案中，不存在其他批准的用于个体的抗癌疗法。在一些实施方案中，该疗法方法是用于作为第二疗法，其中该个体先前已接受切除、射频烧灼、化疗、辐射疗法、或其他类型的癌症疗法。在一些实施方案中，个体已发生进展或已无法耐受标准抗癌疗法。在一些实施方案中，个体在接受本文所述治疗方法之前、同时、或之后，接受其他类型的癌症疗法。例如，本文所述的治疗方法可以范围自数分钟、数天、数周至数个月的间隔，于其他癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)之前或之后进行。在一些实施方案中，第一疗法与第二疗法之间的间隔使得肿瘤抗原特异性t细胞和其他癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)能够对个体发挥有利组合效应。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法是与其他治疗个体中癌症的癌症疗法(诸如化疗、辐射、手术、或其组合)配合使用。本文所述的组合疗法方法可单独执行或与另一种诸如下列的疗法配合执行：手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、荷尔蒙疗法、标靶治疗、冷疗、超音波疗法、光动力疗法、化疗等。此外，具有较大发展增殖性疾病的风险的人可接受治疗，以抑制和/或延迟疾病发展。本文所述的用于治疗癌症的方法可用于单一疗法、以及与另一种药剂的组合疗法。例如，可将任何本文所述的治疗方法与一种或多种(诸如1、2、3、4、或更多种中任一者)免疫检查点抑制剂的施用组合。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自：pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、tim-3、btla、vista、和lag-3的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-1抗体。示例性抗pd-1抗体包括但不限于尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、bms-936559、和阿替珠单抗、派姆单抗、mk-3475、amp-224、amp-514、sti-a1110、和tsr-042。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是尼沃鲁单抗(例如)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗(例如，)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是shr-1210。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-l1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗pd-l1抗体。示例性抗pd-l1抗体包括但不限于ky-1003、mcla-145、rg7446、bms935559、mpdl3280a、medi4736、阿维鲁单抗(avelumab)、或sti-a1010。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是ctla-4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗ctla-4抗体。示例性抗ctla-4抗体包括但不限于伊匹单抗、曲美木单抗、和kahr-102。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗(例如，)。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞和免疫检查点抑制剂同时施用。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞和免疫检查点抑制剂是以单一组合物施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂存在于第一、第二、或第三共培养物中。在一些实施方案中，在施用前(诸如紧接在施用前)将肿瘤抗原特异性t细胞和免疫检查点抑制剂混合。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞和免疫检查点抑制剂是经由不同组合物同时施用。在一些实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞和免疫检查点抑制剂是依序施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用肿瘤抗原特异性t细胞之前施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在施用肿瘤抗原特异性t细胞之后施用。免疫检查点抑制剂的示例性施用途径包括但不限于肿瘤内、膀胱内、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、颅内、胸膜内、皮下、和表皮途径，或经递送至已知含有此类活癌细胞的淋巴腺、身体空间、器官、或组织中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂经静脉内施用在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是通过输注施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在至少约10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、或更长中任一者内输注。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与肿瘤抗原特异性t细胞相同的施用途径施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是经由与肿瘤抗原特异性t细胞不同的施用途径施用。合适的免疫检查点抑制剂剂量包括但不限于约下列中任一者：1mg/m2、5mg/m2、10mg/m2、20mg/m2、50mg/m2、100mg/m2、200mg/m2、300mg/m2、400mg/m2、500mg/m2、750mg/m2、1000mg/m2、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1至约5mg/m2、约5至约10mg/m2、约10至约20mg/m2、约20至约50mg/m2、约50至约100mg/m2、约100mg/m2至约200mg/m2、约200至约300mg/m2、约300至约400mg/m2、约400至约500mg/m2、约500至约750mg/m2、或约750至约1000mg/m2。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是约下列中任一者：1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、或更大。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂剂量是下列中任一者：约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约0.1mg/kg、约0.1mg/kg至约0.2mg/kg、约0.2mg/kg至约0.3mg/kg、约0.3mg/kg至约0.4mg/kg、约0.4mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约50mg/kg、约50mg/kg至约100mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每日施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以一周至少约1x、2x、3x、4x、5x、6x、或7x(即每日)中任一者施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每周施用且没有中断；每周(三周中有两周)；每周(四周中有三周)；每两周一次；每3周一次；每4周一次；每6周一次；每8周、每月、或每二至12个月一次。在一些实施方案中，各施用之间的间隔少于约下列中任一者：6个月、3个月、1个月、20天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天。在一些实施方案中，各施用之间的间隔多于约下列中任一者：1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、或12个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是每3个月施用一次。在一些实施方案中，给药时程没有中断。在一些实施方案中，各施用之间的间隔不多于约一周。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与肿瘤抗原特异性t细胞相同的给药时程施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是以与肿瘤抗原特异性t细胞不同的给药时程施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是在每个肿瘤抗原特异性t细胞治疗周期中施用。例如，每个肿瘤抗原特异性t细胞治疗周期可施用免疫检查点抑制剂约1、2、3、4、5、6、或更多次中的任一者。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂并未在每个肿瘤抗原特异性t细胞治疗周期中施用。例如，免疫检查点抑制剂可约每1、2、3、4、5、或更多个肿瘤抗原特异性t细胞治疗周期施用一次。可在延长时段(诸如约一个月到至多约七年)内施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，在至少约下列中任一者的期间内施用免疫检查点抑制剂：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72、或84个月。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是单次施用。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，重复施用免疫检查点抑制剂直到疾病进展。先前的免疫疗法在一些实施方案中，本文所述的治疗方法特别适用于先前已接受免疫疗法的个体。在一些实施方案中，个体对免疫疗法有免疫反应。“有免疫反应(immunologicallyresponsive)”意指免疫疗法已触发个体中对癌症或癌症相关病毒的特异性免疫反应。在一些实施方案中，个体对免疫疗法具有临床反应，例如完全反应、部分反应、或疾病稳定。在一些实施方案中，个体已在接受免疫疗法后复发。在一些实施方案中，该免疫疗法是选自：免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、和其组合。因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)可选地施用有效量的抗原负载dc；以及(b)向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过以上在第ii节中所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备，且其中该个体先前已接受免疫疗法(诸如免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、和其组合)。在一些实施方案中，个体对免疫疗法有免疫反应。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)针对该方法选择先前已接受免疫疗法(诸如免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、或其组合)的个体；(b)可选地施用有效量的抗原负载dc；以及(c)向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过以上在第ii节中所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，个体对免疫疗法有免疫反应。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)可选地施用有效量的抗原负载dc；以及(b)向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过以上在第ii节中所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备，且其中基于先前已接受免疫疗法(诸如免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、或其组合)来选择该个体以进行治疗。在一些实施方案中，个体对免疫疗法有免疫反应。在一些实施方案中，个体先前未接受免疫疗法。在一些实施方案中，个体能够发展出对肿瘤抗原的抗原特异性免疫反应。可使用所属
技术领域：
：中任何已知的方法，例如通过测量经过个体肿瘤抗原肽刺激后来自t细胞(或pbmc)的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶b)、或细胞因子释放(诸如ifnγ或tnfα)的水平，判定对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用基于抗体的测定法(诸如elispot)来定量细胞毒性因子、或细胞因子(诸如ifnγ)水平。能够发展出对肿瘤抗原的抗原特异性免疫反应的个体先前可能已接受或可能未接受免疫疗法。因此，在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)可选地施用有效量的抗原负载dc；以及(b)向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过以上在第ii节中所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备，且其中基于elispot测定，该个体能够发展出对肿瘤抗原的抗原特异性免疫反应，该elispot测定使用该肿瘤抗原和来自该个体的pbmc样本。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)使用肿瘤抗原和来自该个体的pbmc样本来执行elispot测定；(b)如果elispot测定指示该个体能够发展出对该肿瘤抗原的抗原特异性免疫反应，则针对该方法选择个体；(c)可选地施用有效量的载有衍生自该肿瘤抗原的一种或多种肿瘤抗原肽的dc；以及(d)向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过以上在第ii节中所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备。在一些实施方案中，提供一种治疗个体中癌症的方法，其包括：(a)可选地施用有效量的抗原负载dc；以及(b)向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过以上在第ii节中所述的制备肿瘤抗原特异性t细胞的方法中任一者制备，且其中基于elispot测定来选择该个体以进行治疗，该elispot测定使用肿瘤抗原和来自该个体的pbmc样本，并指示该个体能够发展出对该肿瘤抗原的抗原特异性免疫反应。治疗后监测任何本文所述的治疗方法和masct方法可进一步包括在个体接受治疗之后的监测步骤。治疗后监测可有利于调整个体的治疗方案，以优化治疗成果。例如，可基于个体对多种肿瘤抗原肽的各自的特异性免疫反应、和/或个体对肿瘤抗原特异性t细胞的临床反应，调整或定制本文所述的多种肿瘤抗原肽，以提供多种定制肿瘤抗原肽，其可用于重复治疗。在一些实施方案中，可自用于未来制备经脉冲dc或肿瘤抗原特异性t细胞的抗原肽池，移除不会引发强烈特异性免疫反应的肿瘤抗原肽。可使用所属
技术领域：
：中任何已知的方法，例如通过测量经过个体肿瘤抗原肽刺激后来自t细胞(或pbmc)的细胞毒性因子(诸如穿孔素或颗粒酶b)、或细胞因子释放(诸如ifnγ或tnfα)的水平，判定对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。可使用基于抗体的测定法(诸如elispot)来定量细胞毒性因子、或细胞因子(诸如ifnγ)水平。在一些实施方案中，将响应于肿瘤抗原肽的来自t细胞(或pbmc)的细胞因子(诸如ifnγ)释放水平标准化至参考物(诸如基线细胞因子释放水平、或响应于不相关肽的来自t细胞(或pbmc)的非特异性细胞因子释放水平)，以提供细胞因子(诸如ifnγ)倍数变化值。在一些实施方案中，在elispot测定中，大于约1.2、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、或更多中任一者的细胞因子(诸如ifnγ)倍数变化值指示对肿瘤抗原肽的强烈特异性免疫反应。在一些实施方案中，将在elispot测定中细胞因子(诸如ifnγ)倍数变化值小于约10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5、1.2、或更小中任一者的肿瘤抗原肽自该多种肿瘤抗原肽移除，以提供多种用于未来治疗的定制肿瘤抗原肽。可由医师利用所属
技术领域：
：中已知的方法，诸如利用成像方法、血液测试、生物标记评估、和活检，评估个体对本文所述治疗方法的临床反应。在一些实施方案中，通过判定个体在接受肿瘤抗原特异性t细胞之前和之后的循环肿瘤细胞(ctc)数目，监测临床反应。在一些实施方案中，ctc已自原发性肿瘤剥离并在体液中循环。在一些实施方案中，ctc已自原发性肿瘤剥离并在血流中循环。在一些实施方案中，ctc是转移的指示。ctc数目可通过所属
技术领域：
：中已知的各种方法判定，此类方法包括但不限于cellsearch方法、epicscience方法、isoflux、和maintrac。在一些实施方案中，判定在个体血液样本中的单ctc(包括ctc的特异性亚型)数目。在一些实施方案中，当个体在接受治疗后每ml血液样本的单ctc数目多于约10、20、50、100、150、200、300、或更多中任一者时，其指示转移的风险增加、和/或对治疗方法的临床反应不佳。在一些实施方案中，相较于接受治疗之前，个体在接受治疗后的单ctc数目增加(诸如增加至少约1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示对治疗方法的临床反应不佳。在一些实施方案中，判定在个体血液样本中的ctc团簇数目。在一些实施方案中，当个体在接受治疗后的血液样本中检测到至少约1、5、10、50、100、或更多个中任一者的ctc团簇时，其指示转移的风险增加、和/或对治疗的临床反应不佳。在一些实施方案中，相较于接受治疗之前，个体在接受治疗后的ctc团簇数目增加(诸如增加至少约1.5、2、3、4、5、10、或更多倍中任一者)指示对治疗的临床反应不佳。v.组合物、试剂盒、和制品本专利申请进一步提供试剂盒、组合物(诸如药物组合物)、和制品，其是用于本文所述的治疗方法和肿瘤抗原特异性t细胞制备方法的任何实施方案。在一些实施方案中，提供一种用于癌症免疫疗法的试剂盒，其包括至少10种肿瘤抗原肽。所属领域技术人员可使用来自第一核心组的肿瘤抗原肽的任何组合、和可选地来自第二组的癌症类型特异性抗原肽的任何组合、和/或新抗原肽以负载dc群，其可进一步用于制备有用于治疗个体中癌症的肿瘤抗原特异性t细胞。试剂盒可含有附加组分，诸如容器、试剂、培养基、细胞因子、免疫检查点抑制剂、tlr激动剂、缓冲液、抗体等，以促进执行本文所述的治疗方法或细胞制备方法的任何实施方案。例如，在一些实施方案中，试剂盒进一步包括周边血液收集和储存设备，其可用于收集个体的周边血液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括容器和试剂，其用于周边血液的密度梯度离心，其可用于自人类周边血液样本分离pbmc。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括培养基、细胞因子、或缓冲液，其用于自周边血液获得dc。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括培养基、tlr激动剂(例如，mpla)、ifnγ、pge2、试剂、和缓冲液，其用于使多种肿瘤抗原肽负载至dc中。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括细胞因子(例如，il-2、il-7、il-15、和il-21)、免疫检查点抑制剂(例如，抗pd1抗体)、抗cd3抗体、缓冲液、或培养基，其用于将t细胞、经富集的活化t细胞、或肿瘤抗原特异性t细胞与抗原负载apc(例如，dc)共培养。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括抗体、磁珠、和管柱，其用于富集表达细胞因子(例如，ifnγ)的活化t细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括容器、缓冲液、和试剂，其用于冷冻并储存肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括试剂，其用于判定癌细胞中的突变负荷(诸如在一个或多个mhc基因中)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括免疫检查点抑制剂，其用于与治疗方法的组合疗法。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括试剂，其用于识别肿瘤样本中的新抗原(诸如通过定序)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括elispot测定，其用于评估对一种或多种肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。本专利申请的试剂盒在合适包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软质包装(例如，聚酯树脂(mylar)或塑料袋)等。试剂盒可选地提供附加组分，诸如缓冲液和解释性信息。因此，本专利申请还提供制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶、罐、软质包装等。说明书也可包括与使用肿瘤抗原肽(和上述可选地附加组分)有关的说明。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括说明手册，诸如描述下列的规程的手册：如本文所述的治疗方法的实施方案、或细胞制备方法的实施方案。说明书也可包括有关剂量、给药时程、和施用途径的信息，其涉及使用试剂盒制备的dc和/或肿瘤抗原特异性t细胞，以用于预期治疗。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于针对治疗方法选择个体的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于判定癌细胞突变负荷、和/或判定个体中新抗原数目的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于施用与治疗方法组合的免疫检查点抑制剂的说明书，其包括例如有关免疫检查点抑制剂的剂量、给药时程、和施用途径的信息。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于识别肿瘤样本中的新抗原(诸如通过定序)的说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括关于在接受治疗后监测个体的说明书。容器可为单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)、或次单位剂量。例如，可提供含有足够肿瘤抗原肽(如本文所公开)的试剂盒，以制备足够的肿瘤抗原特异性t细胞、和/或抗原负载apc(诸如dc)，以提供一段延长时段的个体有效治疗，该延长时段诸如3周、6周、9周、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、1年、或更长中任一者。试剂盒也可包括多单位剂量的肿瘤抗原肽和使用说明书，且以足以储存于和使用于药房(例如，医院药房、和调制药房)的数量进行包装。进一步提供的是本文所述的分离细胞群(诸如dc、或肿瘤抗原特异性t细胞)中任一者的试剂盒、组合物(诸如药物组合物)、和制品。本文所述的分离细胞群可用于药物组合物或制剂中，其通过组合所述分离细胞群与医药上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、和/或其他药剂(其是所属
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：中已知者)，以用于本文所述的治疗方法、施用方法、和剂量方案。在一些实施方案中，人类白蛋白是用于作为医药上可接受的载剂。合适的医药载剂包括无菌水；盐水、右旋糖；于水或盐水中的右旋糖；蓖麻油和环氧乙烷的缩合产物(每摩尔蓖麻油组合约30至约35摩尔环氧乙烷)；液体酸；低级烷醇；油，诸如玉米油；花生油、芝麻油等，与乳化剂，诸如脂肪酸的单或二甘油酯、或磷脂质(例如，卵磷脂)等；二醇；聚烯烃二醇；在悬浮剂存在下的水性介质，例如羧甲基纤维素钠；藻酸钠；聚(乙烯基吡咯烷酮)；以及类似者，其是单独使用、或与合适的分配剂(诸如卵磷脂)；聚氧乙烯硬脂酸酯；以及类似者。载剂也可含有佐剂(诸如保持稳定剂、润湿剂、乳化剂等)与渗透增强剂。最终形式可为无菌，且也可能够易于通过注射装置(诸如空心针)。可通过适当选择溶剂或赋形剂，达到并维持适当黏度。本文所述的药物组合物可包括其他试剂、赋形剂、或稳定剂，以改善组合物的性质。合适的赋形剂和稀释剂的示例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、浆料、甲基纤维素、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、和矿物油。在一些实施方案中，将药物组合物配制成其ph在约4.5至约9.0的范围内，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中任一者的ph范围。在一些实施方案中，也可通过添加合适的张力调节剂(诸如甘油)，使药物组合物与血液等渗。在一些实施方案中，分离细胞组合物(诸如药物组合物)适用于向人类施用。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)适用于通过肠胃外施用向人类施用。适用于肠胃外施用的制剂包括：水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使制剂与预期受体的血液相容的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和保存剂。制剂可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)呈现，并可储存在仅需要紧接在使用前添加无菌液体赋形剂(即，水)以用于注射的条件下，该无菌液体赋形剂是用于本文所述的治疗方法、施用方法、和剂量方案。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是含在单次使用小瓶中，诸如单次使用密封小瓶。在一些实施方案中，各单次使用小瓶含有约109个肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，各单次使用小瓶所含有的肿瘤抗原特异性t细胞足以扩增为约109个肿瘤抗原特异性t细胞。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是含在多次使用小瓶中。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)是以批量含在容器中。还提供的是单位剂型，其包括本文所述的分离细胞组合物(诸如药物组合物)和制剂。这些单位剂型可以单一或多单位剂量储存于合适包装中，且也可经进一步灭菌和密封。在一些实施方案中，组合物(诸如药物组合物)还包括一种或多种有用于治疗癌症的其他化合物(或其医药上可接受的盐)。本专利申请进一步提供试剂盒，其包括本文所述的分离细胞群、组合物(诸如药物组合物)、制剂、单位剂量、和制品中任一者，以用于本文所述的治疗方法、施用方法、和剂量方案。本文所述的试剂盒包括一个或多个容器，该容器包括肿瘤抗原特异性t细胞。vi.示例性实施方案在本文所提供的实施方案中的是：1.一种制备肿瘤抗原特异性t细胞群的方法，该方法包括：a)第一共培养步骤，其包括将载有多种肿瘤抗原肽的第一树突细胞群与t细胞群共培养，以获得包含活化t细胞的第一共培养物；b)富集步骤，其包括使该第一共培养物经受富集过程，以获得经富集的活化t细胞群；以及c)第二共培养步骤，其包括将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的第二树突细胞群共培养，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。2.根据实施方案1所述的方法，其中该第一共培养步骤是在该富集步骤之前进行约1至约3天。3.根据实施方案1或2所述的方法，其中该t细胞群与载有该多种肿瘤抗原肽的该第一树突细胞群之间的比率不大于约30:1。4.根据实施方案1至3中任一者所述的方法，其中载有该多种肿瘤抗原肽的该第一树突细胞群与该t细胞群是在第一共培养基中共培养，该第一共培养基包含一种或多种细胞因子和免疫检查点抑制剂。5.根据实施方案4所述的方法，其中该第一共培养基包含il-2、il-7、il-15、和il-21、和抗pd-1抗体。6.根据实施方案4所述的方法，其中该第一共培养基包含il-2和抗pd-1抗体。7.根据实施方案1至6中任一者所述的方法，其中该富集步骤包括：使该第一共培养物与载有该多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(apc)接触，以获得经刺激的共培养物；以及使用配体自该经刺激的共培养物分离经富集的活化t细胞群，该配体特异性识别细胞因子。8.根据实施方案7所述的方法，其中该细胞因子是ifnγ。9.根据实施方案1至8中任一者所述的方法，其中该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二树突细胞群之间的比率为约1:1至约20:1。10.根据实施方案1至9中任一者所述的方法，其中将该经富集的活化t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二树突细胞群共培养约12至25天。11.根据实施方案1至10中任一者所述的方法，其中该第二共培养步骤包括：在初始第二共培养基中将载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二树突细胞群与该经富集的活化t细胞群共培养，以提供第二共培养物，该初始第二共培养基包含免疫检查点抑制剂和可选地一种或多种细胞因子；以及将抗cd3抗体添加至该第二共培养物，以获得肿瘤抗原特异性t细胞群。12.根据实施方案11所述的方法，其中在该第二共培养步骤开始后不多于约3天，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。13.根据实施方案12所述的方法，其中在该第二共培养步骤开始后约2天，将该抗cd3抗体添加至该第二共培养物。14.根据实施方案11至13中任一者所述的方法，其中该抗cd3抗体是okt3。15.根据实施方案11至14中任一者所述的方法，其中该第二共培养步骤包括将一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。16.根据实施方案15所述的方法，其中该一种或多种细胞因子包括il-2。17.根据实施方案15或16所述的方法，其中在该第二共培养步骤开始后不多于约3天(例如，约2天)，将该一种或多种细胞因子添加至该第二共培养物。18.根据实施方案11至17中任一者所述的方法，其中该初始第二共培养基包含il-2和抗pd-1抗体。19.根据实施方案11至18中任一者所述的方法，其中该初始第二共培养基包含il-2、il-7、il-15、和il-21、和抗pd-1抗体。20.根据实施方案1至19中任一者所述的方法，其进一步包括第三共培养步骤，该第三共培养步骤包括将此类肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的抗原递呈细胞(apc)群共培养，以获得第二肿瘤抗原特异性t细胞群。21.根据实施方案20所述的方法，其中此类apc是pbmc或树突细胞。22.根据实施方案20或21所述的方法，其中该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc群之间的比率为约1:1至约20:1。23.根据实施方案20至22中任一者所述的方法，其中将该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc群共培养约5至9天。24.根据实施方案20至23中任一者所述的方法，其中该肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的apc群是在第三共培养基中共培养，该第三共培养基包含一种或多种细胞因子和抗cd3抗体。25.根据实施方案24所述的方法，其中该第三共培养基包含il-2和okt3。26.根据实施方案25所述的方法，其中该第三共培养基包含il-2、il-7、il-15、和okt3。27.根据实施方案20至26中任一者所述的方法，重复该第三共培养步骤。28.根据实施方案20至27中任一者所述的方法，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞群是获自此类肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液。29.根据实施方案1至28中任一者所述的方法，其中该第一共培养步骤进一步包括使树突细胞群与多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有该多种肿瘤抗原肽的该第一树突细胞群，和/或该第二共培养步骤进一步包括使树突细胞群与来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽接触，以获得载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二树突细胞群。30.根据实施方案29所述的方法，其中该第一共培养步骤进一步包括在dc成熟培养基中培养载有该多种肿瘤抗原肽的该第一树突细胞群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂，和/或该第二共培养步骤进一步包括在dc成熟培养基中培养载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的该第二树突细胞群，该dc成熟培养基包含toll样受体(tlr)激动剂。31.根据实施方案30所述的方法，其中该dc成熟培养基包含infγ、mpla、和pge2。32.根据实施方案29至31中任一者所述的方法，其中通过诱导来自pbmc的单核细胞群分化来获得该树突细胞群。33.根据实施方案1至32中任一者所述的方法，其中在该第一共培养步骤中的该t细胞群存在于pbmc群中。34.根据实施方案29至33中任一者所述的方法，其中该树突细胞群和该t细胞群是获自相同个体。35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中该多种肿瘤抗原肽包括新抗原肽，可选地其中该多种肿瘤抗原肽是由新抗原肽组成。36.根据实施方案1至35中任一者所述的方法，其中该多种肿瘤抗原肽是多种合成肿瘤抗原肽。37.根据实施方案1至36中任一者所述的方法，其中该多种肿瘤抗原肽不是获自细胞样本。38.一种分离细胞群，其是使用根据实施方案1至37中任一者所述的方法制备。39.根据实施方案38所述的分离细胞群，其包含至少约3％的经来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽刺激时分泌inf-γ的肿瘤抗原特异性t细胞。40.根据实施方案38或39所述的分离细胞群，其包含至少约3％的经来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽刺激时分泌tnf-α的肿瘤抗原特异性t细胞。41.一种治疗个体中癌症的方法，其包括向该个体施用有效量的肿瘤抗原特异性t细胞，此类肿瘤抗原特异性t细胞是通过根据实施方案1至37中任一者所述的方法制备。42.根据实施方案41所述的方法，其进一步包括：冷冻此类肿瘤抗原特异性t细胞群，以获得冷冻储备液；将来自该冷冻储备液的经解冻的肿瘤抗原特异性t细胞群与载有来自该多种肿瘤抗原肽的一种或多种肿瘤抗原肽的树突细胞群共培养，以提供第二肿瘤抗原特异性t细胞群；以及施用有效量的该第二肿瘤抗原特异性t细胞群。43.根据实施方案41或42所述的方法，其中此类肿瘤抗原特异性t细胞经静脉内施用。44.根据实施方案41至43中任一者所述的方法，其中该个体是人类个体。45.根据实施方案44所述的方法，其中该个体先前已接受免疫疗法。46.根据实施方案45所述的方法，其中该个体对该免疫疗法有免疫反应。47.根据实施方案45或46所述的方法，其中该免疫疗法是选自：免疫检查点抑制剂、过继免疫细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、和其组合。48.根据实施方案47所述的方法，其中该个体能够发展出对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应。49.根据实施方案47或48所述的方法，其中该个体已在临床上受益于多抗原刺激细胞疗法(masct)，该masct包括向该个体施用有效量的活化t细胞，此类活化t细胞是通过将t细胞群与载有该多种肿瘤抗原的树突细胞群共培养而制备。实施例以下实施例旨在纯粹为本专利申请的示例，因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明是以说明方式而非限制方式提供。实施例1：经masct治疗的患者对肿瘤抗原肽的特异性免疫反应患者wj，女性，于41岁时经诊断出患有子宫颈癌并有血管侵犯，且人类乳突病毒(hpv)dna测试结果呈阳性。她经历了根除性切除，和五个月的放化疗。患者接受了第二次hpvdna测试，且经确认血清hpvdna呈阴性。将此患者的临床病史和反应汇总于图1中。在根除性切除和放化疗后约两年，根据磁共振成像(mri)和发射计算机断层扫描(ect)，该患者经诊断出右骶髂关节骨上有转移肿瘤。然后，患者接受十次局部放射疗法治疗，随后进行三次masct治疗(每个月施用一次)。该masct治疗使用来自患者自身周边血液的pbmc，以制备经18种抗原肽的池脉冲的树突细胞，此类抗原肽包括核心组的12种肿瘤相关抗原肽、以及子宫颈癌特异性组的6种衍生自hpv的病毒蛋白的抗原肽。简言的，将来自患者pbmc的单核细胞分化为未成熟dc，然后用多种合成肽抗原脉冲，此类合成肽抗原包括肿瘤相关抗原和hpv抗原。利用tlr配体进一步刺激未成熟dc以分化为成熟dc(mdc)。一半的mdc经皮下注射至患者。通过用抗cd3抗体(例如，okt3)和il2来培养非黏附pbmc，制备维持t细胞。将另一半的mdc在输注前与维持t细胞再共培养7至9天。该患者经确认具有hla-a2血清型(hla-a0201+)。在四次masct治疗后，患者的ect结果显示右骶髂关节骨转移减少，且未检测出新的转移，其指示masct的正向治疗成果。患者接受四次附加的masct治疗，以约1个月或2个月的间隔进行施用。在总共8次masct治疗之后，获得患者pbmc样本，并以elispot测定对该样本进行测试，以判定患者是否具有对抗原肽池和该池内抗原肽的各自的治疗有效mhc限制性t细胞反应。elispot结果展示对下列的增强t细胞反应：子宫颈癌抗原肽池；以及个别抗原肽，其是在核心组肿瘤特异性抗原肽(诸如htert、p53、cea、和rgs5)和子宫颈癌特异性组肿瘤抗原肽(诸如hpv-3和hpv-5)两者内。患者在总共8次masct后的ect显示，右骶髂关节骨转移进一步减少，且无新转移部位，其指示masct治疗方案成功减少患者的肿瘤负担并预防肿瘤进展和进一步转移。基于患者的特异性免疫反应，通过保存已诱导特异性反应的反应性肽，并移除未诱导特异性反应的非反应性肽，来定制抗原肽池以提供患者特异性抗原肽池。该患者进一步经四个周期的masct治疗，该masct是使用患者特异性抗原肽池制备(在本文中称为“精确masct”)。在四次精确masct之后，患者的ect显示没有右骶髂关节骨转移的发展，且无新转移部位。基于患者的特异性免疫反应，进一步调整抗原肽池，且患者经四个周期的第2次精确masct(使用经进一步调整的肽抗原池)治疗。在第二次四个周期的精确masct之后，患者经评估为具有疾病稳定(sd)。如elispot测定所展示，患者特异性抗原肽池引发增强的特异性反应(图2a)。具体而言，hpv18-e7肽、cea肽、和rgs5肽一致产生最强烈的特异性反应(图2b)。实施例2：自经masct治疗的患者的pbmc制备肿瘤抗原特异性t细胞获得来自实施例1患者的pbmc样本，并将其用于作为起始材料以制备此实施例中的肿瘤抗原特异性t细胞。细胞制备图3提供此实施例中所使用的规程的概述。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自cea、rgs5、和hpv18-e7(1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第8天，以约20:1的t细胞与成熟抗原负载dc之间的比率，将含有t细胞的pbmc与抗原负载成熟dc共培养，且共培养基含有细胞因子混合物和抗pd-1抗体。在第13天，将抗cd3抗体添加至共培养物。在第20天，利用经肽池脉冲的pbmc来刺激共培养物。在第21天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以分离ifnγ+t细胞群。在第22天，在含有细胞因子混合物、抗pd-1抗体、和抗cd3抗体的培养基中，以约2:1的t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养(自第22天至第31至35天)，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。增殖测定使用来自第1天(pbmc)、第8天(共培养开始)、第21天(在ifnγ富集前以及在ifnγ富集后)、和第27、29、31、34、和35天(ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。将各样本中的细胞数目计数。如图4所示，抗原负载成熟dc与t细胞的初始共培养物产生少量ifnγ+t细胞(第21天)。在经富集的ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc的共培养物中，细胞数目持续增加直到第34天为止，即该共培养物中的细胞总数在约2×107个而趋于稳定的时间点。肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产将各种共培养样本各自接种(t细胞：1×106个细胞/孔；pbmc：2.5×105个细胞/孔)于aim-v培养基中，并用2μg/ml的肽池刺激4小时。利用细胞内细胞因子染色和facs分析，检测各样本中的肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。将与10μg/ml不相关肽培养的细胞样本用于作为阴性对照。用于细胞表面(例如，抗人类cd3-fitc)或细胞内细胞因子(例如，抗人类ifnγ-apc)染色的抗体是获自bdbiosciences。利用cytofix/cytoperm(bdbiosciences)固定并渗透细胞，来执行细胞内细胞因子染色。使用facscantoii(bdbiosciences)流动式细胞仪执行流式细胞术，并利用flowjo程序分析数据。图5显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比达到90.6％。然而，在第31天，共培养物含有约22.3％的响应于肿瘤抗原肽池的刺激的肿瘤抗原特异性t细胞。在第35天，共培养物含有约17.5％的响应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。响应于不相关肽刺激而生产ifnγ的非特异性t细胞仅分别构成1.73％和3.48％的第31和35天的共培养物。实施例3：自经masct治疗的患者的pbmc制备肿瘤抗原特异性t细胞获得来自实施例1患者的pbmc样本，并将其用于作为起始材料以制备此实施例中的肿瘤抗原特异性t细胞。方法2细胞制备图6提供示例性“方法2”的规程概述。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自cea、rgs5、和hpv18-e7(1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第8天，以约15:1的t细胞与成熟抗原负载dc之间的比率，将含有t细胞的pbmc与抗原负载成熟dc共培养，且共培养基含有细胞因子混合物和抗pd-1抗体。在第11天，利用经肽池脉冲的pbmc来刺激共培养物。在第12天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以分离ifnγ+t细胞群。在第12天，在含有细胞因子混合物、抗pd-1抗体、和抗cd3抗体的培养基中，以约2:1的t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养(自第12天至第25至35天)，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。增殖测定通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(pbmc)、第8天(共培养开始)、第11天(在ifnγ富集前以及在ifnγ富集后)、和第17、21、25、27、31、和32天(ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图7所示，抗原负载成熟dc与t细胞的初始共培养物产生少量ifnγ+t细胞(第11天)。在经富集的ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第31天为止，即该共培养物中的细胞总数在多于108个而趋于稳定的时间点。肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图8a至图8b显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比达到83.5％。自第21天至第32天，共培养物含有约10％的响应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。在第25至32天的共培养物中，响应于不相关肽刺激而生产ifnγ的非特异性t细胞构成不到1％。方法2的优化(“方法2m”)细胞制备图9提供示例性“方法2m”的规程概述。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自cea、rgs5、和hpv18-e7(1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第8天，以约20:1的t细胞与成熟抗原负载dc之间的比率，将含有t细胞的pbmc与抗原负载成熟dc共培养，且共培养基含有细胞因子混合物和抗pd-1抗体。在第11天，利用经肽池脉冲的pbmc来刺激共培养物。在第12天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以分离ifnγ+t细胞群。同时，将抗原负载成熟dc培养于dc成熟培养基中。在第12天，以约1:1的t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养于培养基中，该培养基含有细胞因子混合物、抗pd-1抗体。在第13天或第14天，将抗cd3抗体(okt3)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第30天，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。增殖测定通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(pbmc)、第9天(共培养开始)、第12天(在ifnγ富集前)、第12天(在ifnγ富集后)、和第22和30天(ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图10所示，抗原负载成熟dc与t细胞的初始共培养物产生少量ifnγ+t细胞(第12天)。在经富集的ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第31天为止。在第14天添加抗cd3抗体的方法导致较高的细胞增殖水平。肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图11a至图11b显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比达到90.4％。自第22天至第30天，共培养物含有约6至10％的响应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。在第14天添加抗cd3抗体的方法产生较高百分比的ifnγ+cd3+细胞。通过评估ifnγ+tnfα+细胞，获得一致结果(图11c)。方法2m的优化细胞制备图12提供示例性“方法2m”的规程概述。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自cea、rgs5、和hpv18-e7(1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第9天，以约20:1的t细胞与成熟抗原负载dc之间的比率，将含有t细胞的pbmc与抗原负载成熟dc共培养，且共培养基含有细胞因子混合物和抗pd-1抗体。在第11天，利用经肽池脉冲的pbmc来刺激共培养物。在第12天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以分离ifnγ+t细胞群。同时，将抗原负载成熟dc培养于dc成熟培养基中。在第12天，以约1:1的t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养于培养基中，该培养基含有细胞因子混合物、抗pd-1抗体。在第13、14、或15天，将抗cd3抗体(okt3)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第30天，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。增殖测定通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(pbmc)、第9天(共培养开始)、第12天(在ifnγ富集前)、第12天(在ifnγ富集后)、和第19和31天(ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图13所示，抗原负载成熟dc与t细胞的初始共培养物产生少量ifnγ+t细胞(第12天)。在经富集的ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第31天为止。在第14天添加抗cd3抗体的方法导致最高的细胞增殖水平。肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图14a至图14c显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比达到77.4％。在第14天添加抗cd3抗体的方法产生最高的ifnγ+cd3+细胞百分比。细胞因子混合物与il-2和抗原肽池与单一抗原肽的比较细胞制备图24提供比较下列的规程概述：添加细胞因子混合物与添加单独il-2、和经载有抗原肽池的dc刺激与经单一抗原肽刺激。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自cea、rgs5、和hpv18-e7(1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第9天，以约15:1至约20:1的t细胞与成熟抗原负载dc之间的比率，将含有t细胞的pbmc与抗原负载成熟dc共培养，且共培养基含有细胞因子混合物或il-2(不大于约200iu/ml)和抗pd-1抗体。在第11天，利用经肽池或各个个别肽脉冲的pbmc来刺激共培养物。在第12天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以分离ifnγ+t细胞群。同时，将抗原负载成熟dc培养于dc成熟培养基中。以约1:1至约3:1的t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养于培养基中，该培养基含有在第12天添加的细胞因子混合物或在第14天添加的单独il-2(以至少约2000iu/ml)、和抗pd-1抗体。在第14天，将抗cd3抗体(okt3)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第29至30天，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。肿瘤抗原特异性t细胞的增殖测定和ifnγ生产通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(pbmc)、第9天(共培养开始)、第12天(在ifnγ富集前)、第12天(在ifnγ富集后)、和第19、24、和29天(ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图25a所示，抗原负载成熟dc与t细胞的初始共培养物产生少量ifnγ+t细胞(第12天)。在经富集的ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第29天为止。通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。如图25b所示，在第9天将细胞因子混合物或仅il-2添加至共培养物，并在第12天的富集步骤之后，获得类似百分比的ifnγ+t细胞。下表1比较在第19天(测试1)和第29天(测试2)的细胞样本中的肿瘤特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池或个别抗原肽的刺激的ifnγ+cd3+细胞和ifnγ+tnfα+细胞而判定。在第9天添加细胞因子混合物或单独il-2、和与以肿瘤抗原池或单一肿瘤抗原脉冲的dc共培养的规程在t细胞增殖和肿瘤特异性t细胞百分比方面产生类似的结果。表1：细胞样本中的肿瘤特异性t细胞的百分比。a：刺激/测试条件b：培养条件图26a至图26b比较使用在第9天以及第12天添加il-2或细胞因子混合物的规程的各种共培养样本中的t细胞数目和肿瘤抗原特异性t细胞百分比。在第9天添加il-2、与在第12天以肿瘤抗原肽池脉冲的dc共培养、和在第14天添加il-2的规程在第19和29天产生最高的肿瘤抗原特异性t细胞百分比。实施例4：自经masct治疗的患者的pbmc制备肿瘤抗原特异性t细胞使用来自实施例1患者的pbmc冷冻储备液作为起始材料，以制备此实施例中的肿瘤抗原特异性t细胞。在此实施例中，可使用新鲜pbmc代替冷冻pbmc。细胞制备图15提供此实施例中所使用的规程的概述。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括三种衍生自cea、rgs5、和hpv18-e7(1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第8天，用肽池刺激pbmc。在第9天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以自经刺激pbmc分离ifnγ+t细胞群。在第9天，以约1:1的t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养于培养基中，该培养基含有细胞因子混合物和抗pd-1抗体。在第10天或第11天，将抗cd3抗体(okt3)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第15至30天，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。增殖测定通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(pbmc)、第9天(在ifnγ富集前以及在ifnγ富集后)、和第19、27、和28天(ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图16所示，抗原负载成熟dc与t细胞的初始共培养物产生少量ifnγ+t细胞(第9天)。在经富集的ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc的共培养物中，细胞数目持续快速增加直到第28天为止，即该共培养物中的细胞总数在多于107个而趋于稳定的时间点。肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图17a至图17b显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。在富集步骤后，细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比达到91.4％。其中在第10天添加抗cd3抗体的共培养物在第27天产生最高的ifnγ+cd3+细胞百分比。通过评估ifnγ+tnfα+细胞，获得一致结果(图17c)。实施例5：自肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液制备肿瘤抗原特异性t细胞使用方法2制备的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液是用于此实施例中，以制备进一步的肿瘤特异性t细胞群。细胞制备图18提供此实施例中所使用的规程的概述。简言的，将含有使用实施例3所述的方法2在第32天的肿瘤抗原特异性t细胞的共培养物样本冷冻，以提供肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液。在此实验的第1天，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液样本解冻，并在共培养基中将其与新鲜制备的抗原负载成熟dc共培养直到第12天为止，该共培养基包含细胞因子的混合物、抗pd-1抗体、和抗cd3抗体。肿瘤抗原特异性t细胞与抗原负载成熟dc之间的比率为约10:1。增殖测定通过实施例2所述的方法，使用来自第1、4、7、10、和12天的共培养物的细胞样本来评估细胞增殖。如图19所示，当将经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载成熟dc共培养时，细胞持续增殖(“经刺激”曲线)，而在未经抗原负载成熟dc刺激的经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群中，并未观察到细胞增殖(“未经刺激”曲线)。在共培养的第12天，细胞总数超过约108个。肿瘤抗原特异性t细胞的细胞因子生产通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图20a显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。自第7天至第12天，共培养物含有约10％的响应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。响应于不相关肽刺激而生产ifnγ的非特异性t细胞仅构成约1.21％的第12天的共培养物。图20b显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池的刺激的tnf-α+ifnγ+细胞而判定。结果与基于ifnγ+cd3+细胞的测量一致。在第10天，共培养物含有约9.04％的响应于肿瘤抗原肽池的刺激而生产tnf-α和ifnγ两者的肿瘤抗原特异性t细胞。在第10天，响应于不相关肽刺激而生产tnf-α和ifnγ两者的非特异性t细胞构成约2.68％。实施例6：自肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液制备肿瘤抗原特异性t细胞使用方法2或方法2m制备的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液是用于此实施例中，以制备进一步的肿瘤抗原特异性t细胞群。细胞制备图21a至图21b提供此实施例中所使用的规程的概述。简言的，将含有下列的共培养物样本冷冻，以提供肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液：使用实施例3所述的方法2在第32天的肿瘤抗原特异性t细胞、或方法2m在第30天的肿瘤抗原特异性t细胞。在此实验的第1天，将肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液样本解冻，并将其与载有rgs5-olp5(1μg/ml)的lcl细胞(apc细胞系)在具有或不具有喂养细胞下共培养于共培养基中直到第9天为止，该共培养基包含细胞因子(il-2、il-7、il-15)的混合物、抗cd3抗体(okt-3)、和rgs5-olp5。肿瘤抗原特异性t细胞与抗原负载lcl细胞之间的比率为约4:1。肿瘤抗原特异性t细胞、喂养细胞、和抗原负载lcl细胞之间的比率为约4:4:1。在第9天以及第16天，通过将肿瘤抗原特异性t细胞与抗原负载lcl细胞，在喂养细胞存在或不存在下共培养，以重复周期。pbmc和树突细胞可用于代替lcl细胞，以提供抗原负载apc。apc可载有单一肿瘤抗原肽、单一肿瘤抗原肽的表位片段、肿瘤抗原肽池、或肿瘤抗原肽的表位片段池。增殖测定通过实施例2所述的方法，使用来自第1、9、16、和23天的共培养物的细胞样本来评估细胞增殖。如图22所示，当将经解冻的冷冻肿瘤抗原特异性t细胞群与抗原负载lcl细胞在具有或不具有喂养细胞下共培养时，细胞持续增殖直到第16天为止。总细胞数在第23天减少。肿瘤抗原特异性t细胞的细胞因子生产通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图23a显示在细胞样本中的肿瘤抗原特异性t细胞百分比，如通过评估响应于rgs5-olp5肽的刺激的ifnγ+cd3+细胞而判定。在第16天，自使用方法2m的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液衍生的共培养物含有约38.6％的响应于rgs5-olp5肽的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。值得注意的是，在第23天，自使用方法2m的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液衍生的共培养物含有约53.8％的响应于rgs5-olp5肽的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。自使用方法2的肿瘤抗原特异性t细胞的冷冻储备液衍生的共培养物产生较低百分比的响应于第16天以及第23天rgs5-olp5肽的刺激而生产ifnγ的肿瘤抗原特异性t细胞。通过评估ifnγ+tnfα+细胞，获得一致结果(图23b)。这些结果意味着，利用载有肿瘤抗原肽的apc重复刺激肿瘤抗原特异性t细胞，可提高对肿瘤抗原肽有特异性反应的t细胞百分比。实施例7：来自经masct治疗的患者的两轮式肿瘤特异性t细胞扩增患者smz经诊断出患有转移性肺癌，并接受了5个周期以活化t细胞进行的改良masct治疗(参见pct/cn2018/081338和pct/cn2019/080535)，此类活化t细胞是使用载有下列的dc制备：一般肿瘤抗原肽(htert、p53、存活素、ny-eso-1、cea、cdca1、vegfr1、vegfr2、rgs5、ccnd1、muc1、her2、magea1、magea3、wt-1)和新抗原肽(smx-1、smx-2、和smx-3)的池。图27之上图显示，在elispot测定中，在经过第5个周期的改良masct之后，患者的pbmc样本的抗原特异性t细胞反应。具体而言，四种肿瘤抗原htert、ccnd1、mage-a1、和wt-1诱导强烈的免疫反应。该患者随后经附加周期(周期6)的改良masct治疗。图27的下图显示，在elispot测定中，在经过第6个周期的改良masct之后，患者的pbmc样本的抗原特异性t细胞反应。在elispot测定中，使用来自对应于抗原htert、ccnd1、mage-a1、和wt-1的肿瘤抗原肽子池的各自的单一肽，来检测抗原特异性免疫反应，并识别免疫优势肿瘤抗原肽。肽htert-1和htert-2显示特别强烈的免疫反应。获得来自患者smz的pbmc样本，以使用两轮式规程制备肿瘤特异性t细胞。第1轮图28提供此实施例中所使用的第1轮肿瘤特异性t细胞制备的规程概述。简言的，在第1天，通过以lymphoprep(nycomedpharma,oslo,norway)进行的密度梯度离心，获得来自患者的周边血液单核细胞(pbmc)。继续将黏附单核细胞培养于aim-v培养基中以分化为未成熟树突细胞(dc)，该aim-v培养基具有1000u/mlgm-csf和500u/mlil-4。将所得未成熟dc以肽池进行脉冲，该肽池包括两种衍生自htert(即，htert1和htert2，1μg/ml/肽)的肿瘤抗原肽，然后培养于dc成熟培养基中以分化为成熟dc。在第8天，用肽池刺激pbmc。在第9天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以自经刺激pbmc分离ifnγ+t细胞群。在第9天，将ifnγ+t细胞与抗原负载成熟dc共培养于培养基中，该培养基含有il-2和抗pd-1抗体。在第11天，利用经肽池或各个个别肽脉冲的pbmc来刺激共培养物。在第12天，使用ifnγsecretionassay-cellenrichmentanddetectionkit(miltenyibiotec)，以分离ifnγ+t细胞群。同时，制备抗原负载成熟dc(“dc刺激”)或pbmc(“pbmc刺激”)，并将其与ifnγ+t细胞共培养。在第14天，将抗cd3抗体(okt3)和il-2(以至少约2000iu/ml)添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第31天，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(pbmc)、第9天(在ifnγ富集前)、第12天(在ifnγ富集后)、和第23、29、和30天(ifnγ+t细胞与抗原负载dc或pbmc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。如图29a所示，使用抗原负载dc或pbmc的规程产生类似的t细胞增殖结果。通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。图29b显示在富集步骤之后的各种t细胞群的百分比。图30a至图30e比较在第23和30天的细胞样本中的各种肿瘤特异性t细胞群的百分比，如通过评估响应于肿瘤抗原肽池或个别抗原肽的刺激的ifnγ+cd3+细胞、ifnγ+cd4+细胞、和ifnγ+tnfα+细胞而判定。与抗原负载dc的共培养物产生最高的肿瘤特异性t细胞百分比。如图30f所示，在第30天的样本中，98.6％的ifnγ+cd4+细胞是ccr7-cd45ro-效应t细胞。第2轮图31提供此实施例中所使用的第2轮肿瘤特异性t细胞制备的规程概述。简言的，在第1天，将来自第1轮的肿瘤特异性t细胞培养于培养基中，该培养基包含细胞因子混合物(il-2、il-7、和il-15)和抗pd-1抗体。制备载有htert-2肽的pbmc或成熟dc。以1:3、1:1、或3:1的t细胞与pbmc之间的比率，或者以3:1和1:1的t细胞与dc之间的比率，将肿瘤特异性t细胞与抗原负载dc或pbmc共培养。在第3天，将抗cd3抗体(okt3)和il-2添加至共培养物，将该共培养物继续培养至第8天，以获得肿瘤抗原特异性t细胞。通过实施例2所述的方法，使用来自第1天(第1轮肿瘤特性t细胞)、和第8天(ifnγ+t细胞与抗原负载dc或pbmc共培养)的细胞样本，评估细胞增殖。通过实施例2所述的方法，判定各种共培养样本中肿瘤抗原特异性t细胞的ifnγ生产水平。如图32a所示，与抗原负载dc的共培养物在第8天产生最高的t细胞数目和最高的肿瘤特异性t细胞百分比。图32b至图32c比较在第8天的细胞样本中的各种肿瘤特异性t细胞群的百分比，如通过评估响应于htert2抗原肽刺激的ifnγ+cd3+细胞和ifnγ+tnfα+细胞而判定。以3:1的dc与t细胞之间的比率的与抗原负载dc的共培养物产生最高的肿瘤特异性t细胞百分比。图33图显示在第1轮第1天以及第30天、和在第38天(即，第2轮第8天)的t细胞和肿瘤特异性t细胞数目。两轮式规程有效地扩增肿瘤特异性t细胞。相较于抗原负载pmbc的刺激，第2轮中抗原负载dc的刺激产生较高的t细胞数目和较高的肿瘤特异性t细胞百分比。在第1轮结束时获得的肿瘤特异性t细胞是效应t细胞。当前第1页12当前第1页12