用于检测B群链球菌核酸的组合物和方法与流程

用于检测b群链球菌核酸的组合物和方法


背景技术：

1.b群链球菌(group b streptococcus，gbs)或无乳链球菌(streptococcus agalactiae)是一种革兰氏阳性细菌，其与全身(包括阴道、胃肠道和尿道)粘膜的短暂定殖相关。gbs很少在健康个体中引起疾病，但可以在免疫受损的患者、老年个体和新生儿中引起严重疾病。特别令人关注的是由分娩和生产过程中的垂直传播引起的新生儿感染。从无症状定殖的母亲传播到新生儿可导致早发型侵袭性gbs疾病，这是美国新生儿的败血症和脑膜炎的主要原因。新生儿的早发型gbs疾病可导致死亡或长期残疾，如智力迟钝以及听力或视力丧失。buchan等人,j.clin.microbiol.53:443
‑
448,2015。
2.在常规筛查过程中对gbs的鉴定导致施用分娩期预防，以减轻细菌的传播并降低侵袭性疾病的可能性。实施这种筛查和预防策略已将早发型g bs的发生率降低了60％至86％。lin等人,am.j.obstet.gynecol.184:1204
‑
1210,2001。自2010年以来，cdc指南已将分子诊断测试作为与培养并行或附加于培养的一种选择而包括在内。当前的测试包括靶向cfb基因的cephei d gbs lb和bd max gbs测试。
3.本领域中需要具有改善的敏感性和/或防范单一基因的分离变异的潜力的gbs测定，包括例如可以检测gbs血清型ia、ib、ic、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii和ix(包括非溶血性分离物)的测定。


技术实现要素：

4.在一方面，本发明提供了一种用于确定样品中b群链球菌(gbs)的存在或不存在的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含第一扩增寡聚物组合和第二扩增寡聚物组合中的至少一种，其中(i)所述第一扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；并且(ii)所述第二扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列：(a)(a')作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)(a')seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及
(b')seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a')seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。
5.在如上所述组合物的一些实施方案中，其中所述组合物包含所述第一扩增寡聚物组合，所述组合物进一步包含sip特异性检测探针寡聚物，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(i)(a)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(i)(b)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
6.在如上所述组合物的一些实施方案中，其中所述cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列至少包含seq id no:28的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些此类实施方案中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列包含在seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体中；在一些此类变型中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其中所述cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列的其他实施方案中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。(ii)(a)的特别合适的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列包括(i)(a')seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(ii)(a')seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(iii)(a')seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(iv)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。
7.在如上所述组合物的一些实施方案中，其中所述组合物包含第一扩增寡聚物组合，所述组合物进一步包含cfb特异性检测探针寡聚物，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(b)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一
和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(d)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:22或seq id no:23、或其rna等同物量或dna/rna嵌合体；或者所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(c)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
8.在如上所述用于确定样品中gbs的存在或不存在的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含所述第一和第二扩增寡聚物组合两者。
9.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的组合物，其中所述组合物包含扩增寡聚物组合，所述扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物。特别合适的第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述组合物进一步包含sip特异性检测探针寡聚物，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(a)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(b)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。在如上所述组合物的一些变型中，所述组合物进一步包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第二扩增寡聚物组合。
10.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的组合物，其中所述组合物包含扩增寡聚物组合，所述扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物。特别合适的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)cfb特异性靶杂交序列：(a)(a)作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)(a)seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；
(c)(a)seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a)seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在某些实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列至少包含seq id no:28的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些此类实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列包含在seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体中；在一些此类变型中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。(a)的特别合适的第一(a)和第二(b)cfb特异性靶杂交序列包括(i)(a)seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:13、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(ii)(a)seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(iii)(a)seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(iv)(a)seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述组合物进一步包含cfb特异性检测探针寡聚物，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(b)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(d)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(a)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:22或seq id no:23、或其rna等同物量或dna/rna嵌合体；或者所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(c)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。在如上所述组合物的一些变型中，所述组合物进一步包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第二扩增寡聚物组合。
11.在另一方面，本发明提供了一种包含如上所述组合物和有机缓冲液的用于扩增gbs核酸的水性配制品。在一些实施方案中，所述水性配制品进一步包含一种或多种选自以下项的组分：dna聚合酶、逆转录酶、检测探针寡聚物和增量剂(例如，海藻糖、棉子糖或其组合)。在一些实施方案中，所述水性配制品含有浓度为4mm或更小的无机盐。
12.在另一方面，本发明提供了一种包含如上所述水性配制品的用于扩增gbs核酸的反应混合物。
13.在另一方面，本发明提供了一种包含如上所述组合物和增量剂的用于扩增gbs核酸的干燥配制品。在一些实施方案中，所述增量剂是海藻糖、棉子糖或其组合。在一些实施方案中，所述干燥配制品进一步包含一种或多种选自以下项的组分：无机盐、dna聚合酶、逆转录酶和检测探针寡聚物。在进一步包含无机盐的一些实施方案中，所述无机盐的质量相对于所述干燥配制品的质量的百分比为0.249％或更小。在某些变型中，所述干燥配制品是冻干配制品。
14.在另一方面，本发明提供了一种用于扩增gbs核酸的反应混合物，其中所述反应混合物是用水或有机缓冲液从如上所述干燥配制品重构的。在一些实施方案中，所述反应混合物含有无机盐，例如像镁、钾或钠；在一些此类变型中，所述无机盐的浓度为4mm或更小。
15.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一扩增寡聚物组合和第二扩增寡聚物组合中的至少一种，其中(i)所述第一扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；并且(ii)所述第二扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列：(a)(a')作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)(a')seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a')seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。
16.在如上所述试剂盒的一些实施方案中，其中所述试剂盒包含第一扩增寡聚物组合，所述试剂盒进一步包含sip特异性检测探针寡聚物，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(i)(a)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施
方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(i)(b)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
17.在如上所述试剂盒的一些实施方案中，其中所述cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列至少包含seq id no:28的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些此类实施方案中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列包含在seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体中；在一些此类变型中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其中所述cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列的其他实施方案中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。(ii)(a)的特别合适的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列包括(i)(a')seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(ii)(a')seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(iii)(a')seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(iv)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。
18.在如上所述试剂盒的一些实施方案中，其中所述试剂盒包含第一扩增寡聚物组合，所述试剂盒进一步包含cfb特异性检测探针寡聚物，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(b)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(d)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:22或seq id no:23、或其rna等同物量或dna/rna嵌合体；或者所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(c)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
19.在如上所述用于确定样品中gbs的存在或不存在的试剂盒的某些实施方案中，所述试剂盒包含所述第一和第二扩增寡聚物组合两者。
20.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的试剂盒，其中所述试剂盒包含扩增寡聚物组合，所述扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物。特别合适的第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述试剂盒进一步包含sip特异性检测探针寡聚物，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(a)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(b)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。在如上所述试剂盒的一些变型中，所述试剂盒进一步包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第二扩增寡聚物组合。
21.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的试剂盒，其中所述试剂盒包含扩增寡聚物组合，所述扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物。特别合适的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)cfb特异性靶杂交序列：(a)(a)作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)(a)seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)(a)seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a)seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在某些实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列至少包含seq id no:28的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些此类实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列包含在seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体中；在一些此类变型中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。(a)的特别合适的第一(a)和第二(b)cfb特异性靶杂交序列包括(i)(a)seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及
(b)seq id no:13、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(ii)(a)seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(iii)(a)seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(iv)(a)seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述试剂盒进一步包含cfb特异性检测探针寡聚物，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(b)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(d)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(a)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:22或seq id no:23、或其rna等同物量或dna/rna嵌合体；或者所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(c)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。在如上试剂盒的一些变型中，所述试剂盒进一步包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第二扩增寡聚物组合。
22.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(1)使怀疑含有gbs的样品与第一扩增寡聚物组合和第二扩增寡聚物组合中的至少一种接触，其中(i)所述第一扩增寡聚物组合包含用于扩增gbs sip靶核酸的第一和第二sip特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)靶区域sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；并且(ii)所述第二扩增寡聚物组合包含用于扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列：(a)(a')作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；
(b)(a')seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a')seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(2)进行体外核酸扩增反应，其中存在于所述样品中时的任何gbs sip和/或cfb靶核酸均被用作模板来产生与所述sip和cfb靶区域中的至少一种对应的一个或多个扩增子；以及(3)检测所述一个或多个扩增子的存在或不存在，从而确定所述样品中gbs的存在或不存在。
23.在如上所述方法的一些实施方案中，所述方法包括使所述样品与所述第一和第二扩增寡聚物组合两者接触。在一些此类实施方案中，所述方法是多路化方法，所述多路化方法包括使所述样品与在同一反应混合物内的所述第一和第二扩增寡聚物组合两者接触。
24.在如上所述方法的一些实施方案中，其中所述方法包括使所述样品与所述第一扩增寡聚物组合接触，所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应物与sip特异性检测探针寡聚物接触，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(i)(a)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(i)(b)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
25.在如上所述方法的一些实施方案中，其中所述cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列至少包含seq id no:28的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些此类实施方案中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列包含在seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体中；在一些此类变型中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其中所述cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列的其他实施方案中，(ii)(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。(ii)(a)的特别合适的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列包括(i)(a')seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(ii)(a')seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；
(iii)(a')seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(iv)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。
26.在如上所述方法的一些实施方案中，其中所述方法包括使所述样品与所述第二扩增寡聚物组合接触，所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应物与cfb特异性检测探针寡聚物接触，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(b)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(d)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(a)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:22或seq id no:23、或其rna等同物量或dna/rna嵌合体；或者所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(ii)(c)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
27.在如上所述用于确定样品中gbs的存在或不存在的方法的某些变型中，所述检测步骤是实时进行的。
28.在如上所述用于确定样品中gbs的存在或不存在的方法的某些变型中，所述体外核酸扩增反应是pcr扩增反应(例如，实时pcr扩增反应)。
29.在如上所述方法的一些实施方案中，其中所述方法包括使所述样品与所述第一和第二扩增寡聚物组合两者接触(例如，多路化方法)，所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应物与(i)sip特异性检测探针寡聚物和(ii)cfb特异性检测探针寡聚物接触，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列，其中所述sip特异性检测探针寡聚物和所述cfb特异性检测探针寡聚物中的每一种包含荧光标记和非荧光猝灭剂。在一些此类实施方案中，所述体外核酸扩增反应是实时pcr扩增反应。
30.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的方法，其中所述方法包括(1)使怀疑含有gbs的样品与扩增寡聚物组合接触，所述扩增寡聚物组合包含用于扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及
(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(2)进行体外核酸扩增反应，其中存在于所述样品中时的任何gbs sip靶核酸均被用作模板来产生与所述sip靶区域对应的扩增子；以及(3)检测所述扩增子的存在或不存在，从而确定所述样品中gbs的存在或不存在。在一些变型中，所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应物与sip特异性检测探针寡聚物接触，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列。在一些此类实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(a)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，所述第一和第二sip特异性靶杂交序列是(b)的所述靶杂交序列，并且所述sip特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。在某些变型中，所述检测步骤是实时进行的。在某些变型中，所述体外核酸扩增反应是pcr扩增反应(例如，实时pcr扩增反应)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与第二扩增寡聚物组合接触，所述第二扩增寡聚物组合包含用于扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，其中在所述扩增步骤中，存在于所述样品中时的任何gbs cfb靶核酸均被用作模板来产生与所述cfb靶区域对应的扩增子，并且其中所述检测步骤包括检测所述与所述cfb靶区域对应的扩增子的存在或不存在。
31.在另一方面，本发明提供了一种用于确定样品中gbs的存在或不存在的方法，其中所述方法包括(1)使怀疑含有gbs的样品与扩增寡聚物组合接触，所述扩增寡聚物组合包含用于扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)cfb特异性靶杂交序列：(a)(a)作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)(a)seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)(a)seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a)seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(2)进行体外核酸扩增反应，其中存在于所述样品中时的任何gbs cfb靶核酸均被用作模板来产生与所述cfb靶区域对应的扩增子；以及(3)检测所述扩增子的存在或不存在，从而确定所述样品中gbs的存在或不存在。
在某些实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列至少包含seq id no:28的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些此类实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列包含在seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体中；在一些此类变型中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在其他实施方案中，(a)的所述第一cfb特异性靶杂交序列是seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。(a)的特别合适的第一(a)和第二(b)cfb特异性靶杂交序列包括(i)(a)seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:13、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(ii)(a)seq id no:12、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(iii)(a)seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(iv)(a)seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述检测步骤包括使所述体外核酸扩增反应物与cfb特异性检测探针靶杂交序列接触，所述cfb特异性检测探针靶杂交序列长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交。在一些此类实施方案中，所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(b)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(d)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(a)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:22或seq id no:23、或其rna等同物量或dna/rna嵌合体；或者所述第一和第二cfb特异性靶杂交序列是(c)的所述靶杂交序列，并且所述cfb特异性检测探针靶杂交序列是seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。在某些变型中，所述检测步骤是实时进行的。在某些变型中，所述体外核酸扩增反应是pcr扩增反应(例如，实时pcr扩增反应)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与第二扩增寡聚物组合接触，所述第二扩增寡聚物组合包含用于扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物，其中在所述扩增步骤中，存在于所述样品中时的任何gbs sip靶核酸均被用作模板来产生与所述sip靶区域对应的扩增子，并且其中所述检测步骤包括检测所述与所述sip靶区域对应的扩增子的存在或不存在。
32.在如上所述用于确定样品中gbs的存在或不存在的方法的一些实施方案中，所述方法确定gbs血清型ia、ib、ic、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii和ix中的任一种的存在或不存在。在一些此类实施方案中，所述方法进一步确定gbs的非溶血性菌株的存在或不存在。
33.在另一方面，本发明提供了一种检测探针寡聚物。在一些实施方案中，所述检测探
针寡聚物是sip特异性检测探针寡聚物，所述sip特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被第一扩增寡聚物组合扩增的sip扩增子内含有的靶序列杂交的sip特异性检测探针靶杂交序列，所述第一扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs sip靶核酸的靶区域的第一和第二sip特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二sip特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a)和第二(b)sip特异性靶杂交序列：(a)(a)seq id no:3、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:4、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(b)(a)seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b)seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在如上所述sip特异性检测探针寡聚物的一些实施方案中，所述sip特异性检测探针靶杂交序列选自(a)seq id no:9、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；和(b)seq id no:11、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述sip特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
34.在其他实施方案中，所述检测探针寡聚物是cfb特异性检测探针寡聚物，所述cfb特异性检测探针寡聚物包含长度为约15至约35个核苷酸并且被配置为与可被第二扩增寡聚物组合扩增的cfb扩增子内含有的靶序列杂交的cfb特异性检测探针靶杂交序列，所述第二扩增寡聚物组合包含能够扩增gbs cfb靶核酸的靶区域的第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，其中所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含选自以下项的第一(a')和第二(b')cfb特异性靶杂交序列：(a)(a')作为seq id no:26的序列中含有的约17至约24个连续核苷酸的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)(a')seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)(a')seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；以及(d)(a')seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体，以及(b')seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在如上所述cfb特异性检测探针寡聚物的一些实施方案中，所述cfb特异性检测探针靶杂交序列选自(a)seq id no:24、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(b)seq id no:25、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；(c)seq id no:22、或其rna等同物或dna/rna嵌合体；和(d)seq id no:23、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含可检测标记，例如像荧光或化学发光标记。在包含可检测标记的探针寡聚物的一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记，并且所述cfb特异性检测探针寡聚物进一步包含非荧光猝灭剂。
35.在另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含如上所述sip特异性检测探针寡聚物和cfb特异性检测探针寡聚物。
36.在另一方面，本发明提供了一种用于检测gbs核酸的水性配制品，所述水性配制品
包含(1)如上所述sip特异性检测探针寡聚物和/或cfb特异性检测探针寡聚物和(2)有机缓冲液。在一些实施方案中，所述水性配制品进一步包含一种或多种选自以下的组分：表面活性剂(例如，聚乙二醇单[4
‑
(1,1,3,3
‑
四甲基丁基)苯基]醚、聚山梨酯20或其组合)、dna聚合酶、逆转录酶、至少一种扩增寡聚物、和增量剂(例如，海藻糖、棉子糖或其组合)。在包含表面活性剂的某些变型中，所述表面活性剂是非线性表面活性剂，例如像聚山梨酯20。在一些实施方案中，所述水性配制品含有浓度为4mm或更小的无机盐。在相关方面，本发明提供了一种包含如上所述水性配制品的用于检测gbs的反应混合物。
[0037]
在另一方面，本发明提供了一种用于检测gbs核酸的干燥配制品，所述干燥配制品包含(1)如上所述sip特异性检测探针寡聚物和/或cfb特异性检测探针寡聚物和(2)增量剂。在一些实施方案中，所述增量剂是海藻糖、棉子糖或其组合。在一些实施方案中，所述干燥配制品进一步包含一种或多种选自以下的组分：无机盐、dna聚合酶、逆转录酶、至少一种扩增寡聚物和表面活性剂(例如，聚乙二醇单[4
‑
(1,1,3,3
‑
四甲基丁基)苯基]醚、聚山梨酯20或其组合)。在进一步包含无机盐的一些实施方案中，所述无机盐的质量相对于所述干燥配制品的质量的百分比为0.249％或更小。在包含表面活性剂的某些变型中，所述表面活性剂是非线性表面活性剂，例如像聚山梨酯20。在某些变型中，所述干燥配制品是冻干配制品。在相关方面，本发明提供了一种用于检测gbs的反应混合物，其中所述反应混合物是用水和有机缓冲液从如上所述干燥配制品重构的。在一些实施方案中，所述反应混合物含有无机盐，例如像镁、钾或钠；在一些此类变型中，所述无机盐的浓度为4mm或更小。
[0038]
本发明的这些和其他方面在参考以下发明详细描述和附图时将变得清楚。定义
[0039]
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与所述方法和组合物所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。可以在与分子生物学领域有关的技术书籍中找到一般定义，所述技术书籍例如dictionary of microbiology and molecular biology,第2版(singleton等人,1994,john wiley&sons,纽约,纽约州)或the harper collins dictionary of biology(hale和marham,1991,harper perennial,纽约,纽约州)。如本文所用，除非另外说明，否则以下术语和短语具有赋予它们的含义。
[0040]
除非上下文另外明确指明，否则术语“一个/一种”(“a”、“an”)和“所述”(“the”)包括复数种/个指示物。例如，如本文所用，“核酸”应理解为表示一种或多种核酸。因此，术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/一种”在本文中可互换使用。
[0041]
应理解，在本公开文本中讨论的温度、浓度、时间等之前存在隐含的“约”，使得轻微和非实质性偏差在本文的本教导内容的范围内。通常，术语“约”指示组合物的组分的量的非实质性变化，所述非实质性变化对组合物的活性或稳定性没有任何显著影响。在没有明确排除(如“不包括端点”)的情况下，所有范围都应解释为涵盖端点；因此，例如，“在10
‑
15内”包括值10和15。而且，“包含(comprise、comprises、comprising)”、“含有(contain、contains、containing)”和“包括(include、includes和including)”的使用不是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，并不是对本教导内容的限制。在通过引用并入的任何材料与本公开文本的明确内容不一致的情况下，以明确内容为准。
[0042]
除非特别指出，否则在说明书中叙述“包含”各种组分的实施方案也可设想为“由所叙述组分组成”或“基本上由所叙述组分组成”；说明书中叙述“由各种组分组成”的实施方案也可设想为“包含所叙述组分”或“基本上由所叙述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各种组分组成”的实施方案也可设想为“由所叙述组分组成”或“包含所叙述组分”(这种可互换性不适用于权利要求中的这些术语的使用)。“基本上由
……
组成”意指不实质上改变本文所述的组合物和方法的基本和新颖特征的另外一种或多种组分、一种或多种组合物或一个或多个方法步骤可以包括在那些组合物或方法中。此类特征包括以区分gbs核酸与其他已知病原体的特异性、任选地以可检测样品中以约100cfu/ml浓度存在的细菌的敏感性、任选地在约60分钟内和/或当使用循环扩增反应时在从扩增反应开始的约40个循环内检测样品中存在的b群链球菌(gbs)核酸序列的能力。
[0043]“样品”包括可能含有gbs或其组分(如核酸或核酸片段)的任何样本。样品包括“生物样品”，所述生物样品包括可能含有gbs或源自其中的靶核酸的源自活的或死亡的人的任何组织或材料，包括例如阴道拭子样品、宫颈刷样品、呼吸组织或渗出液如支气管镜检、支气管肺泡灌洗液(bal)或肺活检、痰、唾液、外周血、血浆、血清、淋巴结、胃肠组织、粪便、尿液、精液或其他体液或物质。可以处理生物样品以物理或机械破坏组织或细胞结构，从而将细胞内组分释放到溶液中，所述溶液可以进一步含有酶、缓冲液、盐、洗涤剂等，所述酶、缓冲液、盐、洗涤剂用于使用标准方法制备用于分析的生物样品。另外，样品可以包括经处理的样品，例如通过使样品经过或通过过滤装置，或者随后的离心，或通过粘附到培养基、基质或支持物上获得的样品。
[0044]“核酸”和“多核苷酸”是指包含使含氮杂环碱基或碱基类似物连接在一起以形成多核苷酸的核苷或核苷类似物的多聚体化合物，包括常规rna、dna、混合rna
‑
dna和作为其类似物的聚合物。核酸“骨架”可以由多种连接组成，所述多种连接包括一个或多个糖
‑
磷酸二酯连接、肽
‑
核酸键(“肽核酸”或pna；pct公开号wo 95/32305)、硫代磷酸酯连接、甲基膦酸酯连接或其组合中的一种或多种。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或具有取代(例如2'甲氧基或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(a、g、c、t、u)、其类似物(例如肌苷或其他；参见the biochemistry of the nucleic acids 5
‑
36,adams等人编辑,第11版,1992)、嘌呤或嘧啶的衍生物(例如n4‑
甲基脱氧鸟苷、脱氮杂或氮杂嘌呤、脱氮杂或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基团的嘧啶碱基、在2、6或8位具有取代基的嘌呤碱基、2
‑
氨基
‑6‑
甲基氨基嘌呤、o6‑
甲基鸟嘌呤、4
‑
硫代
‑
嘧啶、4
‑
氨基
‑
嘧啶、4
‑
二甲基肼
‑
嘧啶和o4‑
烷基
‑
嘧啶；美国专利号5,378,825和pct公开号wo93/13121)。核酸可以包含一个或多个“无碱基”残基，其中骨架对于聚合物的一个或多个位置不包含含氮碱基(美国专利号5,585,481)。核酸可以仅包含常规的rna或dna糖、碱基和连接，或者可以包含常规组分和取代基二者(例如，具有2'甲氧基连接的常规碱基，或含有常规碱基和一个或多个碱基类似物的聚合物)。核酸包括“锁核酸”(lna)，其是含有具有以rna模拟糖构象锁定的双环呋喃糖单元的一个或多个lna核苷酸单体从而增强对互补rna和dna序列的杂交亲和力的类似物(vester和wengel,2004,biochemistry 43(42):13233
‑
41)。可能影响杂交复合物的稳定性的寡聚物的实施方案包括pna寡聚物、包括2'
‑
甲氧基或2'
‑
氟取代的rna的寡聚物、或影响杂交复合物的总电荷、电荷密度或空间缔合的寡聚物，包括含有带电荷连接(例如，硫代磷酸酯)或中性基团(例如，甲基膦酸酯)的寡聚物。除非另外说明，否则5
‑
甲基胞嘧啶可与任何前述骨
架/糖/连接(包括rna或dna骨架)(或其混合物)结合使用。应理解，当提及寡核苷酸、扩增子或其他核酸的长度范围时，所述范围包括所有整数(例如，长度为19
‑
25个连续核苷酸包括19、20、21、22、23、24和25)。
[0045]
如本文所用，“核苷酸”是核酸中由磷酸基团、5
‑
碳糖和含氮碱基(在本文中也称为“核碱基”)组成的亚基。rna中存在的5
‑
碳糖是核糖。在dna中所述5
‑
碳糖是2'
‑
脱氧核糖。所述术语也包括此类亚基的类似物，如在核糖2'位的甲氧基基团(在本文中也称为“2'
‑
o
‑
me”或“2'
‑
甲氧基”)。
[0046]“rna和dna等同物”意指具有基本相同的互补碱基对杂交特性的rna和dna分子。rna和dna等同物具有不同的糖部分(即核糖与脱氧核糖)，并且不同之处可能在于rna中存在尿嘧啶而dna中存在胸腺嘧啶。rna与dna等同物之间的差异不会导致同源性差异，因为这些等同物与特定序列具有相同程度的互补性。“dna/rna嵌合体”意指包含dna和rna核苷酸两者的核酸。除非上下文另外明确指出，否则提及gbs核酸包括gbs rna和dna等同物及其dna/rna嵌合体。
[0047]
如本文所用，“靶核酸”是包含待扩增的靶序列的核酸。靶核酸可以是dna或rna，并且可以是单链或双链的。除了靶序列之外，靶核酸还可以包含可以不被扩增的其他序列。
[0048]
如本文所用，术语“靶序列”是指待扩增和/或检测的靶核酸的特定核苷酸序列。“靶序列”包括在扩增过程(例如pcr、tma)期间寡核苷酸(例如引物寡核苷酸和/或启动子寡核苷酸)与其复合的复合序列。在靶核酸最初是单链的情况下，术语“靶序列”也将指与如靶核酸中存在的“靶序列”互补的序列。在靶核酸最初是双链的情况下，术语“靶序列”是指有义(+)链和反义(
‑
)链两者。
[0049]“靶杂交序列”或“靶特异性序列”在本文中用于指寡聚物中被配置为与靶核酸序列杂交的部分。优选地，所述靶杂交序列被配置为与靶核酸序列特异性地杂交。靶杂交序列可以与它们被配置为杂交的靶序列的部分100％互补，但未必一定如此。靶杂交序列也可以包含相对于靶序列的插入、缺失和/或取代的核苷酸残基。例如，可能出现靶杂交序列与靶序列的互补性小于100％，例如，当靶核酸是物种内的多种菌株时，如对于被配置为与多种gbs血清型杂交的寡聚物就是这种情况。应理解，存在将靶杂交序列配置为与靶核酸具有小于100％的互补性的其他原因。
[0050]
如本文关于gbs核酸的区域所用的术语“靶向序列”是指其中寡核苷酸以允许如本文所述的扩增和检测的方式与靶序列杂交的过程。在一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸与靶向的gbs核酸序列互补并且不含有错配。在另一个优选的实施方案中，所述寡核苷酸与靶向的gbs核酸序列互补，但含有1、2、3、4或5个错配。优选地，所述寡聚物与靶序列特异性地杂交。
[0051]
术语“配置为”表示参考寡核苷酸靶杂交序列的多核苷酸序列配置的实际排列。例如，被配置为从靶序列产生指定扩增子的扩增寡聚物具有与靶序列杂交并且可以用于扩增反应中以产生扩增子的多核苷酸序列。还例如，配置为与靶序列特异性杂交的寡核苷酸具有在严格杂交条件下与参考序列特异性杂交的多核苷酸序列。
[0052]
如本文所用，术语“被配置为与
……
特异性杂交”意指扩增寡核苷酸、检测探针或其他寡核苷酸的靶杂交区被设计为具有可靶向参考gbs靶区域的序列的多核苷酸序列。这种寡核苷酸不限于仅靶向该序列，而是可用作用于靶向gbs靶核酸的组合物、可用于靶向
gbs靶核酸的试剂盒中或靶向gbs靶核酸的方法中。所述寡核苷酸被设计为用作用于从样品扩增和检测gbs的测定的组分，且因此被设计为在测试样品中通常发现存在其他核酸的情况下靶向gbs。如本领域所理解的，“与
……
特异性杂交”并不意指唯一地与
……
杂交，因为可能发生与非靶核酸的一些低水平的杂交。准确地说，“与
……
特异性杂交”意指寡核苷酸被配置为在测定中用于主要与靶标杂交，使得可以确定样品中靶核酸的准确检测。
[0053]
如本文所用，术语“区域”是指核酸的一部分，其中所述部分小于整个核酸。例如，当提及的核酸是寡核苷酸启动子引物时，术语“区域”可以用于指较小的启动子部分。类似地，并且也仅作为例子，当核酸是gbs靶核酸时，术语“区域”可以用于指核酸的较小区域，其中所述较小区域被本公开文本的一种或多种寡核苷酸靶向。作为另一个非限制性例子，当提及的核酸是扩增子时，术语区域可用于指鉴定用于通过探针的靶杂交序列杂交的较小核苷酸序列。
[0054]“寡聚物”、“寡核苷酸(oligonucleotide)”或“寡核苷酸(oligo)”是指通常少于1,000个核苷酸(nt)的核酸，包括在下限为约2至5nt且上限为约500至900nt的大小范围内的那些。一些特定实施方案是在下限为约5至15、16、17、18、19或20nt且上限为约50至600nt的大小范围内的寡聚物，并且其他特定实施方案是在下限为约10至20nt且上限为约22至100nt的大小范围内。寡聚物可以从天然存在的来源纯化，但是可以通过使用任何熟知的酶或化学方法合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；准确地说，它一般用于涵盖本文所述的所有此类试剂。寡核苷酸可以发挥各种不同的功能。例如，如果它对互补链具有特异性且能够与之杂交并且可以在核酸聚合酶的存在下进一步延伸，则它可以用作引物；如果它含有被rna聚合酶识别的序列并允许转录，则它可以用作引物并提供启动子(例如t7引物)；以及如果它能够与靶核酸或其扩增子杂交并进一步提供可检测部分(例如吖啶酯化合物)，则它可以用于检测靶核酸。寡聚物可以通过功能名称(例如，捕获探针、引物或启动子引物)来提及，但是本领域技术人员将理解此类术语是指寡聚物。
[0055]
如本文所用，与指定参考核酸序列“基本上对应”的寡核苷酸意指寡核苷酸与参考核酸序列足够相似，使得寡核苷酸与参考核酸序列具有相似的杂交特性，即它将在严格杂交条件下与相同的靶核酸序列杂交。本领域技术人员将理解，“基本上对应的寡核苷酸”可以不同于参考序列，并且仍然与相同的靶核酸序列杂交。还应理解，除非上下文另有明确指出，否则与第二核酸对应的第一核酸包括其rna或dna等同物以及其dna/rna嵌合体，并包括其互补体。核酸的这种变异可以根据序列内相同碱基的百分比或探针或引物与其靶序列之间的完美互补碱基的百分比来陈述；因此，在某些实施方案中，如果碱基同一性或互补性的这些百分比为100％至约80％、优选地100％至约85％、或更优选地100％至约90％或100％至约95％，则寡核苷酸与参考核酸序列“基本上对应”。核酸的这种变异也可以用相对于参考序列核酸序列中的核碱基取代数量或相对于靶序列的序列内错配数量来表述；因此，在某些实施方案中，如果该核碱基取代或错配数量为最多四个、优选地最多三个、或更优选地最多两个或最多一个取代或错配(即，零至四个、优选地零至三个、或更优选地零至两个或零至一个，包括端值)，则寡核苷酸与参考核酸序列“基本上对应”。类似地，核酸或扩增的核酸的区域在本文中可以称为与参考核酸序列对应。本领域技术人员将理解，在各种互补性百分比下可能需要对杂交条件进行各种修改以允许与特定靶序列杂交，而不引起不可接受水平的非特异性杂交。
[0056]
如本文所用，关于dna序列的短语“或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体”(除了参考dna序列之外还)包括dna序列的互补体、参考dna序列的rna等同物、参考dna序列的互补体的rna等同物、参考dna序列的dna/rna嵌合体和参考dna序列的互补体的dna/rna嵌合体。类似地，关于rna序列的短语“或其互补体，或其dna等同物或dna/rna嵌合体”(除了参考rna序列之外还)包括rna序列的互补体、参考rna序列的dna等同物、参考rna序列的互补体的dna等同物、参考rna序列的dna/rna嵌合体和参考rna序列的互补体的dna/rna嵌合体。
[0057]“扩增寡核苷酸”或“扩增寡聚物”是与靶核酸或其互补体杂交并参与核酸扩增反应(例如充当引物或启动子引物)的寡核苷酸。特定的扩增寡聚物含有与靶核酸序列或其互补链的区域互补的至少约10个连续碱基，且任选地至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续碱基。所述连续碱基可以与扩增寡聚物所结合的靶序列至少约80％、至少约90％或完全互补。本领域技术人员将理解，所叙述的范围包括所述范围内的所有整数和有理数(例如，92％或98.377％)。特定的扩增寡聚物长约10至约60个碱基，并且可任选地包含经修饰的核苷酸。
[0058]“引物”是与模板核酸杂交并具有通过聚合延伸的3'端的寡聚物。引物可以任选地被修饰，例如通过包含与靶序列不互补的5'区域。这种修饰可以包括功能性添加，如标签、启动子或其他用于或可用于操纵或扩增引物或靶寡核苷酸的非靶特异性序列。
[0059]
在转录介导的扩增的情境下，用5'启动子序列修饰的引物在本文中称为“启动子引物”。分子生物学或生物化学领域的普通技术人员将理解，可用作引物的寡聚物可以被修饰为包含5'启动子序列，然后用作启动子
‑
引物，并且类似地，任何启动子
‑
引物可以在具有或不具有其5'启动子序列的情况下充当引物。经修饰以并入经封端的3'端的启动子
‑
引物在本文中称为“启动子提供者”，其能够与靶核酸杂交并提供用于起始转录的上游启动子序列，但不提供用于寡核苷酸延伸的引物。
[0060]
如本文所用，“非靶特异性序列”或“非靶杂交序列”是指寡聚物序列的区域，其中所述区域在标准杂交条件下不与靶序列稳定地杂交。具有非靶特异性的寡聚物包括但不限于启动子引物和分子信标。
[0061]“核酸扩增”是指产生靶核酸序列或其互补序列或其片段(即，含有少于完整靶核酸的扩增的序列)的多个拷贝的任何体外程序。核酸扩增程序的例子包括转录相关方法，如转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)和其他方法(例如，美国专利号5,399,491、5,554,516、5,437,990、5,130,238、4,868,105和5,124,246)、复制酶介导的扩增(例如，美国专利号4,786,600)、聚合酶链反应(pcr)(例如，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)、连接酶链反应(lcr)(例如欧洲专利号0320308)、解旋酶依赖性扩增(例如，美国专利号7,282,328)和链置换扩增(sda)(例如，美国专利号5,422,252)。扩增可以是线性的或指数的。复制酶介导的扩增使用自我复制rna分子、和复制酶如qb复制酶。pcr扩增使用dna聚合酶、引物和热循环步骤来合成dna或cdna的两条互补链的多个拷贝。lcr扩增使用至少四个单独的寡核苷酸，通过使用杂交、连接和变性的多个循环来扩增靶标及其互补链。解旋酶依赖性扩增使用解旋酶将dna双链体的两条链分开，产生单链模板，之后序列特异性引物与模板杂交并通过dna聚合酶进行延伸以扩增靶序列。sda使用含有限制性内切酶的识别位点的引物，所述限制性内切酶使包含靶序列的半修饰dna双链体的一条链产生切口，之
后在一系列引物延伸和链置换步骤中扩增。特定的实施方案使用pcr或tma，但是对于本领域普通技术人员而言清楚的是，本文公开的寡聚物可以容易地用作其他扩增方法中的引物。
[0062]
转录相关扩增使用dna聚合酶、rna聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、含启动子的寡核苷酸(并任选地可以包括其他寡核苷酸)以最终从核酸模板产生多个rna转录物(详细描述于以下文献中：例如，授予kacian等人的美国专利号5,399,491和5,554,516；授予burg等人的美国专利号5,437,990；pct公开号wo 88/01302和wo 88/10315(gingeras等人)；授予malek等人的美国专利号5,130,238；授予urdea等人的美国专利号4,868,105和5,124,246；pct公开号wo 94/03472(mcdonough等人)；以及pct公开号wo 95/03430(ryder等人)。先前已详细描述了使用tma的方法(例如，美国专利号5,399,491和5,554,516)。
[0063]
在实时检测扩增子的循环扩增方法中，术语“阈值循环”(ct)是与靶标扩增相关的信号的出现时间的量度，并且通常是标准化报告信号的10倍标准偏差。一旦扩增达到“阈值循环”，通常认为存在探针所结合的序列的阳性扩增产物。然后可以通过本领域技术人员已知的方法确定扩增产物的身份，所述方法如凝胶电泳、核酸测序和其他此类分析程序。
[0064]“扩增子”或“扩增产物”意指在核酸扩增反应中产生并衍生自靶核酸的核酸分子。扩增子或扩增产物含有可以与靶核酸具有相同或相反意义的靶核酸序列。
[0065]
如本文所用，术语“相对荧光单位”(“rfu”)是荧光强度的测量单位。rfu随用于测量的检测手段的特征而变化，并且可以用作比较样品与对照之间的相对强度的测量。
[0066]“检测探针寡聚物”、“检测探针”或“探针”是指在促进核酸杂交的条件下与靶序列(包括扩增的序列)特异性杂交以检测靶核酸的寡聚物。检测可以是直接的(即，探针与靶标直接杂交)或间接的(即，探针与将探针连接至靶标的中间结构杂交)。检测探针可以是dna、rna、其类似物或其组合(例如，dna/rna嵌合体)，并且它们可以是标记的或未标记的。检测探针可以进一步包含交替的骨架连接，例如像2'
‑
o
‑
甲基连接。探针的靶序列通常是指探针所特异性杂交的较大序列内的特定序列。检测探针可以包含一种或多种靶特异性序列和一种或多种非靶特异性序列。此类非靶特异性序列可以包括给出所需二级或三级结构(如发夹结构)的序列，所述序列可以用于促进检测和/或扩增(参见，例如美国专利号5,118,801、5,312,728、6,835,542和6,849,412)。可以通过本领域普通技术人员已知的技术，如通过化学合成、以及通过从重组核酸分子的体外或体内表达来产生定义的序列的探针。
[0067]“杂交(hybridization)”或“杂交(hybridize)”意指两条完全或部分互补的核酸链在指定的杂交测定条件下以平行或反向平行取向聚集在一起形成具有双链区的稳定结构的能力。这种双链结构(有时称为杂交体)的两个组成链通过氢键保持在一起。尽管这些氢键最常见地在单一核酸链上的含有碱基腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶(a和t或u)或胞嘧啶与鸟嘌呤(c和g)的核苷酸之间形成，但在不是这些“规范”对的成员的碱基之间也可以形成碱基配对。非规范碱基配对是本领域熟知的。参见例如r.l.p.adams等人.,the biochemistry of the nucleic acids(第11版1992)。
[0068]“优先杂交”意指在严格的杂交条件下，扩增或检测探针寡聚物可以与其靶核酸杂交以形成稳定的寡聚物:靶标杂交体，但不形成足够数量的稳定的寡聚物:非靶标杂交体。优先与靶核酸杂交的扩增和检测寡聚物可用于扩增和检测靶核酸但不扩增和检测非靶向
的生物体、尤其是在系统发育上密切相关的生物体。因此，与非靶核酸相比，寡聚物与靶核酸的杂交程度足够大，以使本领域普通技术人员能够适当准确地扩增源自指定靶标的核酸和/或检测源自指定靶标的核酸的存在(或不存在)。通常，降低寡核苷酸序列与其靶序列之间的互补性程度将降低寡核苷酸与其靶区域的杂交程度或速率。然而，包含一种或多种非互补核苷或核碱基可以促进寡核苷酸区分非靶生物体的能力。
[0069]
优先杂交可以使用本领域已知的和本文(如在下文提供的实施例中)描述的技术来测量。在一些实施方案中，测试样品中的靶杂交信号与非靶杂交信号之间存在至少10倍的差异、至少100倍的差异或至少1,000倍的差异。在一些实施方案中，测试样品中的非靶杂交信号不超过背景信号水平。
[0070]“严格杂交条件”或“严格条件”意指允许寡聚物优先与靶核酸杂交而不与源自密切相关的非靶核酸的核酸杂交的条件。虽然严格杂交条件的定义没有变化，但可用于严格杂交的实际反应环境可能根据以下因素而有所不同，所述因素包括寡聚物的gc含量和长度、寡聚物序列与测试样品中可能存在的非靶核酸序列之间的相似性程度以及靶序列。杂交条件包括温度和杂交试剂或溶液和组成。当盐浓度(如一价盐例如kcl)在约0.6
‑
0.9m的范围内时，用于用本公开文本的寡聚物扩增和/或检测源自一种或多种gbs血清型的靶核酸的示例性杂交测定条件对应于约60℃的温度。其他可接受的严格杂交条件由本领域普通技术人员容易地确定。
[0071]“测定条件”意指允许寡核苷酸与靶核酸稳定杂交的条件。测定条件不要求寡核苷酸与靶核酸的优先杂交。
[0072]“标记”或“可检测标记”是指被检测或导致可检测信号的与探针直接或间接接合的部分或化合物。直接接合可以使用共价键或非共价相互作用(例如，氢键、疏水或离子相互作用、以及螯合物或配位络合物形成)，而间接接合可以使用放大可检测信号的桥接部分或接头(例如，经由抗体或另外的一种或多种寡核苷酸)。可以使用任何可检测部分，例如放射性核素、配体(如生物素或抗生物素蛋白)、酶、酶底物、反应基团、赋予可检测颜色的生色团(如染料或颗粒(例如，乳胶或金属珠))、发光化合物(例如，生物发光、磷光或化学发光化合物)和荧光化合物(即荧光团)。荧光团的实施方案包括吸收约495nm至650nm范围内的光并发射约520nm至670nm范围内的光的那些，包括被称为fam
tm
、tet
tm
、cal fluor
tm
(橙色或红色)和quasar
tm
化合物的那些。荧光团可以与猝灭剂分子结合使用，所述猝灭剂分子在紧邻荧光团时吸收光以减少背景荧光。此类猝灭剂在本领域中是熟知的，并且包括例如black hole quencher
tm
(或bhq
tm
)或tamra
tm
化合物。特定实施方案包括在均相系统中可检测的“均相可检测标记”，其中混合物中的结合的标记探针与未结合的标记探针相比展现出可检测变化，这使得在无需将杂交标记探针从未杂交标记探针物理去除的情况下检测到标记(例如，美国专利号5,283,174、5,656,207和5,658,737)。特定的均相可检测标记包括化学发光化合物，包括吖啶酯(“ae”)化合物，如熟知的标准ae或ae衍生物(美国专利号5,656,207、5,658,737和5,639,604)。合成标记、将标记附接至核酸以及检测来自标记的信号的方法是熟知的(例如，sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,第2版(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,纽约州,1989)在第10章，和美国专利号5,658,737、5,656,207、5,547,842、5,283,174和4,581,333，以及欧洲专利申请0 747 706)。将ae化合物与核酸连接的特定方法是已知的(例如，美国专利号5,585,481和美
国专利号5,639,604，参见第10栏第6行至第11栏第3行，以及实施例8)。特定ae标记位置是探针的中心区并在近a/t碱基对的区域附近，在探针的3'或5'末端，或在与所需靶序列相比探针应不检测的与已知序列的错配位点处或附近。其他可检测标记探针包括taqman
tm
探针、分子火炬和分子信标。taqman
tm
探针包括供体和受体标记，其中在扩增过程中酶促降解探针以将荧光团从猝灭剂的存在中释放后，检测到荧光。分子火炬和分子信标以开放和封闭构型存在，其中封闭构型使荧光团猝灭，并且开放位置使荧光团与猝灭剂分开，以允许产生荧光。与靶标的杂交打开了原本封闭的探针。
[0073]
如果序列允许两个核酸序列(例如探针和靶序列的稳定杂交体)的稳定杂交，则它们是“足够互补的”，但所述序列不必完全互补。也就是说，“足够互补”序列通过使用标准碱基配对(例如，g:c、a:t或a:u)经由互补核苷酸的子集系列之间的氢键合与另一个序列杂交，但所述两个序列可能含有一个或多个不互补的残基(包括无碱基位置)，只要整个序列在适当的杂交条件下形成稳定的杂交复合物即可。足够互补的序列可以是杂交在一起的序列中的至少约80％、至少约90％或完全互补。适当的杂交条件是本领域技术人员熟知的，可以基于序列组成来预测，或者可以通过使用常规测试凭经验确定(例如，sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,第2版在
§§
1.90
‑
1.91、7.37
‑
7.57、9.47
‑
9.51和11.47
‑
11.57，特别是
§§
9.50
‑
9.51、11.12
‑
11.13、11.45
‑
11.47和11.55
‑
11.57)。
[0074]“不可延伸的”寡聚物在其3'末端处或附近包含封端部分以防止延伸。在一些实施方案中，在3'端附近的封端基团在3'端的五个残基之内，并且足够大以限制聚合酶与寡聚物的结合，并且其他实施方案含有共价附接至3'末端的封端基团。可以使用许多不同的化学基团来对3'端进行封端，所述化学基团例如烷基基团、非核苷酸接头、烷烃
‑
二醇二脱氧核苷酸残基和虫草素。封端部分的另外例子包括3'
‑
脱氧核苷酸(例如，2',3'
‑
二脱氧核苷酸)；3'
‑
磷酸化核苷酸；荧光团、猝灭剂或其他干扰延伸的标记；倒置的核苷酸(例如，通过3'至3'磷酸二酯与前面的核苷酸连接，任选地具有暴露的5'
‑
oh或磷酸酯)；或与寡核苷酸结合以防止通过聚合酶进一步延伸新生核酸链的蛋白质或肽。本公开文本的不可延伸的寡核苷酸的长度可以是至少10个碱基，并且长度可以多达15、20、25、30、35、40、50或更多个核苷酸。包含可检测标记的不可延伸的寡核苷酸可用作探针。
[0075]
特别是在权利要求中，提及“seq id no:x的序列”是指相应序列表条目的碱基序列，并且不要求骨架的身份(例如，rna、2'
‑
o
‑
me rna或dna)或碱基修饰(例如，胞嘧啶残基的甲基化)，除非上下文另外明确指出。
[0076]“样品制备”是指处理样品以用于随后扩增和/或检测样品中存在的gbs核酸的任何步骤或方法。样品可以是组分的复杂混合物，其中靶核酸是少数组分。样品制备可以包括从较大样品体积浓缩组分(如微生物或核酸)的任何已知方法，例如通过从较大体积样品过滤气载或水载颗粒或通过使用标准微生物学从样品分离微生物。样品制备可以包括物理破坏和/或化学裂解细胞组分以将细胞内组分释放到基本上水性或有机的相中，并如通过使用过滤、离心或吸附去除碎片。样品制备可以包括使用核酸寡核苷酸，所述核酸寡核苷酸选择性地或非特异性地捕获靶核酸并将其与其他样品组分分离(例如，如美国专利号6,110,678和国际专利申请公开号wo 2008/016988中所述，将每篇文献通过引用并入本文)。
[0077]“分离”或“纯化”意指将样品的一种或多种组分从其他样品组分去除或分离。样品组分包括通常在总体上水性溶液相中的靶核酸，其还可以包括细胞片段、蛋白质、碳水化合
物、脂质和其他核酸。“分离”或“纯化”并不暗示纯化的任何程度。通常，分离或纯化将至少70％、或至少80％或至少95％的靶核酸从其他样品组分去除。
[0078]
如本文所用，术语“非线性表面活性剂”意指具有支链结构的表面活性剂。非线性表面活性剂可以包含一个或多个环结构，所述一个或多个环结构可以例如在主链和/或一个或多个支链中。示例性非线性表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60和洋地黄皂苷。在某些变型中，非线性表面活性剂是非离子型的。
[0079]
在扩增和/或检测系统的情境下，术语“特异性”在本文中用于指系统的特征，所述特征描述了其根据序列和测定条件区分靶序列和非靶序列的能力。就核酸扩增而言，特异性通常是指产生的特异性扩增子数量与副产物数量的比率(例如，信噪比)。就检测而言，特异性通常是指从靶核酸产生的信号与从非靶核酸产生的信号的比率。
[0080]
术语“敏感性”在本文中用于指核酸扩增反应可以被检测或定量的精度。扩增反应的敏感性通常是可以在扩增系统中可被可靠地检测到的靶核酸最小拷贝数的量度，并且将取决于例如所采用的检测测定和扩增反应的特异性，例如特异性扩增子与副产物的比率。
具体实施方式
[0081]
本发明提供了用于从样品扩增和检测b群链球菌(gbs；无乳链球菌)核酸的组合物、试剂盒和方法。优选地，所述样品是生物样品。所述组合物、试剂盒和方法提供了识别gbs基因组的靶序列的寡核苷酸序列，所述靶序列包括gbs血清型ia、ib、ic、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii和ix的靶序列，或其互补序列。此类寡核苷酸可以用作扩增寡核苷酸，所述扩增寡核苷酸可以包括引物、启动子引物、经封端的寡核苷酸和启动子提供者寡核苷酸，其功能先前已经描述(参见例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159；5,399,491；5,554,516；5,824,518；和7,374,885；每篇文献均通过引用并入本文)。其他寡核苷酸可以用作用于检测gbs的扩增的序列、或用于捕获gbs靶核酸的探针。
[0082]
所述方法提供了对gbs核酸的敏感性和特异性检测。所述方法包括进行gbs靶区域的核酸扩增，并通过例如以下方式来检测扩增的产物：将扩增的产物与提供用于指示样品中gbs的存在的信号的核酸检测探针特异性杂交。所述扩增步骤包括使样品与一种或多种对gbs靶核酸中的靶序列具有特异性的扩增寡聚物接触，以在样品中存在gbs核酸时产生扩增的产物。扩增通过以下方式来合成靶序列或其互补体的另外拷贝：使用至少一种核酸聚合酶和扩增寡聚物从模板链产生拷贝(例如，通过使用模板链从引物延伸序列)。用于检测扩增的产物的一个实施方案使用杂交步骤，所述杂交步骤包括使扩增的产物与至少一种检测探针寡聚物接触，所述至少一种检测探针寡聚物对由所选择的扩增寡聚物扩增的序列(例如，靶序列中含有的侧接有一对所选择的扩增寡聚物的序列)具有特异性。
[0083]
本发明的优选组合物被配置为与所有gbs血清型ia、ib、ic、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii和ix特异性杂交，而与怀疑在样品中的其他非gbs核酸(例如其他细菌病原体)具有最小交叉反应性。在某些变型中，本发明的组合物进一步允许检测gbs的非溶血性菌株上的序列。在一些方面，本发明的组合物被配置为与gbs核酸特异性杂交，而与表9
‑
表11、表15、表16、表20和表22中的任一个中列出的一种或多种非gbs病原体具有最小交叉反应性(参见下文实施例)。在一方面，本发明的组合物是多路化系统的一部分，所述多路化系统进一步包括用于检测这些非gbs病原体中的一种或多种的组分和方法。
[0084]
在本发明的某些方面，提供了包含至少两种扩增寡聚物的组合物，用于确定样品中gbs的存在或不存在。通常，所述组合物包含至少两种扩增寡聚物以用于扩增与seq id no:1(sip基因)或seq id no:2(cfb基因)的序列对应的gbs靶核酸的靶区域。在此类实施方案中，至少一种扩增寡聚物包含有义取向的靶杂交序列(“有义ths”)，并且至少一种扩增寡聚物包含反义取向的靶杂交序列(“反义ths”)，其中有义ths和反义ths各自被配置为与对应于在seq id no:1或seq id no:2内含有的序列的gbs靶序列特异性杂交，并且其中选择靶杂交序列以使得被反义ths靶向的gbs序列位于被有义ths靶向的gbs序列的下游(即，所述至少两种扩增寡聚物的位置使得它们侧接待扩增靶区域)。
[0085]
在一些变型中，组合物包含(i)sip特异性扩增寡聚物，所述sip特异性扩增寡聚物包含与如下序列基本上对应或相同的sip特异性靶杂交序列：seq id no:3、seq id no:4、seq id no:7、或seq id no:8中所示的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在一些变型中，组合物包含(ii)cfb特异性扩增寡聚物，所述cfb特异性扩增寡聚物包含具有约17至约24个连续核苷酸并且与seq id no:26的序列中含有的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的cfb特异性靶杂交序列；在一些此类实施方案中，所述cfb特异性靶杂交序列包括与seq id no:28或seq id no:27的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的序列(例如，与seq id no:12或seq id no:14中所示的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的序列)，或者是与seq id no:18中所示的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的序列。在一些变型中，组合物包含(iii)cfb特异性扩增寡聚物，所述cfb特异性扩增寡聚物包含与如下序列基本上对应或相同的cfb特异性靶杂交序列：seq id no:13、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:20或seq id no:21中所示的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体。在包含如上所述(i)、(ii)或(iii)的sip特异性或cfb特异性扩增寡聚物的变型中，所述寡聚物组合包含至少一种扩增寡聚物，所述至少一种扩增寡聚物包含具有与(i)、(ii)或(iii)的寡聚物的靶杂交序列相反的极性(有义与反义，或反之亦然)的sip特异性或cfb特异性靶杂交序列，使得至少两种扩增寡聚物侧接待扩增的靶区域。在某些实施方案中，所述组合物以用于扩增gbs核酸的水性或干燥配制品或包含这种配制品或从这种配制品重构的反应混合物的形式提供。
[0086]
在本发明的更具体实施方案中，用于确定样品中gbs的存在或不存在的组合物包括(1)至少一种扩增寡聚物，所述至少一种扩增寡聚物包含与下表1中所描绘的至少一种有义寡聚物序列基本上对应的sip特异性或cfb特异性靶杂交区；和(2)至少一种扩增寡聚物，所述至少一种扩增寡聚物包含与表1中描绘的至少一种反义寡聚物序列基本上对应的sip特异性或cfb特异性靶杂交区。在一些此类实施方案中，所述组合物包括上文(1)的第一sip特异性扩增寡聚物和第一cfb特异性扩增寡聚物，以及上文(2)的第二sip特异性和第二cfb特异性扩增寡聚物。在特定变型中，扩增寡聚物组合的一种或多种有义和/或反义靶杂交序列包含选自表1的一种或多种有义和/或反义序列或由其组成。表1：用于扩增gbs sip或cfb靶区域的示例性有义和反义扩增寡聚物靶杂交序列
1
这些序列的有义/反义名称仅用于示例性的目的。这种名称并不一定将序列限制为伴随的名称。
[0087]
在某些变型中，如本文所述的用于确定样品中gbs的存在或不存在的组合物进一步包含至少一种检测探针寡聚物，所述至少一种检测探针寡聚物被配置为与可使用所述第一和第二扩增寡聚物扩增的gbs sip或cfb靶序列(例如，侧接有所述第一和第二扩增寡聚物的靶杂交序列的在seq id no:1或seq id no:2内含有的sip或cfb靶序列或其互补体)特异性杂交。特别合适的sip特异性检测探针寡聚物包括例如包含与seq id no:9或seq id no:11中所示的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的sip特异性靶杂交序列的寡聚物。特别合适的cfb特异性检测探针寡聚物包括例如包含与seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24或seq id no:25中所示的序列、或其互补体、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的cfb特异性靶杂交序列的寡聚物。检测探针寡聚物可以在核酸骨架中的一个或多个连接处含有2'
‑
甲氧基骨架。在一些变型中，组合物包含至少两种检测探针寡聚物。在某些实施方案中，检测探针寡聚物以用于检测gbs核酸的水性或干燥配制品或包含这种配制品或从这种配制品重构的反应混合物的形式提供。
[0088]
通常，根据本发明的检测探针寡聚物进一步包含标记。特别合适的标记包括发射可检测光信号的化合物，例如可以在均相混合物中检测到的荧光团或发光(例如，化学发光)化合物。特定探针上可能存在超过一个标记和超过一种类型的标记，或者检测可能依赖于使用探针混合物，其中每种探针均被产生可检测信号的化合物标记(参见例如，美国专利号6,180,340和6,350,579，将每篇文献均通过引用并入本文)。可以将标记通过各种手段(包括共价连接、螯合和离子相互作用)附接至探针，但是优选地是将标记共价附接。例如，在一些实施方案中，检测探针具有附接的化学发光标记，例如像吖啶酯(ae)化合物(参见例如，美国专利号5,185,439；5,639,604；5,585,481和5,656,744；将每篇文献均通过引用并入本文)。通常将标记(例如像荧光或化学发光标记)通过非核苷酸接头附接至探针(参见例如，美国专利号5,585,481；5,656,744；和5,639,604，特别是在第10栏第6行至第11栏第3行，以及实施例8；将每篇文献通过引用并入本文)。
[0089]
在一些实施方案中，探针(例如，包含荧光标记)进一步包含与所述第一标记相互作用的第二标记。例如，所述第二标记可以是猝灭剂。同时包含荧光标记和猝灭剂的检测探针在荧光共振能量转移(fret)测定中是特别有用的。此类检测探针的具体变型包括例如taqman
tm
检测探针(roche molecular diagnostics)和“分子信标”(参见例如，tyagi等人,nature biotechnol.16:49
‑
53,1998；美国专利号5,118,801和5,312,728；将每篇文献均通过引用并入本文)。taqman
tm
探针(或同时包含荧光标记和猝灭剂的类似双重标记线性探针)可用于测定中，其中将探针与靶标或扩增子杂交、之后通过包含5'
‑
3'核酸外切酶活性的聚合酶进行核酸降解导致荧光标记释放且从而导致增加的荧光、或脱离与第二标记相互作用的荧光。
[0090]
在一些应用中，使用展现出至少某种程度的自我互补性的检测探针来促进对测试样品中的探针:靶双链体的检测，而无需在检测之前首先去除未杂交探针。此类检测探针的具体实施方案包括例如形成通过分子内杂交保持的构象(如通常称为发夹的构象)的探针。合适的发夹探针包括“分子火炬”(参见例如，美国专利号6,849,412；6,835,542；6,534,274；和6,361,945)和“分子信标”(参见例如，美国专利号5,118,801和美国专利号5,312,728)。分子火炬包括互补的不同区域(称为“靶结合结构域”和“靶闭合结构域”)，所述不同区域通过接合区(例如，
‑
(ch2ch2o)3‑
接头)连接并且在预定的杂交测定条件下彼此杂交。当暴露于适当的靶标或变性条件时，分子火炬的两个互补区(其可能是完全或部分互补的)解链，从而当恢复预定的杂交测定条件时使靶结合结构域可用于与靶序列杂交。分子火炬被设计为使得靶结合结构域相比于靶闭合结构域有利于与靶序列杂交。分子火炬的靶结合结构域和靶闭合结构域包括相互作用的标记(例如荧光/猝灭剂)，所述相互作用的标记被定位成使得当分子火炬自我杂交时相对于当分子火炬与靶核酸杂交时产生不同的信号，从而允许在存在具有与其缔合的有活力标记的未杂交探针的情况下检测到测试样品中的探针:靶双链体。
[0091]
在其他实施方案中，检测探针是基本上不形成由分子内键保持的构象的线性寡聚物。在具体变型中，线性检测探针寡聚物包含化学发光化合物作为标记(例如，吖啶酯(ae)化合物)。在其他实施方案中，线性检测探针寡聚物包含荧光团作为标记。在包含荧光团的线性检测探针寡聚物的一些实施方案中，所述寡聚物进一步包含猝灭部分(例如，taqman探针)。
[0092]
在不试图区分fret与非fret对的情况下，可以结合本公开文本使用的相互作用供体/受体标记对的例子包括荧光素/四甲基罗丹明、iaedans/荧光素(fluororescein)、edans/dabcyl、香豆素/dabcyl、荧光素/荧光素、bodipy fl/bodipy fl、荧光素/dabcyl、萤光黄/dabcyl、bodipy/dabcyl、曙红/dabcyl、赤藓红/dabcyl、四甲基罗丹明/dabcyl、德克萨斯红/dabcyl、cy5/bh1、cy5/bh2、cy3/bh1、cy3/bh2和荧光素/qsy7染料。本领域普通技术人员将理解，当供体和受体染料不同时，可以通过出现受体的敏化荧光或通过猝灭供体荧光来检测能量转移。非荧光受体(如dabcyl和qsy7染料)有利地消除了由直接(即非敏化)受体激发引起的背景荧光的潜在问题。可用作供体
‑
受体对中的一个成员的示例性荧光团部分包括荧光素、rox和cy染料(如cy5)。可以用作供体
‑
受体对中的另一成员的示例性猝灭剂部分包括dabcyl和black hole quencher部分，它们可以从biosearch technologies,inc.(诺瓦托,加利福尼亚州)获得。
no:7或者与seq id no:7、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第一sip特异性靶杂交序列，和(b)作为seq id no:8或者与seq id no:8、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第二sip特异性靶杂交序列。
[0099]
在其他实施方案中，待扩增的靶区域是如下gbs cfb靶区域，其与seq id no:2的从约核苷酸位置38至约核苷酸位置151、从约核苷酸位置22至约核苷酸位置151、从约核苷酸位置192至约核苷酸位置329、或从约核苷酸位置585至约核苷酸位置716基本上对应。本文描述了用于扩增这些gbs cfb靶区域的特别合适的寡聚物组合。例如，在一些实施方案中，用于扩增cfb靶区域的扩增寡聚物组合包含第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含(a)作为约17至约24个连续核苷酸并且与seq id no:26的序列中含有的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的第一cfb特异性靶杂交序列，和(b)作为seq id no:13或seq id no:15或者与seq id no:13或seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第二cfb特异性靶杂交序列；在(a)的这种第一cfb特异性靶杂交序列的更具体的变型中，所述cfb特异性靶杂交序列选自(i)与seq id no:28或seq id no:27的序列、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应或相同的序列(例如，作为seq id no:12或seq id no:14的序列或者与seq id no:12或seq id no:14、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列)，和(ii)作为seq id no:18的序列或者与seq id no:18、其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列。在其他实施方案中，用于扩增cfb靶区域的扩增寡聚物组合包括第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含(a)作为seq id no:16或者与seq id no:16、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第一cfb特异性靶杂交序列，和(b)作为seq id no:17或者与seq id no:17、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第二cfb特异性靶杂交序列。在其他实施方案中，用于扩增cfb靶区域的扩增寡聚物组合包括第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含(a)作为seq id no:18或者与seq id no:18、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第一cfb特异性靶杂交序列，和(b)作为seq id no:15或者与seq id no:15、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第二cfb特异性靶杂交序列。在其他实施方案中，用于扩增cfb靶区域的扩增寡聚物组合包括第一和第二cfb特异性扩增寡聚物，所述第一和第二cfb特异性扩增寡聚物分别包含(a)作为seq id no:20或者与seq id no:20、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第一cfb特异性靶杂交序列，和(b)作为seq id no:21或者与seq id no:21、或其rna等同物或dna/rna嵌合体基本上对应的序列的第二cfb特异性靶杂交序列。
[0100]
根据本公开文本的检测方法可以进一步包括以下步骤：获得待经受所述方法的后续步骤的样品。在某些实施方案中，“获得”待使用的样品包括例如在进行所述方法的一个或多个步骤的测试设施或其他位置处接收样品，和/或从进行所述方法的一个或多个步骤的设施内的位置(例如，从储存处或其他存放处)取回样品。
[0101]
在某些实施方案中，所述方法进一步包括例如在扩增之前(如在捕获步骤之前)从样品中的其他组分纯化gbs靶核酸。这种纯化可以包括以下方法：从其他样品组分分离和/或浓缩样品中含有的生物体，或去除或降解非核酸样品组分，例如蛋白质、碳水化合物、盐、脂质等。在一些实施方案中，将样品中的dna例如用用dna酶降解，并任选地去除或灭活dna
酶或去除降解的dna。
[0102]
在特定实施方案中，纯化靶核酸包括捕获靶核酸以将靶核酸与其他样品组分特异性或非特异性地分离。非特异性靶标捕获方法可能涉及从基本上水性的混合物选择性地沉淀核酸；将核酸粘附至支持物，洗涤所述支持物以去除其他样品组分；或从含有gbs核酸和其他样品组分的混合物物理地分离核酸的其他手段。
[0103]
靶标捕获通常发生在溶液相混合物中，所述溶液相混合物含有在杂交条件下与gbs sip或cfb靶序列杂交的一种或多种捕获探针寡聚物。对于包含捕获探针尾的实施方案，通过调节杂交条件使得捕获探针尾与固定化探针杂交来捕获gbs靶标:捕获探针复合物。某些实施方案使用微粒固体支持物，如顺磁珠。
[0104]
可以在捕获之后进行分离，其中例如将固体支持物上的复合物与其他样品组分分离。分离可以通过任何适当的技术来完成，例如，将与gbs sip或cfb靶序列缔合的支持物洗涤一次或多次(例如，两次或三次)以去除其他样品组分和/或未结合的寡聚物。在使用微粒固体支持物(如顺磁珠)的一些实施方案中，可以将与gbs靶标缔合的颗粒悬浮在洗涤溶液中并且在一些实施方案中通过利用磁吸引从洗涤溶液取回。为了限制操作步骤的数量，可以通过以下方式来扩增gbs sip或cfb靶核酸：将支持物上的复合物中的gbs靶序列与扩增寡聚物简单混合并继续进行扩增步骤。
[0105]
指数扩增gbs靶序列利用使用侧接待扩增的靶区域的至少两种扩增寡聚物的体外扩增反应。在一些实施方案中，提供了如本文所述的至少第一和第二寡聚物。在一些实施方案中，提供了多个寡聚物对；在一些此类变型中，多个寡聚物对包括被配置为与至少两种gbs靶核酸杂交的寡聚物对(例如，至少一个寡聚物对被配置为与sip靶核酸杂交并且至少一个寡聚物对被配置为与cfb靶核酸杂交)。所述扩增反应可以是循环的或等温的。合适的扩增方法包括例如复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(pcr)、连接酶链反应(lcr)、链置换扩增(sda)和转录介导或转录相关的扩增(tma)。
[0106]
可以使用多种已知技术中的任何一种来进行检测步骤以检测与扩增的靶序列特定相关的信号，例如像通过使扩增产物与标记的检测探针杂交并检测由标记的探针(在一些实施方案中，包括由杂交后从探针释放的标记)产生的信号来检测。在一些实施方案中，如上所述，所述标记的探针包含第二部分，如猝灭剂或与第一标记相互作用的其他部分。检测步骤还可以提供关于扩增的序列(例如像其核酸碱基序列的全部或一部分)的另外信息。检测可以在扩增反应完成之后进行，或者可以与扩增靶区域同时进行，例如实时地进行。在一个实施方案中，检测步骤允许均相检测，例如，在无需从混合物去除未杂交探针的情况下检测杂交探针(参见例如，美国专利号5,639,604和5,283,174)。在一些实施方案中，将核酸与导致物理变化(如可检测电性变化)的表面缔合。可以通过以下方式来检测扩增的核酸：将所述扩增的核酸浓缩在基质中或基质上并且检测核酸或与其缔合的染料(例如，嵌入剂如溴化乙锭或cyber绿)，或检测与溶液相中核酸缔合的染料的增加。其他检测方法可以使用被配置为与扩增的产物中的序列特异性杂交并检测探针:产物复合物的存在的核酸检测探针，或者通过使用可以放大与扩增的产物相关的可检测信号的探针复合物(例如，美国专利号5,424,413、5,451,503和5,849,481；将每篇文献均通过引用并入本文)。与扩增的产物特异性缔合的直接或间接标记的探针提供了指示样品中靶核酸的存在的可检测信号。特别地，扩增的产物将含有gbs sip或cfb基因中的靶序列或含有与gbs sip或cfb基因中的序列
互补的靶序列，并且探针将直接或间接与扩增的产物中含有的序列结合，以指示测试样品中gbs核酸的存在。
[0107]
在扩增步骤接近结束或结束时检测扩增的产物的实施方案中，线性检测探针可用于提供指示探针与扩增的产物的杂交的信号。这种检测的一个例子是使用与靶核酸杂交的发光标记探针。然后将发光标记从未杂交探针水解。使用光度计通过化学发光进行检测。(参见例如，国际专利申请公开号美国专利号wo 89/002476，将所述文献通过引用并入本文)。在使用实时检测的其他实施方案中，所述检测探针可以是用报告部分标记的发夹探针，例如像分子信标、分子火炬或杂交开关探针(例如，包含荧光标记和猝灭部分两者的双重标记发夹探针)，所述报告部分在探针与扩增的产物结合时被检测到。在用于实时检测的其他实施方案中，所述检测探针是线性寡聚物，例如像用荧光团和猝灭部分两者标记的寡聚物(例如taqman探针)。此类探针可以包含靶杂交序列和非靶杂交序列。先前已经描述了各种形式的此类探针(参见例如，美国专利号5,210,015、5,487,972、5,118,801、5,312,728、5,925,517、6,150,097、6,849,412、6,835,542、6,534,274和6,361,945；以及美国专利申请公开号20060068417a1和20060194240a1；将每篇文献通过引用并入本文)。
[0108]
用于检测gbs核酸的测定可以任选地包括非gbs内部对照(ic)核酸，所述非gbs内部对照核酸在同一测定反应混合物中通过使用对ic序列具有特异性的扩增和检测寡聚物来扩增和检测。ic核酸序列可以是例如掺加至样品中的dna质粒、rna模板序列(例如，体外转录物)或合成核酸。可替代地，ic核酸序列可以是细胞组分，所述细胞组分可以来自相对于样本的外源细胞来源或内源细胞来源。在这些情况下，将内部对照核酸与gbs核酸在扩增反应混合物中共扩增。可以独立地检测内部对照扩增产物和gbs靶序列扩增产物。
[0109]
在某些实施方案中，对来自扩增的ic序列的信号的放大和检测证明，如果未获得预期的靶gbs核酸(例如gbs测试为阴性的样品)的信号，则测定试剂、条件和测定步骤的进行在测定中的使用是适当的。当需要定量结果时，也可以将ic用作测定的内标物，即，使用从ic扩增和检测获得的信号来设定基于对于扩增的gbs靶序列获得的信号定量样品中gbs核酸的量的算法中使用的参数。ic也可用于监测测定中一个或多个步骤的完整性。通过使用任何熟知的方法来配置和合成用于ic靶序列的引物和探针，前提条件是引物和探针的作用是使用与用于扩增和检测gbs靶序列的基本上相同的测定条件来扩增ic靶序列和检测扩增的ic序列。在包括基于靶标捕获的纯化步骤的优选实施方案中，优选的是，在测定的靶标捕获步骤中包括对ic靶标具有特异性的靶标捕获探针，使得在所述测定中对ic以与在全部测定步骤中针对预期gbs分析物的处理方式类似的方式来处理。
[0110]
本发明还提供了用于确定样品中gbs的存在或不存在的配制品。在一些实施方案中，所述配制品是水性配制品，所述水性配制品包含(1)如本文所述的用于扩增sip或cfb靶区域的至少两种sip特异性或cfb特异性扩增寡聚物和(2)有机缓冲液。用于扩增gbs核酸的水性配制品可以包含一种或多种另外的组分，例如像dna聚合酶、逆转录酶或检测探针寡聚物。在一些实施方案中，配制品是水性配制品，所述水性配制品包含(1)如本文所述的sip特异性和/或cfb特异性检测探针寡聚物和(2)有机缓冲液。包含一种或多种检测探针寡聚物的水性配制品可以包含一种或多种另外的组分，例如像表面活性剂、dna聚合酶、逆转录酶或至少一种扩增寡聚物。特别合适的表面活性剂包括例如聚乙二醇单[4
‑
(1,1,3,3
‑
四甲基丁基)苯基]醚和聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯40或聚山梨
酯60)。在一些实施方案中，水性检测探针配制品中的表面活性剂是非线性表面活性剂，例如像聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯40或聚山梨酯60)或洋地黄皂苷。用于扩增或检测gbs核酸的如上所述水性配制品可以进一步包含增量剂，例如像海藻糖、棉子糖或其组合。在一些实施方案中，如上所述水性配制品含有无机盐，例如像镁、钾或钠；在一些此类变型中，所述无机盐的浓度为4mm或更小。用于如上所述水性配制品的特别合适的有机缓冲液是tris(2
‑
氨基
‑2‑
(羟甲基)
‑
1,3
‑
丙二醇)。
[0111]
在相关方面，为了长期储存，将如本文所述的水性配制品等分到例如小瓶、安瓿或其他容器中，并可以根据本领域已知的程序进行干燥(例如，冻干)。干燥产品通常以粉末或饼的形式呈现。然后将容器密封。由水性配制品制备此类干燥配制品的方法以及通过此类方法制备的干燥配制品是本发明的另外方面。在又另一方面，本发明提供了一种干燥配制品，所述干燥配制品能够重构为如本文所述的水性配制品。除了一种或多种如本文所述的扩增寡聚物和/或检测探针之外，用于扩增或检测gbs核酸的干燥配制品通常还含有增量剂，例如像海藻糖、棉子糖或其组合。在进一步包含无机盐的一些实施方案中，所述无机盐质量相对于所述干燥配制品的质量的百分比为0.249％或更小、0.222％或更小或0.195％或更小。由如本文所述的冻干配制品制备干燥配制品的方法也被本发明所涵盖；此类方法通常包括将干燥配制品溶解在合适的稀释剂(例如，有机缓冲液或水)中以提供重构的配制品。
[0112]
本发明还提供了一种用于确定样品中gbs靶核酸的存在或不存在的反应混合物。根据本公开文本的反应混合物包含以下中的一种或两种：(1)如本文所述的用于扩增gbs sip和/或cfb靶核酸的寡聚物组合和(2)如本文所述的用于确定gbs sip和/或cfb扩增产物的存在或不存在的一种或多种检测探针寡聚物。所述反应混合物可以进一步包含多种任选组分，例如像捕获探针，例如，如us 2013/0209992中所述的聚
‑
(k)捕获探针，将所述文献通过引用并入本文。对于扩增反应混合物，所述反应混合物通常将包含其他适合进行体外扩增的试剂，例如像缓冲液、盐溶液、适当的核苷酸三磷酸(例如，datp、dctp、dgtp和dttp；和/或atp、ctp、gtp和utp)和/或酶(例如，热稳定的dna聚合酶或逆转录酶和/或rna聚合酶)，并且通常将包含测试样品组分，其中可能存在或可能不存在gbs靶核酸。反应混合物可以包含用于gbs基因组的仅一个靶区域的扩增寡聚物，或者它可以包含用于多个gbs靶区域(例如，sip靶区域和cfb靶区域两者)的扩增寡聚物。此外，对于包含检测探针和扩增寡聚物组合的反应混合物，用于反应混合物的扩增寡聚物和检测探针寡聚物的选择通过共同的靶区域联系起来(即，反应混合物将包含与可通过反应混合物的扩增寡聚物组合扩增的序列结合的探针)。在一些实施方案中，反应混合物包含如上所述的水性配制品。在一些实施方案中，反应混合物是用水或有机缓冲液从如上所述的干燥配制品重构的。
[0113]
本发明还提供了用于实施如本文所述方法的试剂盒。根据本公开文本的试剂盒包含以中的一种或两种：(1)如本文所述的用于扩增gbs sip和/或cfb靶核酸的寡聚物组合和(2)如本文所述的用于确定gbs sip和/或cfb扩增产物的存在或不存在的一种或多种检测探针寡聚物。在一些实施方案中，本文所述的任何寡聚物组合存在于所述试剂盒中。所述试剂盒可以进一步包含多种任选组分，例如像捕获探针，例如，如us 2013/0209992中所述的聚
‑
(k)捕获探针。所述试剂盒中可能存在的其他试剂包含适合进行体外扩增的试剂，例如像缓冲液、盐溶液、适当的核苷酸三磷酸(例如，datp、dctp、dgtp、dttp；和/或atp、ctp、gtp
和utp)和/或酶(例如，热稳定的dna聚合酶或逆转录酶和/或rna聚合酶)。如本文所述的寡聚物可以包装在多种不同的实施方案中，并且本领域技术人员将理解，本公开文本涵盖括许多不同的试剂盒配置。例如，试剂盒可以包含用于gbs基因组的仅一个靶区域的扩增寡聚物，或者它可以包括用于多个gbs靶区域(例如，sip靶区域和cfb靶区域两者)的扩增寡聚物。此外，对于包含检测探针和扩增寡聚物组合的试剂盒，用于试剂盒的扩增寡聚物和检测探针寡聚物的选择通过共同的靶区域联系起来(即，所述试剂盒将包含与可通过所述试剂盒的扩增寡聚物组合扩增的序列结合的探针)。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于实施根据本公开文本的方法的一套说明书，其中说明书可以与包装插页和/或所述试剂盒或其组分的包装相关联。
[0114]
本发明通过以下非限制性实施例进一步说明。实施例1
[0115]
针对体外无乳链球菌(gbs)检测评价如表2中所示的17种引物和探针组合。表2：引物和探针组合
[0116]
材料和方法.作为输入材料，使用了来自临床培养物的不明确gbs血清型。其是使用magna pure 96系统(roche)在多次重复实验中提取的。提取后，通过od 260/280测量来测定dna的浓度。pcr在applied biosystems(abi)7500快速实时系统上进行。使用的pcr概况如下：表3：pcr概况
[0117]
在不向样品添加内部对照的情况下测试所有样品。使用一种浓度的gbs靶核酸(在pcr中1000个拷贝/μl)并在四个重复实验中进行测试。引物的浓度固定为600nm，并且探针浓度为200nm。
[0118]
结果.针对不同引物/探针组合的ct和阳性反应数量示于表4中。报告的ct是相对荧光单位(rfu)信号超过设定的rfu阈值时的循环。表4组合ct(平均值)阳性数量124.814/42/0/4325.664/4425.694/4527.514/4624.724/4726.793/4824.964/4927.624/41025.254/41127.603/41225.504/41319.923/41427.654/41526.033/41625.624/41724.954/4
[0119]
对于每个靶基因，基于该数据选择引物和探针的两种组合以用于进一步评价。对于cfb，组合12和17显示出最低ct与最高rfu的组合。对于sip，选择组合1和3。关于较低浓度的gbs靶核酸测试这些组合，从而允许更好的区分。表5中所示的结果是在测试pcr中1、10和100个拷贝/μl时获得的。表5
[0120]
还在不同的引物/探针浓度(600/200nm、400/150nm和300/100nm)的情况下关于1和10个拷贝/μl测试组合1、3、12和17。表6示出了使用这些不同浓度获得的结果。表6
[0121]
结论.基于上文汇总的结果，选择引物/探针组合3和17(分别用于sip和cfb靶基因)以进一步评价敏感性和特异性。这些引物组合能够在每个pcr反应中36
‑
37的ct下检测到五(5)个理论拷贝。实施例2
[0122]
对于内部对照的检测，评价了两种引物和探针组合：具有如表7中所示的引物和探针序列的sd
‑
plp/gic组合和新gic组合。第一步是检查当使用cy5作为荧光团时哪个寡聚核苷酸组以及在哪个浓度下给出最佳结果。第二步集中于用705染料选择浓度。在自动化panther fusion系统上，cy5染料产生低信号，并且应使用quasar705染料检测。因为cy5的信号不同于quasar705产生的信号，所以重新评价了引物和探针的浓度。表7：内部控制引物和探针表7：内部控制引物和探针
[0123]
kingfisher
tm
提取后，在abi 7500快速实时pcr系统上进行对引物和探针的初始测
试。使用了三种不同的引物/探针浓度：600/200nm、400/150nm和300/100nm。此外，当存在gbs靶标(血清型ii和iv：从chu de li
è
ge获得的菌株)时，将ic寡核苷酸与sip寡核苷酸组合测试。ic测试的第二步是在能够检测cy5和quasar705两者的biorad cfx
‑
96qpcr装置上进行的。最初，与cy5组合对比测试了quasar705组合，以确定引物和探针的最终浓度。
[0124]
初始测试的数据显示，与sd
‑
plp/gic组合相比，新gic组合提供了更高的信号。在存在sip引物(600/200nm)和不同gbs类型(10^6、10^5、10^4稀释度的ii和iv血清型)的情况下，进一步测试新gic组合(300/100nm)。该测试的数据显示，ic引物和探针的存在对gbs检测没有显著影响。同样地，ic信号不受更高浓度的gbs的存在的影响。基于数据，选择600/200nm下的sip组合(fam)与300/100nm下的ic新gic组合(cy5)的组合。
[0125]
在biorad cfx
‑
96上进行cy5与qusar705染料之间的比较。该数据显示两种条件之间的良好一致性。将400/150nm下的新
‑
gic quasar705组合用于对gbs菌株的进一步测试。
[0126]
在以下实验中，关于不同gbs血清型的系列稀释液测试sip(600/200nm)和新gic(400/150nm)寡核苷酸(在列日大学医院中心，萨尔特
‑
蒂尔曼大学区，建筑b 35，b
‑
4000比利时列日收集的临床培养物)。下表8针对sip靶标和新gic靶标两者报告了ct值并示出了在不同血清型与不同稀释度之间的总体低标准偏差。表8表8实施例3
[0127]
本实施例描述了对引物/探针组合3靶向gbs sip基因的特异性和敏感性的评价。
[0128]
在kingfisher
tm
系统中提取后，在abi 7500快速实时pcr系统上使用sip+新gic
(cy5)混合物测试不同样品。使用上表3中所示的pcr概况。
[0129]
对于特异性，评价表9中所示的菌株的交叉反应性。表9
[0130]
对于包容性，测试了表10中所示的gbs血清型。表10
[0131]
初始以给定的原液浓度测试所有待检测的gbs血清型。此后，还以较低浓度(低至100cfu/ml)测试菌株。
[0132]
下表11示出了在abi 7500fast系统上获得的特异性数据。所有测试的细菌均未显示与sip引物和探针的相互作用。通过提供阳性信号的阳性对照评价pcr的有效性。表11
[0133]
在abi 7500fast系统上以高浓度测试的初始组给出表12中所示的结果。表12菌株ct平均值标准偏差无乳链球菌血清型ia16.7050.007无乳链球菌血清型ib17.6550.120无乳链球菌血清型ic17.7150.332无乳链球菌血清型iii18.2400.141无乳链球菌血清型iv15.7400.014无乳链球菌型菌株15.5500.057
[0134]
下表13示出了以较低浓度(在样品中100cfu/ml)测试gbs菌株时获得的数据。表13血清型浓度平均ct+/
‑
标准偏差血清型ia在样品中100cfu/ml38.6+/
‑
1.9血清型ib在样品中100cfu/ml38.1+/
‑
1.4血清型ic在样品中100cfu/ml37.7+/
‑
0.4血清型iii在样品中100cfu/ml37.9+/
‑
0.6血清型iv在样品中100cfu/ml38.1+/
‑
1.6
[0135]
将这些血清型(ia、ib、ic、iii、iv)进一步用于测试pcr效率。为此，制备了这些血清型的系列稀释液(范围从10^6cfu/ml至10^1cfu/ml)，并在magna pure 96系统(roche)上提取，并在abi 7500快速系统上对其进行pcr。数据显示，在不同血清型之间预期斜率为约
‑
3.3，并且效率在92％与98％之间。进一步地，数据证实在所述样品中100cfu/ml下检测到所有血清型。实施例4
[0136]
本实施例描述了在自动panther系统上对引物/探针组合3靶向gbs sip基因的特异性的评价。
[0137]
为了评价特异性，将下表15中示出的gbs菌株直接在panther fusion系统上测试，而无需添加额外的stm或lim肉汤。所用的匣盒含有用于ic检测的sip寡核苷酸和cy5寡核苷酸。表15
[0138]
在fam通道中检测到所有gbs血清型(53至58)，而其他菌株(59
‑
66)均为阴性，并且在red647通道中仅提供ic信号。这证实了sip寡核苷酸对测试菌株的特异性。
[0139]
另外，使用相同的匣盒(sip+ic(cy5))并在panther fusion系统上进行测试，还测试了如表16中所示的其他潜在的交叉反应性细菌和其余的gbs血清型。表16
[0140]
菌株38至43在fam通道中返回阳性信号，而其他菌株仅在red通道中返回ic信号。实施例5
[0141]
将仅靶向gbs sip基因的引物/探针组合3的性能与分别靶向sip和cfb基因的引物/探针组合3和17两者(作为多路化反应)的性能进行比较。在kingfisher
tm
系统中提取后，使用abi 7500快速实时pcr系统，以3000cfu/pcr在掺加在样本运输培养基(stm)中的gbs菌株上测试不同浓度的gbs引物/探针。核酸分离、扩增和检测反应总体上如上所述进行。在仅sip引物/探针组与sip/cfb引物/探针组之间未观察到ct值的显著差异，而相对于仅sip引物/探针组，使用多路化sip/cfb引物/探针组发现终点荧光水平更高。实施例6
[0142]
进行一项初步研究，以使用概率单位分析(17软件)确定多路化sip/cfb引物/探针组合3和17对gbs血清型iii(来自atcc)的检测限(lod)。
[0143]
从先前的gbs培养物(在样本运输培养基(stm)中的原液)开始，将gbs菌株血清型iii在lis肉汤中以下述八种浓度连续稀释(基于铺板)：20,000.0、10,000.0、5,000.0、2,500.0、1,250.0、625.0、312.5和156.3cfu/ml。
[0144]
将这八种稀释液如下添加在相应的样品管中：将250.0μl样品添加至750.0μl转移溶液(转移溶液是stm+靶标捕获寡核苷酸(tco)(在1667pmol/750μl stm下)的混合物)中。由于在样品管中发生了最终的1:4稀释，因此最终浓度为5,000.0、2,500.0、1,250.0、625.0、312.5、156.3、78.1和39.1cfu/ml。
[0145]
将每种稀释液在20个提取重复实验和一个pcr重复实验中进行测试，在panther系统上经两次运行。还分别在一个或两个提取重复实验和一个pcr重复实验中测试了阳性对照(在stm中141和781c/μl下的gbs sip和cfb质粒的混合物)和阴性对照(lim肉汤)。
[0146]
使用17软件，基于所测试的浓度、每个浓度获得阳性调用次数和试验次数进行概率单位分析。
[0147]
比较了三种分布模式(对数正态、威布尔(weibull)和对数逻辑)，并选择了给出最佳p值，即回归表接近0.000并且拟合优度检验最接近1.000的一种分布模式，如下表17中所汇总。基于此表，使用威布尔分布模式确定lod。表17
[0148]
在panther fusion系统上获得的结果汇总在下表18中。从统计分析去除最后一种稀释液。表18
[0149]
发现gbs血清型iii的lod
95％
在lb中为1,294cfu/ml，即在测试样品中为324cfu/ml。实施例7
[0150]
针对gbs血清型ia、ib、ic、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii和ix，通过测试细胞裂解物在lim肉汤阴性临床基质中的系列稀释液来评价使用与cfb引物/探针组合17多路化的sip引物/探针组合3的分析的敏感性和包容性。另外，评价了一种非溶血性(nh)菌株。使用概率单位回归分析确定panthergbs测定对每种血清型的95％检测限，并且对12种gbs血清型证实了所预测的检测限。在存在和不存在3倍lod下的gbs血清型iii的情况下，使用45种细菌或真菌物种评价微生物的交叉反应性和干扰性。进行方法比较研究，测试了从来自两家不同医院的接受标准护理gbs培养筛查的产前女性收集的lim肉汤富集样本(n＝255)。对于panther fusion gbs测定，确定了相对于培养物的敏感性和特异性。使用bdmax gbs测定测试了结果不一致的样本。所有测试均在panther fusion系统上进行。
[0151]
分析的敏感性和包容性。通过将已知cfu/ml浓度的裂解物原液掺加至lim肉汤富集基质中来创建检测组套(panel)。使用三个panther fusion系统，用三个测定试剂批号中的每一个在30个重复实验测试每个检测组套。通过概率单位分析估算出每种菌株和试剂批号的50％和95％预测lod(示于下表19中)。将lod在表19中报告为在lim肉汤样品中的cfu/ml(根据panther fusion测试样品中的cfu/ml反算的，所述测试样品是在样本运输培养基(stm)中的1:4稀释液)。进行了预测检测限的证实测试，并且对于所有血清型观察到≥95％阳性。表19
[0152]
微生物交叉反应性和干扰性。将下表20中所示的细菌和真菌物种以在测试样品中1e6 cfu/ml的浓度引入阴性lim肉汤基质中。在有和没有3倍估计lod下的gbs血清型iii的情况下，对检测组套进行测试。每个检测组套用一个测定试剂批号一式三份地进行测试。在没有gbs靶标的检测组套中未观察到交叉反应性。在含有gbs靶标的检测组套中未观察到干扰性。表20：测试的生物体
[0153]
方法比较.根据cdc推荐的指南，从产前女性总共收集了255份阴道直肠拭子。每个样本在lim肉汤培养基中于35℃
‑
37℃下富集18至24小时。将每个样本使用参考培养评价，并在panther fusion gbs测定中进行测试。根据参考培养结果确定临床敏感性和特异性。结果汇总于下表21中。panther fusion gbs测定的敏感性和特异性分别为100％和98.6％。有三个培养阴性的panther fusion gbs测定阳性样本，所有所述样本的重复panther fusion gbs测定测试均产生阳性结果。使用第二分子测试方法即bdmax gbs测定来分析不一致的样品，并且在所有三个样品中均检测到gbs。表21
[0154]
结论.初步的分析研究证明，所述测定具有对评价的血清型中的gbs的一致性检测，并且与培养方法的比较显示所述检测具有很高的敏感性和特异性。
实施例8
[0155]
本实施例描述了在自动化panther系统上用cfb引物/探针组合17多路化的sip引物/探针组合3的分析的特异性的评价。
[0156]
选择代表了通常在阴道/肛门菌群中发现的微生物或者与选择用于分析特异性测试的gbs属于同一科/属的124种生物体检测组套，其由以下组成：104种细菌、12种病毒、4种酵母/真菌和4种原生动物/寄生虫菌株。分析特异性检测组套详述于表22中。在124种选择的生物体之中，在研究之时有14种无法获得用于测试。通过blast分析评估了与针对这14种不可用生物体的gbs测定引物和探针的潜在交叉反应性，其中未鉴定到对齐。
[0157]
使用以下两种方法评估分析特异性：(1)交叉反应性(排他性)：测试这些生物体是否与gbs测定引物和探针交叉反应并在已证实的gbs阴性样品中诱导假阳性结果；(2)微生物干扰性：测试这些生物体是否会干扰lod附近浓度下的gbs阳性样品中的正常gbs检测。
[0158]
将由五(5)种微生物组成的汇集物以高浓度(对于细菌和酵母的最低106cfu/ml，并且对于病毒或等同物最低105pfu/ml)稀释在样本运输培养基(stm)中。汇集物组成详述于表22中。对于交叉反应性(排他性)评估，将这些微生物汇集物添加至临床阴性lim肉汤基质样品(gbs阴性样品)中。对于微生物干扰性评估，将这些微生物汇集物添加至掺加有3倍lod下的gbs血清型iii的临床阴性lim肉汤基质样品(gbs阳性样品)中。
[0159]
对于待评价的每个微生物汇集物，对gbs阳性样品和gbs阴性样品的三个重复实验测试panther fusion gbs测定，并报告数据。
[0160]
验收标准：(1)对于被认为无交叉反应性的一种或多种微生物(汇集物)，临床阴性lim肉汤基质样品(gbs阴性样品)的三个重复实验必须报告为阴性；(2)对于被认为无干扰性的一种或多种微生物(汇集物)，gbs血清型iii阳性样品(gbs阳性样品)的三个重复实验必须报告为阳性。表22：分析型特异性面板
[0161]
研究结果。运行是有效的，并且在每个反应中均检测到内部对照(ic)，分别导致0％无效运行率和0％ic无效率。在panther fusion系统上用gbs引物和探针针对交叉反应性评估测试的所有gbs阴性样品均给出阴性、有效结果，而用panther fusion gbs测定针对微生物干扰性评估测试的所有gbs阳性样品均给出gbs阳性结果。结果报告于下表23中。表23：分析型特异性结果
序列表24：示例性寡聚物序列、参考序列和区域
[0162]
从上文将理解，虽然已出于说明目的在本文中描述了本发明的具体实施方案，但可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出多种修改。因此，除了所附权利要求外，本发明不受限制。本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的据此通过引用以其整体并入本文。