未分化细胞检测法的制作方法

[0001]
本发明涉及未分化细胞检测法。


背景技术：

[0002]
从癌变风险的观点出发，检测、评价再生医疗中使用的分化细胞群体中未分化ips细胞的残余/混入是极其重要的。至今，对于检测、评价未分化ips细胞的残余/混入的办法，报告了基于定量pcr(qpcr)的ips细胞特异性的基因的检测法(非专利文献1)，基于将分化细胞利用未分化细胞的培养保持条件进行再培养的方法(非专利文献2)。
[0003]
在现有技术中，再培养法具有由于从混入的未分化ips细胞形成克隆，因此准确性高这样的优点，另一方面，到检测为止需要1周以上，因此，使用定量pcr的方法在能够简便、快速的实施方面较为优异。
[0004]
然而，存在如下课题：对于至今报告的lin28(非专利文献1)而言，存在低表达的内脏器官/组织的分化细胞(视网膜色素上皮细胞)，且另一方面，在肝细胞等分化细胞、从ips细胞诱导分化成的细胞中可以观察到表达，因此并不能在以各种分化细胞为对象的未分化ips细胞的残余/混入的检测中使用。
[0005]
现有技术文献
[0006]
非专利文献
[0007]
非专利文献1：plos one.201427；9(10)：e110496.
[0008]
非专利文献2：plos one.2012；7(5)：e37342.


技术实现要素：

[0009]
发明所要解决的问题
[0010]
本发明的目的在于提供即使在将除了视网膜色素上皮细胞以外的分化细胞作为对象的情况下，也能够检测未分化细胞的残余/混入的标记基因。
[0011]
解决问题的方法
[0012]
本发明人以各种分化细胞为对象，鉴定了能够普遍检测未分化ips细胞的残余/混入的标记基因。
[0013]
作为对标记基因的必要条件，基准如下：
[0014]
1.在未分化ips细胞中特异性表达。
[0015]
2.在除了未分化ips细胞以外的其它细胞谱系中的表达极低。
[0016]
仅上述而言仍不充分，另外再加上：
[0017]
3.为了达到在未分化ips细胞中极高表达、在分化细胞中极少数存在也能够检测的目标而言的必要条件。
[0018]
为此，作为在满足该基准的未分化ips细胞中高表达，在分化的内胚层细胞中表达为0.1％以下的基因，发现了esrg，sfrp2，vsnl1，thy1，spp1，usp44及cnmd(lect1)。通过使用这些基因，对于利用以往的指标曾不能够评价的内脏器官/组织的分化细胞，能够实现将
未分化ips细胞的残余/混入检测到0.005％。进一步，由于这些标记基因在向中胚层及外胚层分化的细胞中表达也为0.1％以下，因此认为它们为即使在内胚层，中胚层，外胚层的任一种分化细胞中也能够检测未分化ips细胞的残余/混入的标记。
[0019]
本发明的要点如下所述。
[0020]
(1)检测未分化细胞的方法，包括测定选自由以下组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性：分化细胞群体中的esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd。
[0021]
(2)根据(1)所述的方法，其中，未分化细胞为胚胎肿瘤细胞(ec细胞)，胚胎干细胞(es细胞)，人工多潜能干细胞(ips细胞)或胚胎生殖细胞(eg细胞)，分化细胞群体为从上述未分化细胞分化成的细胞的群体。
[0022]
(3)根据(1)或(2)中所述的方法，其中，分化细胞群体为内胚层，中胚层或外胚层中的任一种分化细胞的群体。
[0023]
(4)根据(3)所述的方法，其中，内胚层的分化细胞为肝内胚层细胞。
[0024]
(5)根据(3)所述的方法，其中，中胚层的分化细胞为横隔(septum transversum)间充质细胞，间充质细胞或血管内皮细胞。
[0025]
(6)根据(3)所述的方法，其中，外胚层的分化细胞为神经干细胞，神经嵴细胞或神经细胞。
[0026]
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，将基因的表达水平以mrna的量或蛋白质的量进行测定。
[0027]
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，其中，将基因的表达水平通过qpcr，数字pcr，免疫染色，原位杂交，rna测序，微阵列，nanostring，抗体阵列，流式细胞术或质谱分析进行测定。
[0028]
(9)选择安全性高的未分化细胞株的方法，通过测定选自由以下组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性进行：未分化细胞株诱导分化的内胚层，中胚层或外胚层中的任一种分化细胞中的esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd。
[0029]
(10)根据(9)所述的方法，其中，未分化细胞株为胚胎肿瘤细胞(ec细胞)株，胚胎干细胞(es细胞)株，人工多潜能干细胞(ips细胞或ipsc)株或胚胎生殖细胞(eg细胞)株。
[0030]
(11)根据(10)所述的方法，其中，未分化细胞株为ips细胞株。
[0031]
(12)检测未分化细胞的方法，包括测定选自由以下组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性：将分化细胞移植到模型动物中而形成的组织中的esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd。
[0032]
(13)用于检测在分化细胞群体中存在的未分化细胞，使用选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因作为未分化标记的方法。
[0033]
(14)用于检测未分化细胞的试剂盒，其包含能够检测选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因表达的试剂，和/或能够测定其启动子活性的试剂。
[0034]
(15)根据(14)所述的试剂盒，其中，能够检测基因表达的试剂为引物，探针或抗体。
[0035]
(16)根据(14)所述的试剂盒，其中，能够测定基因的启动子活性的试剂为在启动子下游连接报告蛋白质的基因序列或包括该基因序列的载体。
differentiation kit，stemcell technologies公司)对源自三个胚层的各自的细胞中诱导分化，利用免疫染色及qpcr确认发生了诱导分化。
[0051]
[图13]利用qpcr研究了在图12中诱导分化成的细胞中标记基因的表达。
[0052]
[图14]图12中使用图4，图5的方法对诱导分化成的细胞对残余未分化细胞数进行了评价。
具体实施方式
[0053]
以下详细说明本发明。
[0054]
本发明提供检测未分化细胞的方法，包括：测定在分化细胞群体中选自由esrg(hugo基因命名委员会(hugo gene nomenclature committee，hgnc)正式全名：胚胎干细胞相关；ncbi参考序列：nr_027122.1等)，vsnl1(hgnc正式全名：视锥蛋白样1；ncbi refseq：nm_003385.4等)，thy1(hgnc正式全名：thy-1细胞表面抗原；ncbi refseq：nm_001311160.1等)，sfrp2(hgnc正式全名：分泌型卷曲相关蛋白2(secreted frizzled related protein 2)；ncbi refseq：nm_003013.2)，spp1(hgnc正式全名：分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1)；ncbi refseq：nm_000582.2)，usp44(hgnc正式全名：泛素特异性肽酶44；ncbi refseq：nm_001042403.2)及cnmd(hgnc正式全名：软骨调节素(chondromodulin)；ncbi refseq：nm_001011705.1)组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性。
[0055]
作为检测的对象的未分化细胞为具有多潜能性的细胞即可，例如：未分化细胞为胚胎肿瘤细胞(ec细胞)，胚胎干细胞(es细胞)或人工多潜能干细胞(ips细胞)，胚胎生殖细胞(eg细胞)。
[0056]
构成分化细胞群体的细胞只要为除了未分化细胞以外的细胞即可，优选为不具有多潜能性，例如：由作为检测的对象的未分化细胞分化成的细胞。
[0057]
分化细胞群体可以为内胚层，中胚层及外胚层的任一种分化细胞的群体。
[0058]
当构成分化细胞群体的细胞为内胚层细胞，或源自内胚层的细胞等内胚层的分化细胞的情况下，优选标记基因为esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd，当构成分化细胞群体的细胞为中胚层细胞，或源自中胚层的细胞等中胚层的分化细胞的情况下，优选标记基因为esrg，sfrp2及cnmd，当构成分化细胞群体的细胞为外胚层细胞，或源自外胚层的细胞等外胚层的分化细胞的情况下，优选标记基因为esrg及cnmd。
[0059]
作为内胚层的分化细胞，可以例示肝内胚层细胞等，但不限于此。
[0060]
在后述的实施例中，检测了从ips细胞诱导分化成的肝内胚层细胞(分化细胞)的群体中被混入的ips细胞(未分化细胞)。该肝内胚层细胞为从ips细胞进行向肝细胞的诱导分化处理起第10天的称为ipsc-he(hepatic endoderm)(nature 499：481-484(2013)；日本专利第6124348号“组织及内脏器官的制作方法”)的肝祖细胞。根据基于qpcr的测定，认为esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd为对于肝内胚层细胞群体中ips细胞的检测而言有效的标记基因。
[0061]
作为中胚层的分化细胞，可以例示横隔间充质细胞，间充质细胞，血管内皮细胞等，但不限于这些。
[0062]
在后述的实施例中，检测了从ips细胞诱导分化成的间充质细胞(分化细胞)的群体中被混入的ips细胞(未分化细胞)。该间充质细胞为经从ips细胞向间充质细胞的诱导分
化处理的，称为ipsc-stm/mc(源自ips细胞的横隔间充质细胞/源自ips细胞的间充质细胞(横隔间充质细胞/间充质细胞，septum transversum mesenchyme/mesenchymal cells))(cell rep.21：2661-2670.(2017))的间充质系干/祖细胞(源自中胚层的细胞)，其为cd166阳性但不表达作为血管内皮的标记的cd31(pecam1)的细胞。根据采用qpcr的测定，认为esrg，sfrp2及cnmd为对于间充质细胞群体中ips细胞的检测而言有效的标记基因。
[0063]
另外，在后述的实施例中，检测了从ips细胞诱导分化成的血管内皮细胞(分化细胞)的群体中被混入的ips细胞(未分化细胞)。该血管内皮细胞为经从ips细胞向血管内皮细胞的诱导分化处理的称为ipsc-ec(源自ips细胞的血管内皮细胞(endothelial cells))(cell rep.21：2661-2670.(2017))的血管内皮祖细胞(源自中胚层的细胞)，可以利用免疫染色法确认作为血管内皮的标记的cd31(pecam1)，cd144的蛋白的表达，在基因表达分析中，观察到pecam1，cdh5，kdr，cd34等血管内皮标记的表达高，可观察到与诱导分化前的ips细胞相比为10倍～100倍以上的表达。根据采用qpcr的测定，认为esrg，sfrp2及cnmd为对于血管内皮细胞群体中ips细胞的检测而言有效的标记基因。
[0064]
作为外胚层的分化细胞，可以例示神经干细胞，神经嵴细胞，神经细胞等，但不限于此。
[0065]
在后述的实施例中，检测了从ips细胞诱导分化成的神经干细胞(分化细胞)的群体中被混入的ips细胞(未分化细胞)。该神经干细胞为经从ips细胞向神经干细胞的诱导分化处理的称为nsc(源自ips细胞的神经干细胞(neural stem cells))(stem cell reports.5：1010-1022.(2015))的神经干细胞(源自外胚层的细胞)。根据采用qpcr的测定，认为esrg及cnmd为对于神经干细胞群体中ips细胞的检测而言有效的标记基因。
[0066]
另外，在后述的实施例中，检测了从ips细胞诱导分化成的神经细胞(imaizumi et al，stem cell reports，5：1-13，2015)(源自外胚层的细胞)的群体中被混入的ips细胞(未分化细胞)。根据采用qpcr的测定，认为esrg及cnmd为对于神经细胞群体中ips细胞的检测而言有效的标记基因。
[0067]
进一步，在后述的实施例中，在检测了从ips细胞诱导分化成的神经嵴细胞(menendez l等人，proc natl acad sci u s a108(48)：19240-5.2011)(源自外胚层的细胞)的群体中被混入的ips细胞(未分化细胞)后，得到了同样的结果。
[0068]
另外，在后述的实施例中，也使用stemdiff三谱系分化试剂盒(stemcell technologies公司)，通过qpcr而检测了源自三个胚层的分别诱导分化成的细胞中标记基因的表达。
[0069]
在本发明中，分化细胞及未分化细胞可以为源自人或人以外的任何动物的那些。
[0070]
基因的表达水平可以以从基因转录成的mrna的量或从mrna翻译的蛋白质的量进行测定。具体而言，基因的表达水平可以通过qpcr，数字pcr，免疫染色，原位杂交，rna测序，微阵列，nanostring，抗体阵列，流式细胞术，质谱分析等进行测定。
[0071]
在确认到选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的表达的情况下，可以判定该分化细胞群体中存在未分化细胞(未分化细胞的检测)。
[0072]
在本说明书中，“检测”是指确认其存在，但在“检测”中也包括确认其不存在。
[0073]
根据本发明的方法，能利用0.1％以下的检测灵敏度，例如：0.025％，0.01％，根据情况而定，0.005％，0.0025％的检测灵敏度对分化细胞群体中的未分化细胞进行检测。检
测灵敏度可以通过在后述的实施例中记载的掺入(spike)试验进行检查。
[0074]
通过测定从未分化细胞株诱导分化的内胚层，中胚层或外胚层中的任一种分化细胞中的选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性，也能够选择安全性高的未分化细胞株。因此，本发明提供选择在诱导分化后不易残存未分化细胞，安全性高的未分化细胞株的方法，通过测定从未分化细胞株诱导分化的内胚层，中胚层或外胚层中的任一种分化细胞中的选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性进行。
[0075]
作为选择的对象的未分化细胞株为具有多潜能性的细胞株即可，例如：未分化细胞株为胚胎肿瘤细胞(ec细胞)株，胚胎干细胞(es细胞)株，人工多潜能干细胞(ips细胞)株或胚胎生殖细胞(eg细胞)株，优选ips细胞株。
[0076]
另外，也可以测定将分化细胞移植到模型动物中而形成的组织中的选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性，从而检测在该组织中的未分化细胞。因此，本发明也提供检测未分化细胞的方法，包括：测定将分化细胞移植到模型动物中而形成的组织中的选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的表达水平和/或启动子活性。组织为将分化细胞长期(例如：4～54周，优选地，8～24周)移植到模型动物而形成的那些即可。
[0077]
根据本发明明示了esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd可以用作用于检测分化细胞群体中存在的未分化细胞的标记基因。因此，本发明提供一种用于检测在分化细胞群体中存在的未分化细胞的使用选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因作为未分化标记的方法。
[0078]
另外，本发明提供用于检测未分化细胞的试剂盒，其包含能够检测选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因表达的试剂，和/或能够测定启动子活性的试剂。
[0079]
作为能够检测基因表达的试剂，可列举引物，探针及抗体等，例如：能够特异性扩增选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的转录产物(mrna)或cdna的寡核苷酸引物组，与选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的转录产物(mrna)或cdna特异性杂交的核苷酸探针，与从选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的转录产物(mrna)翻译成的蛋白(翻译产物)特异性结合的抗体。对于寡核苷酸引物组而言，为能够扩增选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的转录产物(mrna)或cdna的核苷酸序列中的靶序列(通常为50～180bp左右)的那些即可，设计为具有与靶序列的两末端互补的序列的方式即可。寡核苷酸引物的长度为例如：15～35个核苷酸即可，优选18～27个核苷酸。对核苷酸探针而言，为与选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的转录产物(mrna)或cdna在严格的条件下进行杂交的那些即可，设计为具有与上述mrna或cdna的核苷酸序列的一部分或全部或与其互补的序列的方式即可。严格的条件可以适当确定。核苷酸探针的长度通常为1000个核苷酸以下，优选为100个核苷酸以下，更优选为50个核苷酸以下，进一步更优选为14～30个核苷酸。核苷酸探针可以为单链，也可以为双链。抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体中的任一种。在本说明书中，抗体是指除了全长抗体以外，也包括fab，f(ab)
’
2
，scfv，双抗体(diabody)，v
h
，v
l
，sc
(fv)
2
，双特异性sc(fv)
2
，微小抗体(minibody)，scfv-fc单体，scfv-fc二聚体等小分子化抗体的概念。探针、抗体可以被固定于固相(例如：基板，珠子，膜等)上。
[0080]
本发明的试剂也可以被标记。例如，引物可以利用荧光物质、消光物质等标记，探针及抗体也可以利用放射性同位素，酶，发光物质，荧光物质，生物素等标记。另外，当在进行了与靶分子(在本发明中，为选自由esrg，vsnl1，thy1，sfrp2，spp1，usp44及cnmd组成的组中至少1个基因的表达产物的蛋白)特异性结合的第一抗体的反应之后，使其与与该第一抗体结合的第二抗体反应从而进行靶分子的检测的情况下，对第二抗体进行标记即可(第一抗体不标记)。
[0081]
作为能够测定基因的启动子活性的试剂，可列举启动子下游连接报告蛋白质的基因序列或包括该基因序列的载体等。作为报告蛋白质，可以例示荧光素酶，gfp等荧光蛋白质，cd抗原等在细胞膜表达的蛋白质等。载体优选为质粒载体。
[0082]
本发明的试剂盒也可以进一步包含：用于利用引物进行检测的试剂(dna聚合酶，缓冲剂，镁离子，dntps，探针等)，用于利用探针进行检测的试剂(缓冲剂，抗体，基质等)，用于利用抗体进行检测的试剂(二次抗体，基质，缓冲剂等)，用于测定基因的启动子活性的试剂(缓冲剂，发光基质，抗体等)，器械(反应容器，移液器等)，试剂盒的使用说明书，对照用的试样，用于分析测定结果的对照数据等。
[0083]
实施例
[0084]
下文中通过实施例对本发明进行具体的说明。本发明的范围并不限于以下的实施例。
[0085]
[实施例1]
[0086]
材料和方法
[0087]
●
ipsc
[0088]
使用了由京都大学及东京大学提供的那些(tkda3-4，1231a3，1383d2，1383d6及ff01)。
[0089]
●
中胚层细胞(mesoderm)分化
[0090]
将未分化ipsc在层粘连蛋白包被平皿上，在rock抑制剂(y-27632)存在下以1～2x10^4细胞/cm
2
的密度进行接种，在dmem f12+b27+chir+bmp4存在下培养4天，将该细胞作为中胚层细胞(mesoderm)。
[0091]
●
外胚层细胞(ectoderm)分化
[0092]
将未分化ipsc在层粘连蛋白包被平皿上，在rock抑制剂(y-27632)存在下以1x10^5细胞/cm
2
的密度进行接种，在dmem f12+ksr+2-me+egf+2bfgf+sb431542+bio存在下培养7天，将该细胞作为外胚层细胞(ectoderm)。或在kbm-nsc+b27+bfgf+hlif+chir99021+sb431542存在下培养7天，也可得到外胚层细胞(ectoderm)。
[0093]
●
未分化残余
[0094]
为了定量从ipsc分化成的细胞中残余的未分化细胞，发明人采用了tano等人的方法。简要概括为，首先使用胰蛋白酶将分化成的细胞剥下，在24孔板中加入rock抑制剂以1.6x10^5细胞/孔接种在stemfit中后，每天利用stemfit交换培养基同时在37℃进行培养。一周之后，进行免疫染色，计数阳性的克隆的数量。
[0095]
●
克隆计数
[0096]
用显微镜对经免疫染色的样品拍摄照片，通过目测对拍摄的照片数出克隆数。将1个克隆的未分化ipsc克隆作为1个未分化ips细胞的来源而作为残余未分化ips细胞数。
[0097]
●
肝细胞分化
[0098]
将未分化ips细胞在层粘连蛋白包被平皿上，在rock抑制剂(y-27632)存在下以5～10x10^4细胞/cm
2
的密度进行接种，在rpmi+b27+激活素a+wnt3a存在下培养6天，将该细胞作为胚体内胚层细胞(de)。进一步在ko-dmem+ksr+dmso+2-巯基乙醇存在下培养4天，作为肝内胚层细胞(he)。
[0099]
●
免疫染色
[0100]
为了检测未分化细胞，使用多潜能性标记的第一抗体sox2，tra-1-60(cell signaling technologies)和其对应的第二抗体(thermo fisher scientific)进行了免疫染色。通过用4％多聚甲醛处理15分钟，由此将细胞固定。用pbs洗涤2次后，加入pbs中的0.1％tritonx-100(pbst)处理10分钟，由此使细胞膜透化。之后使用在pbst中的5％fbs进行封闭处理。1小时后去掉封闭缓冲剂，添加适当稀释的第一抗体溶液，在4℃处理过夜。之后，用pbs洗涤3次，添加稀释的二次抗体溶液，避光室温静置1小时。最后用pbs洗涤3次，添加apathy封入剂(和光纯药)用于观察。
[0101]
●
显微镜(keyence等)
[0102]
通过全功能(all in one)荧光显微镜bz-x710y利用物镜4倍，10倍以明场，蓝色荧光，绿色荧光，红色荧光中对1个孔整体进行了拍摄。
[0103]
●
qpcr
[0104]
使用purelink rna mini试剂盒(thermo fisher)从细胞进行了rna提取，使用high-capacity cdna逆转录试剂盒(thermo fisher)通过逆转录反应合成了cdna，使用下述引物及通用探针文库(universal probe library，roche)进行了qpcr。
[0105]
esrg
[0106]
正向：tgggatggagccatagaagt(seq id no：1)
[0107]
反向：tgggtctttcaagaagttcctc(seq id no：2)
[0108]
probe：#52
[0109]
vsnl1
[0110]
正向：gaactgttgagttttatcattttcgt(seq id no：3)
[0111]
反向：caggggccagtttgctatt(seq id no：4)
[0112]
探针：#60
[0113]
thy1
[0114]
正向：cagaacgtcacagtgctcaga(seq id no：5)
[0115]
反向：gaggagggagagggagagc(seq id no：6)
[0116]
探针：#66
[0117]
sfrp2
[0118]
正向：gctagcagcgaccacctc(seq id no：7)
[0119]
反向：tttttgcaggcttcacatacc(seq id no：8)
[0120]
探针：#83
[0121]
spp1
[0122]
正向：gagggcttggttgtcagc(seq id no：9)
[0123]
反向：caattctcatggtagtgagttttcc(seq id no：10)
[0124]
探针：#18
[0125]
usp44
[0126]
正向：ccctcagaccagaatgcttta(seq id no：11)
[0127]
反向：cattgcagtgtacccagaacc(seq id no：12)
[0128]
探针：#9
[0129]
lect1(cnmd)
[0130]
正向：actcacaagccttcaatcctg(seq id no：13)
[0131]
反向：tctagggtcgaatgtcatgct(seq id no：14)
[0132]
探针：#18
[0133]
●
掺入实验
[0134]
在诱导分化成的细胞中以图中记载的比率混入处于未分化维持培养的ips细胞，实施了未分化残余试验，qpcr等。
[0135]
●
统计
[0136]
通过student
′
s t检验，将p值为0.05以下作为差异有统计学意义。相关系数基于pearson积距相关系数而算出。
[0137]
结果
[0138]
·
在肝中，lin28不能作为未分化ipsc的指标。
[0139]
报告称lin28(lin28a)基因作为从ipsc诱导分化成视网膜色素上皮细胞(rpe)时的残余未分化ipsc的指标(kuroda t.等人，plos one 7(5)：e37342.(2012))。虽然观察到lin28a在小鼠发育阶段的肝中的表达，但揭示了与成年个体(8w)相比，至e13.5表达较高(图1)。揭示了在作为内胚层细胞的源自ips细胞的胚体内胚层细胞(de)及肝内胚层细胞(he)中，与未分化ips细胞相比，也几乎观察不到减少(图2)。
[0140]
·
提取在ips细胞中特异性高表达的基因
[0141]
以提取在源自ips细胞的肝细胞中能利用的作为残余未分化ipsc的指标的标记基因为目的，实施了小鼠发育阶段的微阵列分析及源自ips细胞的肝细胞的诱导分化过程的单个细胞rna测序分析，提取了多个在未分化ips细胞中特异性且高表达，而在分化细胞中表达较低的基因。对于提取的基因，通过qpcr提取了在ips细胞中表达高，在分化细胞中表达降低的基因(图3)。
[0142]
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通过未分化克隆形成进行对未分化细胞残余的定量
[0143]
出于研究在图3中提取的标记基因的表达是否与实际的未分化ips细胞的残余数相关的目的，首先，根据文献信息(tano k等人，plos one.2014；9(10)：e110496)，实施了未分化ips细胞的残余数的评价办法的最优化(图4，5)。用诱导分化成的源自ips细胞的肝祖细胞(he)，根据在图4，5中经最优化的条件实施了未分化残留图像试验，算出残余未分化细胞数，进行了与利用qpcr的标记基因表达的相关分析(图6)。显示新型残余未分化hipsc标记表达量与未分化hipsc混入率具有高相关性。
[0144]
·
各标记基因的检测限的研究(未分化ipsc掺入试验)
[0145]
在诱导分化成的源自ips细胞的肝祖细胞(he)中，以记载的比率混入处于未分化
维持培养的ips细胞，实施了qpcr(图7)。其结果实现了与现有方法(lin28a)相比为1000倍以上的检测灵敏度。
[0146]
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在中胚层，外胚层的分化细胞中的未分化残余试验
[0147]
作为源自中胚层的细胞，研究了从ips细胞诱导分化成的横隔间充质细胞(ipsc-stm)及血管内皮细胞(ipsc-ec)中未分化ips细胞的残余试验及使用qpcr的标记基因的表达。在ipsc-stm及ipsc-ec任一种中，esrg，sfrp2及cnmd均在没有残余未分化细胞的分化细胞中减少，认为可以作为残余未分化标记使用(图8，9)。作为源自外胚层的细胞，研究了从ips细胞诱导分化成的神经干细胞(ipsc-nsc)及神经细胞(神经元)中未分化ips细胞的残余试验及使用qpcr的标记基因的表达。在ipsc-nsc及神经元中，esrg及cnmd在没有残余未分化细胞的分化细胞中减少，认为可以作为残余未分化标记使用(图10)。一方面，由于lin28a的表达没有降低，因此，揭示了在源自ips细胞的神经干细胞及神经细胞(神经元)中，残余未分化细胞与lin28a的表达均没有相关。在从ips细胞诱导分化成的神经嵴细胞(ncc)的利用qpcr的测定中，也得到了同样的结果(图11)。
[0148]
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在利用stemdifftm三谱系分化试剂盒制备成的分化细胞中的未分化残余试验
[0149]
为了进一步显示广泛使用性的成为源自ips细胞的诱导分化细胞中的残余未分化细胞的标记，利用使用市售的诱导分化试剂盒(stem cell technologies公司stemdiff三谱系分化试剂盒)诱导分化成的细胞进行了研究(图12)。其结果，在从ips细胞诱导分化成的源自内胚层的细胞中观察到了残余未分化细胞，标记基因表达也与残余数相关而较高。因此，在从ips细胞诱导分化成的源自内胚层的细胞，源自中胚层的细胞，源自外胚层的细胞的任意细胞谱系中，均观察到了残余未分化细胞数与标记表达的相关性(图13，14)。
[0150]
讨论
[0151]
对有助于再生医疗应用的源自ips(es)细胞的分化细胞中未分化细胞的混入的检测及排除而言，是在全部的源自ips(es)细胞的细胞加工产品的安全性的确保中的重要课题。至今，报告了利用视网膜色素上皮细胞(rpe)中lin28a的表达证实进行的迅速的未分化细胞的混入评价，但在肝中，在小鼠发育过程中lin28a是表达的，实际上在从人ips细胞诱导分化成的细胞中也观察到了lin28a的表达，另外，揭示了该表达实际上与在分化细胞中残余的未分化细胞的有无并不相关。因此，提取了多个源自ips细胞的肝细胞中残余未分化细胞的标记。揭示了这些标记不仅在作为源自内胚层的细胞的肝细胞中，在从ips细胞诱导分化成的中胚层细胞，源自中胚层的横隔间充质细胞，间充质细胞，血管内皮细胞中也成为残余未分化细胞的指标。进一步，揭示了在从ips细胞诱导分化成的外胚层细胞，源自外胚层的神经干细胞，神经嵴细胞，神经细胞中也包含与残余未分化细胞在表达上相关的标记。一方面，由于lin28a的表达没有降低，因此揭示了在源自ips细胞的神经干细胞中，lin28a也不可成为残余未分化细胞的指标。综上所述，使用这次提取的多个标记基因进行的残余未分化ips细胞的检测办法，可期待成为用于确保各种源自ips(es)细胞的细胞加工产品安全性的简便、迅速的工具。
[0152]
参考文献：
[0153]
·
kuroda t.等人，plos one 7(5)：e37342.(2012)
[0154]
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tano等人，plos one.2014 27；9(10)：e110496.
[0155]
[实施例2]
[0156]
通过在参与本发明的标记基因的表达控制的启动子区域的控制下引入报告蛋白质基因(荧光素酶基因，gfp基因等荧光蛋白质基因，或小鼠cd4基因等在细胞表面表达而能够使用抗体等检测特异性表达的基因等)，即使不直接检测本发明的标记基因的表达，也能够检测残余的未分化细胞。
[0157]
[实施例3]
[0158]
对于多个ips细胞株，对目标细胞及使用3胚层诱导分化试剂盒等诱导分化成的细胞针对本发明的标记基因的表达进行评价，通过选择标记基因的表达较低的ips细胞株，由此能够实现选择安全性高的未分化细胞株。
[0159]
[实施例4]
[0160]
收集将分化细胞长期移植到模型动物中而植活的细胞，通过将本发明的标记基因的表达利用qpcr等检测，或通过〔实施例2〕中记载的方法进行检测，从而检测在形成的组织中的未分化细胞。
[0161]
将本说明书所引用的全部刊物、专利及专利申请以其整体直接作为参考而并入本说明书中。
[0162]
工业实用性
[0163]
本发明能够用于在再生医疗中使用的分化细胞中残余/混入的未分化细胞的检测、评价。
[0164]
序列表自由文本
[0165]
<seq id nos：1～14>
[0166]
示出引物的dna序列。