用于构建和检测生物活性剂的基因编码系统

用于构建和检测生物活性剂的基因编码系统1.政府支持声明2.本发明是在国家科学基金给予的授予号(award)1750244和1804897下由政府支持进行。政府享有本发明的某些权利。
技术领域：
：3.本发明涉及基因工程的领域。特别地，本发明涉及产生生物活性剂的操纵子的构建。例如，可构建操纵子以产生控制生物化学途径蛋白质(例如，蛋白磷酸酶、激酶和/或蛋白酶)功能的试剂。这种试剂可包括可用于研究或控制与磷酸酶途径或表达水平中的异常相关的磷酸酶功能中的抑制剂和调节剂。融合蛋白，比如光活化的蛋白磷酸酶，可被基因编码且被表达为光控开关磷酸酶。提供用于控制活细胞内的磷酸酶功能或鉴定与细胞信号传导相关的蛋白磷酸酶的小分子抑制剂/活化剂/调节剂分子的系统。
背景技术：
：：4.蛋白质磷酸化涉及细胞信号传导，因为其部分控制细胞分化、移动、增殖和死亡的位置和时机1‑4；其失调与癌症、糖尿病、肥胖和阿尔茨海默氏疾病等紊乱有关5‑9。对活细胞中磷酸化调节酶的活性施加时空控制的光学工具可阐明细胞传输、过滤和整合化学信号的机制10,11，揭示看似截然不同的生理过程(例如，记忆12和新陈代谢13)之间的联系并且促进用于磷酸化调节疗法(一类药物14)的新靶标的鉴定。因此，需要开发工具来控制、减少或增强活细胞中磷酸化调节酶的活性。技术实现要素：5.本发明涉及基因工程的领域。特别地，本发明涉及产生生物活性剂的操纵子的构建。例如，可构建操纵子以产生控制生物化学途径蛋白质(例如，蛋白磷酸酶、激酶和/或蛋白酶)功能的试剂。这种试剂可包括可用于研究或控制与磷酸酶途径或表达水平中的异常相关的磷酸酶功能中的抑制剂和调节剂。融合蛋白，比如光活化的蛋白磷酸酶，可被基因编码且被表达为光控开关磷酸酶。提供用于控制活细胞内的磷酸酶功能或鉴定与细胞信号传导相关的蛋白磷酸酶的小分子抑制剂/活化剂/调节剂分子的系统。6.在一个实施方式中，本发明考虑了基因操纵子，其包括：a)提供；i)编码第一融合蛋白的第一基因，第一融合蛋白包括底物识别结构域和dna结合结构域或rna聚合酶的锚定单元(anchoringunit)；ii)编码第二融合蛋白的第二基因，第二融合蛋白包括酶底物结构域和rna聚合酶的锚定单元或dna结合结构域；iii)包括所述dna结合结构域的结合位点的第一dna序列；iv)包括对于所述锚定单元和对于所述rna聚合酶的接近第一的结合位点的第二dna序列；v)编码第一酶的第三基因，其中所述第一酶能够修饰所述底物结构域，从而改变所述底物识别结构域的亲和力；vi)编码第二酶的第四基因，其中所述第二酶能够不修饰所述底物结构域；vii)报道基因，其编码至少一种在两个融合蛋白缔合后当所述rna聚合酶和所述锚定单元结合至所述第二dna序列结合位点时能够具有可检测输出的。在一个实施方式中，所述底物结构域是蛋白激酶的肽底物。在一个实施方式中，所述底物结构域是蛋白酪氨酸激酶的肽底物。在一个实施方式中，所述底物结构域是src激酶(蛋白酪氨酸激酶)的肽底物。在一个实施方式中，所述底物识别结构域能够以其磷酸化状态结合至所述底物结构域。在一个实施方式中，所述底物识别结构域能够以其未磷酸化状态结合至所述底物结构域。在一个实施方式中，所述dna结合结构域是434ci阻遏物且所述dna结合位点是434ci阻遏物的结合序列。在一个实施方式中，所述锚定单元是rna聚合酶的ω亚单元和所述第二dna结合位点是rna聚合酶的结合位点。在一个实施方式中，所述底物结构域是蛋白激酶的肽底物。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括蛋白质系统。在一个实施方式中，所述第一酶是蛋白磷酸酶。在一个实施方式中，所述第一酶是蛋白酪氨酸磷酸酶。在一个实施方式中，所述第一酶是蛋白酪氨酸磷酸酶1b。在一个实施方式中，所述第二酶是蛋白激酶。在一个实施方式中，所述第二酶是蛋白酪氨酸激酶。在一个实施方式中，所述第二酶是src激酶。在一个实施方式中，产生可检测输出的所述报道蛋白是luxab生物报道分子(例如，输出是发光)。在一个实施方式中，产生可检测输出的所述报道蛋白是荧光蛋白质。在一个实施方式中，产生可检测输出的所述报道蛋白是mclover。在一个实施方式中，产生可检测输出的所述报道蛋白赋予抗生素抗性。在一个实施方式中，所述抗生素抗性是对大观霉素的。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括编码诱饵蛋白融合的基因，其包括：(i)不同于第一酶底物结构域的第二酶底物结构域和(ii)不特异性结合至dna和/或rna聚合酶的蛋白质，和编码第三酶的第五基因，其中所述第三酶能够在诱饵底物结构域上是活性的。在一个实施方式中，所述第一酶底物结构域(基础系统的)和所述第二酶底物结构域(诱饵的)二者是蛋白激酶的底物。在一个实施方式中，所述第一酶底物结构域(基础系统的)和所述第二酶底物结构域(诱饵的)二者是蛋白酪氨酸激酶的底物。在一个实施方式中，所述第一酶底物结构域(基础系统的)和所述第二酶底物结构域(诱饵的)二者是src激酶的底物。在一个实施方式中，所述第一酶底物结构域(基础系统的)和所述第二底物结构域(诱饵的)二者是蛋白磷酸酶的底物。在一个实施方式中，所述第一酶底物结构域(基础系统的)和所述第二底物结构域(诱饵的)二者是蛋白酪氨酸磷酸酶的底物。在一个实施方式中，所述第一酶底物结构域(基础系统的)和所述第二底物结构域(诱饵的)二者是蛋白酪氨酸磷酸酶1b的底物。在一个实施方式中，所述第一酶是光调节酶。在一个实施方式中，所述第一酶是蛋白质‑lov2嵌合体。在一个实施方式中，所述第一酶是ptp1b‑lov2嵌合体。在一个实施方式中，产生可检测输出的所述蛋白质包括在非必需底物存在的情况下生成有毒的产物的蛋白质。在一个实施方式中，所述另外蛋白质是sacb，其将蔗糖转变为在大肠杆菌中是有毒的非结构多糖。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体和细菌细胞。7.在一个实施方式中，本发明考虑了用于检测酶的抑制剂的系统，其包括：a)提供；i)包括编码酶的基因的操纵子；ii)细菌细胞；iii)小分子测试化合物；和b)将所述细菌与所述操纵子接触，使得所述接触的细菌能够产生可检测输出；c)在允许所述可检测输出的条件下，在所述测试化合物存在的情况下，生长所述接触的细菌；和d)评估测试化合物对所述可检测输出的影响。在一个实施方式中，所述酶是蛋白磷酸酶。在一个实施方式中，所述酶是蛋白酪氨酸磷酸酶。在一个实施方式中，所述酶是蛋白酪氨酸磷酸酶1b。8.在一个实施方式中，本发明考虑了用于进化酶的抑制剂的方法，其包括：a)提供：i)包括编码酶的基因的操纵子；ii)细菌细胞文库，其中每种所述细菌细胞具有至少一种突变的代谢途径；b)生长所述细菌细胞文库；和c)筛选用于可检测输出的所述细菌细胞文库。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体。9.在一个实施方式中，本发明考虑了用于相对于第二酶检测第一酶的选择性抑制剂的方法，包括：a)提供；i)如以上描述的包括细菌细胞文库的系统；和ii)小分子测试化合物；b)在测试化合物存在的情况下，生长所述细菌细胞文库；和c)评估测试化合物对可检测输出的影响。在一个实施方式中，系统进一步提供包括编码诱饵融合蛋白的基因的操纵子，所述诱饵融合蛋白包括；(i)不同于第一酶底物结构域的第二酶底物结构域和(ii)不特异性结合至dna和/或rna聚合酶的蛋白质。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体。10.在一个实施方式中，本发明考虑了用于相对于第二酶进化第一酶的选择性抑制剂的方法，包括；a)提供；如本文描述的包括具有突变的代谢途径的细菌细胞文库的系统；b)生长所述细菌细胞文库；和b)筛选用于可检测输出的细菌细胞文库。在一个实施方式中，方法进一步提供包括编码诱饵融合蛋白的基因的操纵子，诱饵融合蛋白包括；(i)不同于第一酶底物结构域的第二酶底物结构域和(ii)不特异性结合至dna和/或rna聚合酶的蛋白质。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体。11.在一个实施方式中，本发明考虑了用于进化光控开关酶的方法，包括；a)提供；i)如本文描述的包括具有突变的光控开关酶的细菌细胞文库的系统；b)在至少两种不同的光条件下，生长细菌细胞文库；和c)比较所述两种不同光条件中每个光条件之间每个细胞的可检测输出的差异。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体。12.在一个实施方式中，本发明考虑了用于进化光控开关酶的方法，包括：a)提供；i)如本文描述的包括具有突变的光控开关酶的细菌细胞文库的系统；b)在其中活性是期望的第一光源下生长细菌细胞文库；c)随后在存在下述的情况下生长来自步骤b)的细菌细胞文库：(i)非必需底物和(ii)第二光源，其中活性不是期望的；d)随后筛选步骤c)的幸存者，用于突变的细菌细胞；和e)在第一光源和第二光源下检查突变的细菌细胞的活性。在一个实施方式中，方法进一步包括包含编码诱饵融合蛋白的基因的操纵子，诱饵融合蛋白包括：(i)不同于第一酶底物结构域的第二酶底物结构域；和(ii)不特异性结合至dna和/或rna聚合酶的蛋白质。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体。13.在一个实施方式中，本发明考虑了用于进化酶的选择性突变体的方法，其包括：a)提供；如以上描述的包括具有突变的酶的细菌细胞文库的系统；b)生长细菌细胞文库和c)比较细胞之间的可检测输出以鉴定突变的酶。在一个实施方式中，方法进一步包括包含编码诱饵融合蛋白的基因的操纵子，诱饵融合蛋白包括：(i)不同于第一酶底物结构域的第二酶底物结构域；和(ii)不特异性结合至dna和/或rna聚合酶的蛋白质。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括表达载体。14.在一个实施方式中，本发明考虑了用于进化对酶选择性的底物结构域的方法，其包括：a)提供；如以上描述的包括包含融合至dna结合结构域的底物结构域的细菌细胞文库的方法；b)在第一酶的诱导物和非必需底物存在的情况下，生长细菌细胞文库；c)随后在第二酶的诱导物存在的情况下，生长来自步骤b)的细菌细胞文库；和d)随后筛选幸存者细菌细胞，从而鉴定结合至第一酶而不结合至第二酶的底物。在一个实施方式中，所述系统包括产生可检测输出的报道蛋白。在一个实施方式中，在非必需底物存在的情况下，报道蛋白生成有毒的产物。在一个实施方式中，系统进一步包括包含选自由第一酶的第一诱导型启动子和第二酶的第二诱导型启动子组成的组中的基因的操纵子，其中第二酶具有与第一酶相似的活性。15.在一个实施方式中，本发明考虑了使用包括操纵子的微生物生物传感器的方法，其中所述操纵子包括；a)提供报道基因和传感器融合蛋白基因；和b)表达具有翻译后修饰和报道基因的所述传感器融合蛋白。在一个实施方式中，所述表达的传感器融合蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域并且在作为附着至磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的至少一种可表达的传感器融合蛋白存在的情况下，能够结合至所述dna结合序列。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括编码下述的基因片段：i)作为能够附着至所述磷酸盐分子的蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的第一可表达的传感器融合蛋白，所述第一可表达的传感器融合蛋白与dna结合蛋白质可操作的组合；和ii)作为当附着至磷酸盐分子时，所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的第二可表达的传感器融合蛋白，所述第二可表达的传感器融合蛋白与rna聚合酶的亚单元可操作的组合；和iii)个别可表达的片段，包括但不限于src激酶蛋白、蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)并且缀合至能够结合至传感器融合蛋白的所述dna结合蛋白质的所述转录活性结合序列，并且rna聚合酶的所述亚单元与所述报道基因可操作的组合。16.在一个实施方式中，本发明考虑了使用微生物生物传感器的方法，其包括；a)提供；i)操纵子，其中所述操纵子包括报道基因和传感器融合蛋白基因；ii)活细菌；和iii)所述蛋白酪氨酸磷酸酶的测试小分子抑制剂；b)表达具有翻译后修饰和报道基因的所述传感器融合蛋白；c)将所述细菌与所述测试小分子接触；和d)通过所述报道基因的表达确定是否所述测试小分子是所述蛋白磷酸酶的抑制剂。在一个实施方式中，所述表达的传感器融合蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域，其在作为附着至磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的至少一种可表达的传感器融合蛋白存在的情况下能够结合至dna结合序列。在一个实施方式中，所述表达的传感器融合蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶1b底物结构域，其在作为附着至磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的至少一种可表达的传感器融合蛋白存在的情况下能够结合至所述dna结合序列。在一个实施方式中，所述操纵子进一步包括编码下述的基因片段：i)作为能够附着至与dna‑结合可操作的组合的所述磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的所述第一可表达的传感器融合蛋白；和ii)作为当附着至与rna聚合酶的亚单元可操作的组合的磷酸盐分子时，所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的所述第二可表达的传感器融合蛋白；和iii)个别可表达的片段，其包括但不限于src激酶蛋白、蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)并且缀合至能够结合至传感器融合蛋白的所述dna结合蛋白质的所述转录活性结合序列，并且rna聚合酶的所述亚单元与所述报道基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述生物传感器进一步包括表达第二基因的操纵子组分。在一个实施方式中，所述生物传感器进一步包括表达不同于第一ptp的第二ptp的操纵子组分，用于鉴定对tpt酶之一的选择性的所述抑制剂。在一个实施方式中，所述测试小分子抑制剂包括但不限于松香烷型二萜、松香酸(aa)、二氢松香酸和其结构变体。17.在一个实施方式中，本发明考虑了使用微生物生物传感器的方法，包括：a)提供；i)操纵子，其中所述操纵子包括报道基因和传感器融合蛋白基因；ii)活细菌；和iii)所述蛋白酪氨酸磷酸酶的测试小分子抑制剂；b)表达具有翻译后修饰和报道基因的所述传感器融合蛋白；c)在所述细菌中表达所述可表达的传感器融合蛋白；d)将所述细菌与所述测试小分子接触；和e)通过所述报道基因的表达确定是否所述测试小分子是所述蛋白磷酸酶的抑制剂。在一个实施方式中，所述表达的传感器融合蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域并且在作为附着至磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的至少一种可表达的传感器融合蛋白存在的情况下能够结合所述dna结合序列。在一个实施方式中，表达的传感器融合蛋白具有蛋白酪氨酸磷酸酶1b底物结构域并且在作为附着至磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的至少一种可表达的传感器融合蛋白和光控开关蛋白酪氨酸磷酸酶1b的个别可表达的片段存在的情况下能够结合所述dna结合序列。在一个实施方式中，所述操纵子包括编码下述的基因片段：i)作为能够附着至与dna结合蛋白质可操作的组合的所述磷酸盐分子的所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的所述第一可表达的传感器融合蛋白；ii)作为当附着至与rna聚合酶的亚单元可操作的组合的磷酸盐分子时所述蛋白酪氨酸磷酸酶底物结构域的识别结构域(sh2)的所述第二所述可表达的传感器融合蛋白；和iii)个别可表达的片段，包括但不限于src激酶蛋白、蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)并且缀合至能够结合至传感器融合蛋白的所述dna结合蛋白质的所述转录活性结合序列，并且所述rna聚合酶的亚单元与所述报道基因可操作的组合。18.在一个实施方式中，本发明考虑了用于提供用作潜在疗法的化学结构的变体的方法，包括：a)提供；i)包括提供改变的化学结构的代谢类萜化学结构产生途径的大肠杆菌细菌，其中所述代谢途径包括合成酶，其中所述大肠杆菌进一步包括检测ptp抑制的微生物生物传感器操纵子；和ii)酶系统的突变的合成酶；a)引入所述酶系统的突变的合成酶；c)在其中所述突变的合成酶或酶系统改变所述类萜化学结构的化学结构的条件下表达所述突变的合成酶；和d)确定是否所述改变的化学结构是作为用作潜在疗法的测试抑制剂的所述ptp的抑制剂。在一个实施方式中，所述代谢途径包括合成酶，所述酶包括但不限于萜合酶、细胞色素p450、卤化酶、甲基转移酶或类萜功能化酶。在一个实施方式中，所述类萜包括但不限于半日花烷型二萜。在一个实施方式中，所述类萜包括但不限于，松香烷型二萜。在一个实施方式中，所述类萜是松香酸。19.在一个实施方式中，本发明考虑了融合蛋白dna构建体，其包括蛋白磷酸酶基因和所述磷酸酶基因内缀合的蛋白光开关基因，其中所述蛋白磷酸酶基因编码具有c‑末端结构域的蛋白质和所述蛋白光开关基因编码具有n‑末端α螺旋区的蛋白质，使得所述c‑末端结构域被缀合至所述n‑末端α螺旋区。在一个实施方式中，所述构建体进一步包括表达载体和活细胞。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)。在一个实施方式中，所述c‑末端结构域编码ptp1b的α7螺旋。在一个实施方式中，所述构建体编码ptp1bps‑a。在一个实施方式中，所述构建体编码ptp1bps‑b。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是t‑细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(tc‑ptp)。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是来自燕麦的向光素1的lov2结构域。在一个实施方式中，所述lov2结构域包括lov2的a’a螺旋。在一个实施方式中，所述lov2具有导致氨基酸突变的至少一种突变。这并不意味着限制这种突变。事实上，突变可包括但不限于来自所述基因的核苷酸置换、核苷酸的添加和核苷酸的删除。在一个实施方式中，所述突变是核苷酸的置换。在一个实施方式中，所述lov2的a’a螺旋具有t406a突变。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述光敏素蛋白是细菌光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述细菌光敏素蛋白是来自沼泽红假单胞菌的细菌光敏素蛋白1(bphp1)。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光敏素蛋白。20.在一个实施方式中，本发明考虑了融合蛋白，其包括蛋白磷酸酶和所述磷酸酶内缀合的蛋白光开关，其中所述蛋白磷酸酶具有c‑末端结构域和所述蛋白光开关具有n‑末端α螺旋区，使得所述c‑末端结构域被缀合至所述n‑末端α螺旋区。在一个实施方式中，所述融合蛋白进一步包括表达载体和活细胞。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)。在一个实施方式中，所述c‑末端结构域编码α7螺旋。在一个实施方式中，所述融合蛋白是ptp1bps‑a。在一个实施方式中，所述融合蛋白是ptp1bps‑b。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是t‑细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(tc‑ptp)。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是来自燕麦的向光素1的lov2结构域。在一个实施方式中，所述lov2结构域包括lov2的a’a螺旋。在一个实施方式中，所述lov2的a’a螺旋具有t406a突变。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述光敏素蛋白是细菌光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述细菌光敏素蛋白是来自沼泽红假单胞菌的细菌光敏素蛋白1(bphp1)。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光敏素蛋白。21.在一个实施方式中，本发明考虑了使用融合蛋白的方法，其包括；a)提供；i)融合蛋白；ii)蛋白磷酸酶和iii)活细胞；和b)将所述融合蛋白引入所述活细胞中，使得所述光开关的照度(illumination)改变所述活细胞中的特征。在一个实施方式中，所述特征包括但不限于控制细胞移动、形态、控制细胞信号传导和具有调节作用。在一个实施方式中，所述调节作用包括但不限于失活、活化、可逆的失活和可逆的活化。在一个实施方式中，所述调节作用是剂量依赖性。在一个实施方式中，所述照度是450‑500nm的范围内的光。在一个实施方式中，所述照度是600‑800nm的范围内的光。在一个实施方式中，所述蛋白光开关经历光诱导的构象改变并且所述蛋白磷酸酶具有由所述构象变化而改变的变构性地调节的催化活性。在一个实施方式中，所述改变是增强的或减少的。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述活细胞具有活性。在一个实施方式中，所述活细胞在体内。在一个实施方式中，所述方法进一步包括在体内控制所述细胞活性的步骤。22.在一个实施方式中，本发明考虑了用于检测蛋白磷酸酶的小分子调节剂的方法，其包括：a)提供；i)包括蛋白磷酸酶和蛋白光开关的融合蛋白；ii)磷酸酶活性的可视读出；iii)光源，其中所述源能够发射光辐射；iv)活细胞；和v)小分子测试化合物；b)在所述活细胞中表达所述融合蛋白；c)将所述活细胞与所述小分子测试化合物接触；d)用所述光源照射所述细胞内的所述融合蛋白；e)测量磷酸酶活性的改变的可视读出，用于鉴定作为所述磷酸酶的所述活性的调节剂的所述小分子测试化合物；和f)使用所述调节小分子测试化合物，用于治疗展现出与所述磷酸酶相关的疾病的至少一种症状的患者。在一个实施方式中，所述方法进一步包括鉴定作为所述磷酸酶的活性的抑制剂的所述小分子测试化合物。在一个实施方式中，所述方法进一步包括鉴定作为所述磷酸酶的活性的活化剂的所述小分子测试化合物。在一个实施方式中，所述疾病包括但不限于糖尿病、肥胖、癌症、焦虑、自身免疫或神经变性病。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光‑氧‑电压(lov)结构域。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是具有人工生色团的光敏素蛋白。在一个实施方式中，所述方法进一步提供基于荧光的生物传感器，并且包括将所述基于荧光的生物传感器引入所述细胞的步骤。在一个实施方式中，所述方法进一步包括在体内控制所述细胞活性的步骤。在一个实施方式中，磷酸酶活性的所述可视读出选自由基于荧光的生物传感器、细胞形态的变化和细胞运动性的变化组成的组中。23.在一个实施方式中，本发明考虑了光控开关蛋白酪氨酸磷酸酶构建体，其包括缀合至c‑末端变构结构域区域的蛋白光开关的n‑末端α螺旋。在一个实施方式中，所述蛋白酪氨酸磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)。在一个实施方式中，所述蛋白光开关是源自燕麦(野生燕麦)的向光素1的lov2结构域。在一个实施方式中，所述酶构建体进一步包括表达载体。在一个实施方式中，本发明考虑了酶活性的生物传感器，其包括；a)如以上所述的底物结构域；b)底物识别结构域；c)第一荧光蛋白质；和d)第二荧光蛋白质。24.在一个实施方式中，本发明提供用于检测调节酶活性的小分子的基因编码系统，其包括，a.可操作的组合中的第一区域，其包括：i.第一启动子；ii.编码第一融合蛋白的第一基因，所述第一融合蛋白包括连接至dna结合蛋白质的底物识别结构域；iii.编码第二融合蛋白的第二基因，所述第二融合蛋白包括连接至能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物结构域；iv.第二启动子；v.蛋白激酶的第三基因；vi.分子伴侣的第四基因；vii.蛋白磷酸酶的第五基因；b.可操作的组合中的第二区域，其包括：i.编码所述dna结合蛋白质的操纵基因的第一dna序列；ii.编码rna聚合酶的结合位点的第二dna序列；和iii.一个或多个感兴趣的基因(goi)。在一个实施方式中，所述第一启动子是pro1。在一个实施方式中，所述底物识别结构域是来自智人的底物同源性2(sh2)结构域。在一个实施方式中，所述dna结合蛋白质是434噬菌体ci阻遏物。在一个实施方式中，所述底物结构域是所述激酶和所述磷酸酶二者的肽底物。在一个实施方式中，所述第二启动子是prod。在一个实施方式中，能够将rna聚合酶募集至dna的所述蛋白质是rna聚合酶的ω亚单元(即，rpoz或rpω)。在一个实施方式中，所述蛋白激酶是来自智人的src激酶。在一个实施方式中，所述分子伴侣是来自智人的cdc37(即，hsp90共伴侣)。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是来自智人的蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)。在一个实施方式中，所述操纵基因是434噬菌体ci阻遏物的操纵基因。在一个实施方式中，rna聚合酶的所述结合位点是lacz启动子的‑35至‑10区。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是specr，赋予对大观霉素的抗性的基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是luxa和luxb，产生发光输出的两个基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是赋予对抗生素的抗性的基因。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是来自智人的ptpn6。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是ptp的催化结构域。在一个实施方式中，(i)所述蛋白磷酸酶的催化结构域和(ii)ptp1b的催化结构域的x‑射线晶体结构的比对产生小于或等于的均方跟偏差(rmsd)(如类似于pymol函数对齐的函数定义的)。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶的所述催化结构域与ptp1b的催化结构域具有至少34.1％序列同一性。在一个实施方式中，所述磷酸酶的所述催化结构域与ptp1b的催化结构域具有至少53.5％序列相似性。在一个实施方式中，所述蛋白激酶是蛋白酪氨酸激酶(ptk)。在一个实施方式中，所述蛋白激酶是ptk的催化结构域。在一个实施方式中，所述第一启动子是组成型启动子。在一个实施方式中，所述第二启动子是组成型启动子。在一个实施方式中，所述第一启动子是诱导型启动子。在一个实施方式中，所述第二启动子是诱导型启动子。在一个实施方式中，rna聚合酶的所述结合位点包括部分第三启动子。在一个实施方式中，所述第一区域缺失分子伴侣的基因。在一个实施方式中，所述第一融合蛋白由连接能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物识别结构域组成并且所述第二融合蛋白由连接至dna结合蛋白质的底物结构域组成。在一个实施方式中，所述第一区域进一步含有包括与第一底物结构域不同的连接至不能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的第二底物结构域的第三融合蛋白(即，“诱饵”)。在一个实施方式中，所述第三融合蛋白的所述底物结构域是所述激酶和所述磷酸酶二者的肽底物。在一个实施方式中，所述第三融合蛋白的所述底物结构域是所述激酶的肽底物，但是是所述磷酸酶的差的底物。在一个实施方式中，所述第一区域进一步含有第二蛋白磷酸酶的第六基因，其与第一蛋白磷酸酶不同并且其作用于所述第三融合蛋白的所述底物结构域。25.在一个实施方式中，本发明提供使用以下二者的方法：(i)检测调节酶活性的小分子的基因编码系统和(ii)用于类萜生物合成的基因编码途径以鉴定和/或构建调节酶活性的类萜，所述方法包括，a.提供，i.检测调节酶活性的小分子的基因编码系统，其包括，1.可操作的组合中的第一区域，其包括：a.第一启动子；b.编码第一融合蛋白的第一基因，所述第一融合蛋白包括连接至dna结合蛋白质的底物识别结构域；c.编码第二融合蛋白的第二基因，所述第二融合蛋白包括连接至能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物结构域；d.第二启动子；e.蛋白激酶的第三基因；f.分子伴侣的第四基因；g.蛋白磷酸酶的第五基因；2.可操作的组合中的第二区域，其包括：a.编码所述dna结合蛋白质的操纵基因的第一dna序列；b.编码rna聚合酶的结合位点的第二dna序列；c.一个或多个感兴趣的基因(goi)；ii.用于类萜生物合成的基因编码途径，其包括：1.生成直链类异戊二烯前体的途径；2.萜合酶(ts)的基因；3.多个大肠杆菌细菌；b.用下述两者转化所述细菌：(i)用于检测小分子的所述基因编码系统和(ii)用于类萜生物合成的所述基因编码途径，并且允许所述转化细菌复制；c.通过可测量的输出观察感兴趣的基因的表达。在一个实施方式中，生成直链类异戊二烯前体的所述途径生成法尼基焦磷酸(fpp)。在一个实施方式中，生成直链类异戊二烯前体的所述途径是酿酒酵母的全部或部分甲羟戊酸依赖性类异戊二烯途径。在一个实施方式中，生成直链类异戊二烯前体的所述途径通过质粒pmbis进行。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是specr，赋予对大观霉素的抗性的基因。在一个实施方式中，所述ts基因在来自剩余的类萜途径的分开质粒(pts)上进行。在一个实施方式中，所述ts基因对来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶(ads)编码。在一个实施方式中，所述ts基因对来自北美冷杉的γ‑蛇麻烯合酶(ghs)编码。在一个实施方式中，所述ts基因对北美冷杉的松香二烯合酶(abs)编码，并且该基因与香叶基香叶基二磷酸合酶(gpps)的基因进行可操作的组合。在一个实施方式中，所述ts基因为来自短叶红豆杉的紫杉烯合酶(txs)编码，并且该基因与ggpps的基因进行可操作的组合。在一个实施方式中，方法进一步包括，d.提取能够最高可测量的输出(例如，以大观霉素的最高浓度生长)的类萜；e.鉴定所述类萜；f.纯化所述类萜。在一个实施方式中，方法进一步包括，提供，g.哺乳动物细胞培养物，h.处理具有纯化的类萜的所述细胞培养物，i.测量由蛋白磷酸酶或蛋白激酶的活性的变化导致的生物化学作用。在一个实施方式中，方法进一步包括，j.提供，纯化的酶靶标，k.测量纯化的类萜对酶靶标的调节作用，l.量化该调节作用(例如，通过计算ic50)。在一个实施方式中，所述ts基因具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述ts基因与功能化类萜的酶的基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述ts基因与细胞色素p450的基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述ts基因与来自巨大芽孢杆菌的细胞色素p450bm3的基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述ts基因与卤化酶的基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述ts基因与来自毒三素链霉素的6‑卤化酶(stth)的基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述ts基因与来自acaryochlorismarina的钒卤素过氧化物酶(vhpo)的基因可操作的组合。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是hepg2、hela、hek393t、mcf‑7和/或cho‑hir细胞。在一个实施方式中，所述细胞是bt474、skbr3或mcf‑7和mda‑mb‑231细胞。在一个实施方式中，所述生物化学作用是胰岛素受体磷酸化，其可通过蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(elisa)测量。在一个实施方式中，所述细胞是三阴性(tn)细胞系。在一个实施方式中，所述细胞是来自美国菌种保藏中心(atcc)的tn细胞。在一个实施方式中，所述细胞是来自atcctcp‑1002的tn细胞。在一个实施方式中，所述生物化学作用是细胞迁移。在一个实施方式中，所述生物化学作用是细胞活力。在一个实施方式中，所述生物化学作用是细胞增殖。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是来自智人的ptp1b。在一个实施方式中，所述蛋白激酶是来自智人的src激酶。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因赋予对抗生素的抗性。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是sacb，赋予对蔗糖的敏感性的基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因赋予有条件的毒性(即，在外源添加的分子存在的情况下的毒性)。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是specr和sacb。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是野生型酶。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶具有至少一个减少其对调节野生型蛋白磷酸酶的活性的小分子的敏感性的突变。在一个实施方式中，所述蛋白激酶是野生型酶。在一个实施方式中，所述蛋白激酶具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述蛋白激酶具有至少一个减少其对调节野生型蛋白激酶的活性的小分子的敏感性的突变。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种抑制蛋白磷酸酶。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种抑制ptp。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种抑制ptp1b。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种活化蛋白磷酸酶。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种活化ptp。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种活化蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12(ptpn12)。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种抑制蛋白激酶。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种抑制ptk。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种抑制src激酶。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种活化蛋白激酶。在一个实施方式中，所述类萜的所述至少一种活化ptk。在一个实施方式中，检测小分子的所述基因编码系统进一步含有下述两者：(i)包括与第一底物结构域不同的连接至不能将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的第二底物结构域的第三融合蛋白和(ii)与第一蛋白磷酸酶不同的第二蛋白磷酸酶的第六基因。在一个实施方式中，检测小分子的所述基因编码系统进一步含有下述两者：(i)包括与第一底物结构域不同的连接至不能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的第二底物结构域的第三融合蛋白和(ii)与第一蛋白激酶不同的第二蛋白激酶的第六基因。在一个实施方式中，类萜生物合成的所述基因编码途径替代地包括不同于ts基因的特征(identity)的途径的文库，使得转化后大部分细胞含有不同的ts基因(即，至少一个突变不同的基因)。在一个实施方式中，用于类萜生物合成的所述基因编码途径替代地包括不同于与si基因可操作的组合的功能化类萜(例如，细胞色素p450或卤化酶)的基因的特征的途径的文库，使得转化后大部分细胞含有功能化类萜的不同基因(即，至少一个突变不同的基因)。在一个实施方式中，用于类萜生物合成的所述基因编码途径替代地包括途径的文库，在其中已经由真核互补的dna(cdna)文库的组分取代ts基因，使得转化后大部分细胞含有代替ts基因的不同基因。在一个实施方式中，用于类萜生物合成的所述基因编码途径替代地包括途径的文库，在其中由真核互补的dna(cdna)文库的组分伴随ts基因，使得转化后大部分细胞含有与ts基因可操作的组合的不同基因(例如，对于萜类功能化酶可编码的基因)。在一个实施方式中，用于检测小分子的所述基因编码系统替代地包括不同于蛋白磷酸酶基因的特征的这种系统的文库，使得转化后大部分细胞含有不同蛋白磷酸酶基因(即，至少一个突变不同的基因)。在一个实施方式中，用于类萜生物合成的所述基因编码途径生成调节野生型形式的所述蛋白磷酸酶的活性的类萜，从而使生长研究能够分离对小分子的调节作用较少敏感性的所述蛋白磷酸酶的突变体。在一个实施方式中，用于检测小分子的所述基因编码系统替代地包括不同于蛋白激酶基因的特征的这种系统的文库，使得转化后大部分细胞含有分开的蛋白激酶基因(即，至少一个突变不同的基因)。在一个实施方式中，用于类萜生物合成的所述基因编码途径生成调节野生型形式的所述蛋白激酶的活性的类萜，从而使生长研究能够分离对小分子的调节作用较少敏感性的所述蛋白激酶的突变体。在一个实施方式中，所述至少一种所述类萜调节野生型形式的所述蛋白磷酸酶的活性，而不调节突变形式的所述蛋白磷酸酶。在一个实施方式中，所述至少一种所述类萜调节所述第一蛋白磷酸酶的活性，而不调节所述第二蛋白磷酸酶的活性。在一个实施方式中，所述至少一种所述类萜调节野生型形式的所述蛋白激酶的活性，而不调节突变形式的所述蛋白激酶。在一个实施方式中，所述至少一种所述类萜调节所述第一蛋白激酶的活性，而不调节所述第二蛋白激酶的活性。26.在一个实施方式中，本发明提供抑制剂检测操纵子，其包括，a：在第一启动子的控制下可操作的组合中的第一区域，其包括：i.编码包括底物识别同源性2结构域(sh2)和阻遏物的第一融合蛋白的第一dna序列；ii.编码包括底物识别结构域的磷酸盐分子结合结构域、所述底物识别结构域和rna聚合酶的ω亚单元(rpoz或rpω)的第二融合蛋白的第二dna序列；iii.编码细胞分裂周期37蛋白质(cdc37)的第三dna序列；iv.蛋白磷酸酶；和b：在第二启动子的控制下可操作的组合中的第二区域，其包括：i.包括所述阻遏物的阻遏物结合结构域的操纵基因，ii.核糖体结合位点(rb)；和iii.感兴趣的基因(goi)。在一个实施方式中，所述sh2结构域是所述蛋白磷酸酶的底物识别结构域。在一个实施方式中，所述阻遏物是434噬菌体ci阻遏物。在一个实施方式中，所述底物识别结构域结合所述蛋白磷酸酶。在一个实施方式中，所述诱饵底物结构域是src激酶基因。在一个实施方式中，所述操纵基因是434ci操纵基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因编码抗生素蛋白质。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶。在一个实施方式中，所述第一启动子是组成型启动子。在一个实施方式中，所述第二启动子是诱导型启动子。27.在一个实施方式中，本发明提供使用抑制剂检测操纵子的方法，其包括，a.提供，i.检测操纵子，其包括a：在第一启动子的控制下可操作的组合中的第一区域，其包括：1.编码包括蛋白磷酸酶的底物识别同源性2结构域(sh2)和阻遏物结合结构域的第一融合蛋白的第一dna序列；2.编码包括蛋白磷酸酶的底物识别结构域的磷酸盐分子结合结构域、所述蛋白磷酸酶的底物识别结构域和rna聚合酶的ω亚单元(rpoz或rpω)的第二融合蛋白的第二dna序列；4.编码细胞分裂周期37(cdc37)蛋白质的第三dna序列；5.蛋白磷酸酶；和b：在第二启动子的控制下可操作的组合中的第二区域，其包括：6.包括结合所述阻遏物的阻遏物结合结构域的操纵基因，7.核糖体结合位点(rb)；和8.感兴趣的基因(goi)；和ii.具有缺失基因的甲羟戊酸途径操纵子，使得在包括用于产生类萜化合物的第二感兴趣的基因的第三启动子的控制下，所述途径操纵子不含有至少一个产生所述类萜化合物的所述途径中的基因，iii.在包括来自所述甲羟戊酸途径操纵子的所述缺失基因和第三感兴趣的基因的第四启动子的控制下的第四dna序列；和iv.多个大肠杆菌细菌，和b.以用于表达所述第一感兴趣的基因所述第一操纵子转染所述大肠杆菌细菌；c.以用于表达所述第一和所述第二感兴趣的基因的所述甲羟戊酸途径操纵子转染所述大肠杆菌细菌；d.以用于表达所述第一和所述第二和所述第三感兴趣的基因的所述第四dna序列转染所述大肠杆菌细菌；e.生长所述细胞，其中蛋白磷酸酶的所述抑制剂类萜化合物由所述细胞产生。在一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤e.分离所述蛋白磷酸酶抑制剂分子并且提供哺乳动物细胞培养物，用于步骤f.处理所述细胞培养物用于减少所述蛋白磷酸酶的活性。在一个实施方式中，所述方法进一步提供用于诱导所述诱导型启动子的诱导物化合物和将所述细菌与所述化合物接触的步骤。在一个实施方式中，其中减少所述蛋白磷酸酶的活性的所述方法减少所述哺乳动物细胞的生长。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是人ptp1b。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是野生型。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述缺失酶是萜合酶。在一个实施方式中，所述萜合酶选自由紫穗槐二烯合酶(ads)和γ‑蛇麻烯合酶(ghs)组成的组中。在一个实施方式中，所述第四dna序列进一步包括香叶基香叶基二磷酸合酶(gpps)并且所述缺失酶选自由松香二烯合酶(abs)和紫杉烯合酶(txs)组成的组中。在一个实施方式中，所述萜合酶是野生型。在一个实施方式中，所述萜合酶具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述类萜化合物是类萜化合物的结构变体。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是抗生素基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因各自是不同的抗生素基因。28.在一个实施方式中，所述基因编码检测操纵子系统，其包括；a部分：可操作的组合中的dna的第一区域，其包括：编码第一启动子的dna区域；编码第一融合蛋白的第一基因，所述第一融合蛋白包括连接至dna结合蛋白质的底物识别结构域；编码第二融合蛋白的第二基因，所述第二融合蛋白包括连接至能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物结构域；编码第二启动子的dna区域；蛋白激酶的第三基因；分子伴侣的第四基因；蛋白磷酸酶的第五基因；b部分：在第二启动子的控制下可操作的组合中的dna的第二区域，其包括：编码所述dna结合蛋白质的操纵基因的第一dna序列；编码rna聚合酶的结合位点的第二dna序列；和至少一个感兴趣的基因(goi)。在一个实施方式中，所述底物识别结构域为底物同源性2(sh2)结构域。在一个实施方式中，所述dna结合蛋白质是434噬菌体ci阻遏物。在一个实施方式中，所述底物结构域是所述激酶和所述磷酸酶二者的肽底物。在一个实施方式中，能够将rna聚合酶募集至dna的所述蛋白质是rna聚合酶的ω亚单元(rpω)。在一个实施方式中，所述激酶的基因是src激酶基因。在一个实施方式中，所述分子伴侣是cdc37。在一个实施方式中，所述分子伴侣是来自智人的hsp90共伴侣。在一个实施方式中，所述操纵基因是434噬菌体ci操纵基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是抗生素抗性的基因。在一个实施方式中，所述抗生素抗性的基因产生允许细菌降解抗生素蛋白质的酶。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是蛋白酪氨酸磷酸酶1b。在一个实施方式中，a部分的所述第一和第二启动子是组成型启动子。在一个实施方式中，b部分的所述第二启动子是诱导型启动子。29.在一个实施方式中，本发明提供使用基因编码检测操纵子系统的方法，其包括，a.提供，i.抑制剂检测操纵子，其包括a部分：可操作的组合中的dna的第一区域，其包括：1.编码第一启动子的dna区域；2.编码第一融合蛋白的第一基因，所述第一融合蛋白包括连接至dna结合蛋白质的底物识别结构域；3.编码第二融合蛋白的第二基因，所述第二融合蛋白包括连接至能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物结构域；4.编码第二启动子的dna区域；5.蛋白激酶的第三基因；6.分子伴侣的第四基因；7.蛋白磷酸酶的第五基因；b部分：在第二启动子的控制下，可操作的组合中的dna的第二区域，其包括：8.编码所述dna结合蛋白质的操纵基因的第一dna序列；9.编码rna聚合酶的结合位点的第二dna序列；和10.至少一种感兴趣的基因(goi)。ii.在包括产生类萜化合物的第二感兴趣的基因的第四启动子的控制下，不含有萜合酶基因甲羟戊酸盐‑萜途径操纵子，iii.在包括所述萜合酶基因和第三感兴趣的基因的第五启动子的控制下，第四dna序列；和iv.多个细菌，和b.以用于表达所述第一感兴趣的基因的所述抑制剂检测操纵子转染所述细菌；c.以用于表达所述所述第二感兴趣的基因的所述甲羟戊酸途径操纵子转染所述细菌；d.以用于表达所述第三感兴趣的基因的所述第四dna序列转染所述细菌；e.生长表达所述三个感兴趣的基因的所述细菌细胞，其中所述抑制剂类萜化合物通过抑制所述蛋白磷酸酶的所述细菌细胞产生。在一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤e.分离所述蛋白磷酸酶抑制剂分子并且提供哺乳动物细胞培养物，用于步骤f.处理所述细胞培养物用于减少所述蛋白磷酸酶的活性。在一个实施方式中，其中减少所述蛋白磷酸酶的活性的所述方法减少所述哺乳动物细胞的生长。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是人ptp1b。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶是野生型。在一个实施方式中，所述蛋白磷酸酶具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述甲羟戊酸途径操纵子包括用于表达甲羟戊酸激酶(erg12)、磷酸甲羟戊酸激酶(erg8)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mvd1)、异戊烯基焦磷酸异构酶(idi基因)和法尼基焦磷酸(fpp)合酶(ispa)的基因。在一个实施方式中，所述缺失酶是萜合酶。在一个实施方式中，所述萜合酶选自由紫穗槐二烯合酶(ads)和γ‑蛇麻烯合酶(ghs)组成的组中。在一个实施方式中，所述第四dna序列进一步包括香叶基香叶基二磷酸合酶(gpps)，并且所述萜合酶选自由松香二烯合酶(abs)和紫杉烯合酶(txs)组成的组中。在一个实施方式中，所述萜合酶是野生型。在一个实施方式中，所述萜合酶具有至少一个突变。在一个实施方式中，所述类萜化合物是类萜化合物的结构变体。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因是抗生素基因。在一个实施方式中，所述感兴趣的基因各自是不同的抗生素基因。在一个实施方式中，所述方法进一步提供用于诱导所述诱导型启动子的诱导物化合物和将所述细菌与所述化合物接触的步骤。30.在一个实施方式中，本发明提供使用以下二者的方法：(i)用于检测调节酶活性的小分子的基因编码系统和(ii)用于聚酮(polyketide)生物合成的基因编码途径，以鉴定和/或构建调节酶活性的聚酮，所述方法包括，提供，用于检测调节酶活性的小分子的基因编码系统，其包括，可操作的组合中的第一区域，其包括：第一启动子；编码第一融合蛋白的第一基因，所述第一融合蛋白包括连接至dna结合蛋白质的底物识别结构域；编码第二融合蛋白的第二基因，所述第二融合蛋白包括连接至能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物结构域；第二启动子；蛋白激酶的第三基因；分子伴侣的第四基因；蛋白磷酸酶的第五基因；可操作的组合中的第二区域，其包括：编码所述dna结合蛋白质的操纵基因的第一dna序列；编码rna聚合酶的结合位点的第二dna序列；一个或多个感兴趣的基因(goi)；用于聚酮生物合成的基因编码途径，其包括：聚酮合酶的基因；多个大肠杆菌细菌。在一个实施方式中，所述聚酮合酶是6‑脱氧红霉内酯b合酶(debs)。在一个实施方式中，所述聚酮合酶(pks)是不同pks组分的模块化组合(modularcombination)。31.在一个实施方式中，本发明提供使用以下二者的方法：(i)用于检测调节酶活性的小分子的基因编码系统和(ii)用于聚酮生物合成的基因编码途径，以鉴定和/或构建调节酶活性的生物碱，所述方法包括，a.提供，用于检测调节酶活性的小分子的基因编码系统，包括，可操作的组合中的第一区域，其包括：第一启动子；编码第一融合蛋白的第一基因，所述第一融合蛋白包括连接至dna结合蛋白质的底物识别结构域；编码第二融合蛋白的第二基因，所述第二融合蛋白包括连接至能够将rna聚合酶募集至dna的蛋白质的底物结构域；第二启动子；蛋白激酶的第三基因；分子伴侣的第四基因；蛋白磷酸酶的第五基因；可操作的组合中的第二区域，其包括：编码所述dna结合蛋白质的操纵基因的第一dna序列；编码rna聚合酶的结合位点的第二dna序列；一个或多个感兴趣的基因(goi)；用于聚酮生物合成的基因编码途径，其包括，生物碱生物合成的途径；多个大肠杆菌细菌。在一个实施方式中，本文描述了所述生物碱生物合成的途径。32.在一个实施方式中，本发明提供工程化细菌细胞系，其包括表达质粒1、质粒2、质粒3和质粒4。33.在一个实施方式中，本发明提供磷酸酶抑制剂分子，其通过表达质粒1的细菌与诱导表达质粒2中的类萜合成途径操纵子和质粒3中的萜合酶的启动子的诱导物分子接触产生的，其中所述质粒2和质粒3在具有质粒1的所述细菌中共表达。在一个实施方式中，所述质粒2和所述质粒3在诱导型启动子的控制下。在一个实施方式中，所述细菌通过用于诱导所述启动子的可诱导的分子接触。34.在一个实施方式中，本发明提供产生磷酸酶抑制剂分子的细菌菌株。在一个实施方式中，所述抑制剂是类萜分子。附图说明35.专利或申请文件含有至少一张彩色完成的附图。在要求和支付必要的费用后专利局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。36.图1a‑g阐释了开发光控开关磷酸酶，例如ptp1bps的实施方式并且显示了示例性结果。37.图1a阐释了ptp1bps的设计的一个实施方式：lov2的a’α螺旋的光诱导解旋使ptp1b的α7螺旋不稳定，因此，抑制催化。图1b阐释了详细阐述的一个实施方式：在ptp1b的竞争性抑制结构(橙色)中，α7螺旋是稳定的，并且wpd环(黑色)采用闭合、催化上胜任的构象。在载脂蛋白(apo)结构(黄色)中，使α7螺旋紊乱，并且wpd环(蓝色)采用打开、非活化构象。我们在同源的交叉点(1‑7)将ptp1b的c‑末端α7螺旋附着至lov2的n‑末端a’α螺旋以创建lov2的光响应性使α7螺旋不稳定的嵌合体。图1c显示了一个实施方式的优化的示例性结果：构建体7展示出交叉变体的最大动态范围；7.1具有超过7的改善的活性，而7.1(t406a)具有超过7.1的改善的的动态范围。图1d显示了pnpp上ptp1bps的活性的示例性分析，指示光影响kcat，但不影响km。图1e显示了ptp1bps的动态范围类似于不同大小的底物的。图1f显示了两个小分子：p‑硝基苯基‑磷酸盐(或pnpp)和4‑甲基伞形酮基磷酸(或4mu)以及来自egfr的肽结构域的示例性阐释。图1g显示了在455nm光存在和不存在的情况下，(a‑d)交叉位置和(e‑e4)连接体组合物不同的ptp1b‑lov2嵌合体的示例性活性。底物：4‑甲基伞形酮基磷酸。38.图2a‑j显示了ptp1bps的示例性生物物理特性。39.图2a显示了示例性突变，其(i)防止lov2(c450m)中半胱氨酸加合物的形成、(ii)如果是lov2(i532e、i539e和δjα)使a’α和jα螺旋不稳定或(iii)破坏ptp1b(y152a/y153a)的变构网络，减少7.1的光敏性，除了i532e和c450m，降低其比活性。图2b显示了ptp1bps至455nm光的示例性暴露减少其α‑螺旋含量(cd222nm)。图2c显示了α‑螺旋含量的示例性光学调制(即，δ222＝cd222‑黑暗‑cd222‑光)是必要的，但不足够用于催化活性的光学调制。虚线表示了ptp1bwt和lov2wt的等摩尔溶液的δ222。图2d显示了ptp1b的催化结构域中六个色氨酸残基的示例性荧光，其使得能够光学监测其构象状态。图2e‑f显示了ptp1bps的(图2e)α‑螺旋含量和(图2f)色氨酸荧光的示例性热回收。图2g显示了对于α‑螺旋含量的热复位的示例性动力学常数大于色氨酸荧光的热复位的示例性动力学常数，这表明lov2比ptp1b结构域复位更快速。对于最光敏的变体：7.1(t406a)，该差异是最小的。图2h显示了ptp1bps(蓝色)和载脂蛋白ptp1bwt(橙色)的晶体结构的示例性比对，指示了lov2不会扭曲催化结构域的结构。ptp1bps的lov2结构域可不被分解；α7螺旋的开始处的柔性环可能导致lov2在晶格中采用可变方向。显示ptp1b(黄色)的抑制结构的α6和α7螺旋用于参考。图2i显示了可容纳lov2的ptp1bps的晶体结构中的示例性空位(gap)。图2j显示了ptp1b‑lov2融合的示例性晶体是绿色的并且当用455nm光照射时变成透明的；因此，lov2确实存在。a、c和g的误差线表示标准误差(n>3)。注意：ptp1bps对应于来自图1的构建体7.1(t406a)。40.图3a‑d表明了具有ptp1b活性的示例性基于荧光的生物传感器。41.图3a显示了ptp1b活性的传感器的一个实施方式。该传感器由激酶底物结构域、短的柔性连接体和被夹在两个荧光蛋白质(例如，青色荧光蛋白质和黄色荧光蛋白质)之间的磷酸化识别结构域组成。当传感器是以其未磷酸化状态时，两个荧光团之间的共振能量转移(fret)导致cfp荧光减少和yfp荧光增加；当传感器是以其磷酸化状态时，fret的不存在导致相反的作用。图3b显示了供体荧光(cfp)与接纳体荧光(ypet)的比例的示例性增加，证实存在src激酶(即，酪氨酸激酶)。当另外添加(i)edta，其螯合src的金属辅助因子或(ii)ptp1b，其使底物结构域去磷酸化时，该增加不发生。图3c显示了作为a的fret传感器的另一种类的一个实施方式；该实施方式使用mclover3和mruby3。这些蛋白质的激发和发射波长使得它们与基于lov2的成像实验相容。图3d显示了用来自c的传感器示例性重复来自b的实验。42.图4a‑h表明了使用光构建体和荧光标签在活细胞内的磷酸酶活性的示例性证据。43.图4a‑c显示了在cos‑7细胞：(图4a)gfp‑ptp1bps、(图4b)gfp‑ptp1bps‑a和(图4c)gfp‑ptp1bps‑b中表达的三个构建体的实施方式。这里，gfp‑ptp1bps是绿色荧光蛋白(gfp)和来自图1b‑c的7.1(t406a)的n‑末端的融合体(不具有组氨酸标签)；gfp‑ptp1bps‑a是gfp‑ptp1bps和全长ptp1b的c‑末端结构域的融合；和gfp‑ptp1bps‑b是gfp‑ptp1bps和全长ptp1b的c‑末端内质网(er)锚形物(anchor)的融合(见下面)。gfp‑ptp1bps位于胞质溶胶和胞核，而gfp‑ptp1bps‑a和gfp‑ptp1bps‑b位于er。图4d‑h显示了ptp1bps的基于细胞的研究的示例性结果。我们用含有(i)来自图3c‑3d的fret传感器和(ii)ptp1bps或ptp1bps/c450m(光不敏感的突变体)的质粒转化了cos‑7细胞。在该实验中，我们用447nm光照射单个细胞并且立即用561nm光使它们成像。fret比例的光调节的变化(如图3中定义的)允许我们检测ptp1b活性的光调节的变化。图4d‑e显示了在两个时间点：(图4d)用447nm光激发后立即和(图4e)1min后用ptp1bps转化的示例性cos‑7细胞。fret比例的轻微增加(深绿色至浅绿色)证实了ptp1b的光活化。(f‑g)。在两个时间点：(图4f)用447nm光激发后立即和(g)1min后用ptp1bps(c450m)转化了cos‑7细胞。fret比例的可检测的变化的不存在指示d‑e中观察的变化由ptp1b活性的光诱导的变化引起。图4h显示了在1min和2.67min后胞核(nuc)和胞质溶胶(cyt)中观察的fret比例的示例性平均分数变化。ptp1bps的变化比光不敏感的突变体ptp1bps(c450m)的变化更高。误差线指示标准误差。44.图5a‑c阐释了药物发现的实施方式。45.图5a显示了用于鉴定合成酶(右下图)的磷酸酶，即药物靶标(ptp1b的左上图)的示例性用途，其中然后，酶用于提供磷酸酶的抑制剂或调节剂分子，因此显示了使用酶来构建选择的蛋白质靶标的抑制剂的一般框架。图5b显示了结合口袋之间结构关系的示例性分析。基质比较了结合口袋1和能够功能化(例如，p450)或结合至(例如，ptp1b)口袋1内合成的配体的所有其他结合口袋(2至n个)之间的各个特性(例如，体积)。图5c显示了生物合成途径中结合口袋来结合中间体的能力的示例性比较。46.图6阐释了示出ptp1b的变构性地抑制(绿色)和竞争性地抑制(橙色)结构的覆盖的ptp1b(分别为pdb入口1t4j和2f71)，显示了活性‑调节构象变化：lov2的α7螺旋的解旋(蓝色)导致其催化必要的wpd环(右)采用打开的、催化折中的构象。竞争(红色)和变构(黄色)抑制剂分别突出活性位点和变构位点。47.图7a‑b显示了结合亲和力的示例性分析。图7a显示了ptp1b的两个结合伙伴：lmo4和stat3的实施方式。图7b显示了基于ptp1b的色氨酸荧光中结合诱导的变化的示例性结合等温线(配体是tcs401，竞争性抑制剂)。48.图8a‑b阐释了ptp1b(浅蓝色)和step(橙色)的示例性结构比对，图8a，其仅具有31％序列同一性，显示了明显的结构相似性。图8b阐释了ptk6的示例性结构。step和ptk6二者拥有与lov2的n‑末端螺旋的驱动相容的c‑末端α‑螺旋(即，光调制构架类似于图1中描绘的)。49.图9a‑b阐释了构建由红光调节的酶的示例性框架。我们将ptp1b的c‑末端α‑螺旋附着至bphp1的n‑末端α‑螺旋。50.图10a‑b阐释了用于筛选ptp1b的光控开关变体的示例性操纵子。图10a显示了以其活性状态(这里远红外状态)ptp1b去磷酸化底物结构域，防止底物‑sh2缔合，并且因此防止转录的示例性阐释。图10b显示了以其非活性状态(这里，红色状态)磷酸化的底物结构域结合sh2，允许抗生素抗性的基因的转录的示例性阐释。51.图11a‑b阐释了光控开关蛋白质进化的示例性策略。图11a阐释了我们将比较暴露于红光和红外光的复制板上菌落的生长，并且选择展示不同生长的菌落。图11b阐释了我们将进一步表征液体培养物中热门产物(hothit)的光敏性。52.图12a‑b阐释了开发用于测量细胞内磷酸酶或激酶活性的示例性基于fret的传感器。底物和sh2结构域的结合(图12a)增强或(图12b)减少fret，其取决于构架。53.图13显示了成像实验的动画。我们将使得含有不同量的质膜、er和胞质溶胶的亚细胞区(1‑10μm)内的ptp1bps失活，并且我们将使用荧光寿命成像以检查整个细胞中我们基于fret的传感器(来自图12)的磷酸化状态。54.图14a‑d阐释了导向药物设计和发现的示例性开始点。55.图14a阐释了松香酸。图14b表明了通过以0‑400um的浓度(深至浅)的松香酸的ptp1b的抑制。不同拟合的分析指示非竞争性的或混合型抑制。图14c阐释了ptp1b的变构位点中对接(docked)的松香酸(绿色)。因为我们已经显示了松香酸结合至ptp1b的活性位点。插图以黑色突出了活性位点。图14d显示了已知的变构抑制剂(蓝色)的示例性x‑射线晶体结构。56.图15a‑d阐释了类萜合成途径的示例性图15a(甲羟戊酸盐可通过pmevt被合成或添加至媒介)。图15b显示了由用来自a的质粒(不具有p450)转化的大肠杆菌dh5a生成的示例性松香二烯(abietadiene)效价。图15c‑d显示了图15c)产生松香二烯的菌株和图15d产生松香酸的菌株的下列产物的示例性gc‑ms分析：(1)松香二烯、(2)左旋海松二烯和(3)松香酸(对于图15c以10,000离子计数和对于图15d以1,000离子计数)。注意：大肠杆菌dh5a避免蛋白质过度表达在代谢工程化中是常用的*4。57.图16a‑c阐释了示出立体化学、形状、大小和化学官能度的差异的示例性类萜。图16a顺时针方向地阐释了松香酸(1)、新松香酸(2)、左旋海松酸(3)、二氢松香酸(4)。图16b显示了在200um抑制剂存在的情况下ptp1b对10mm的p‑np磷酸盐的示例性初始速率。没有抑制剂(图16c)。误差线＝标准误差(n>5)。58.图17a‑c显示了来自示例性研究的结果。图17aptp1b(红色)和结合至松香酸的ptp1b(蓝色)的n‑hsqc光谱。插图：ptp1b的晶体结构。图17b‑c显示了在图17b对照的培养物提取物(absx)、产生松香二烯(abs)的菌株和产生松香酸(abs/bm3)的菌株和(图17c)各种浓度的松香酸和25um的已知的变构抑制剂(bbr)存在的情况下，ptp1b的示例性色氨酸(w)荧光。误差线表示标准误差(n>5)。59.图18a‑b阐释了图18a立体化学和图18b形状中不同的示例性类萜。插图：abs的i类位点中靶向诱变的残基。60.图19a‑e阐释了示例性类萜图19a羧化的、图19b羟基化的和图19c卤化的二萜。图19d‑e显示了图19dp450bm3和图19estth中靶向诱变的示例性残基。61.图20阐释了upps的示例性watermap分析。相对于大量水，水分子的颜色对应于自由能。62.图21a‑e阐释了ptp1b抑制剂的示例性高通量筛选。63.图21a生长偶联(即，选择；策略1)。图21b)ptp1b活性的fret传感器(策略2)。图21c)fret传感器和图21d)ptp1b构象变化的色氨酸荧光(策略3和4)。图21e，类似于图21a中显示的操纵子的结果，其中用lux取代amp。误差线＝sd(n≥3)。64.图22a‑d阐释了ptp1b的示例性抑制。图22c中的误差线表示se(n≥3独立反应)。65.图22a显示了竞争性抑制(黄色和橙色，pdb入口2f71)和变构性抑制(灰色和黑色，pdb入口1t4j)姿势中ptp1b的骨架的示例性比对。底物和竞争性抑制剂结合至活性位点导致wpd环来采用闭合的(橙色)构象，其通过变构网络使c‑末端α7螺旋稳定；该螺旋在变构性抑制、非竞争性抑制和未抑制的结构中是不可分解的，其展示wpd‑打开构象(黑色)。图22b显示了松香酸(aa)的化学结构的示例性阐释。图22c显示了在aa的增加浓度的存在下，pnpp的ptp1b‑催化水解的示例性初始速率。线显示了对混合抑制的模型的拟合。图22d示例性阐释该模型，其中抑制剂(i)以不同的亲和力结合至酶(e)和酶‑底物复合物(es)。66.图23a‑c阐释了ptp1b‑aa缔合的示例性nmr分析。67.图23a显示了在aa不存在和存在(10:1的ptp1b:aa)下收集的1h‑15n‑hsqc光谱之间的化学位移(δ)的示例性加权差异。红色虚线描绘了大于均值以上的两个标准偏差(σ)的δ值的阈值；灰色条标记了化学位移扩大至识别之外的残基。图23b阐释了ptp1b的示例性晶体结构(pdb入口3a5j，灰色)突出指定残基的位置(蓝色)；覆盖变构位点(pdb入口1t4j，绿色)和活性位点(pdb入口3eb1，黄色)中的抑制剂，用于参考。具有显著的csp的残基(即，δ>δ均值+2σ)遍及蛋白质(红色)分布，并且除了wpd环中的两个残基，已知的结合位点的外侧。图23c阐释了活性位点(上图)和已知的变构位点(下图)的示例性细节，抑制剂来自(图23b)覆盖物(overlaid)。68.图24a‑c阐释了aa结合位点的示例性突变分析。69.图24a阐释了ptp1b的示例性晶体结构(灰色，pdb入口3a5j)，其显示了在下述五个位点处引入的突变的位置：活性位点(红色)、变构位点(绿色)、位点1(橙色)、位点2(黄色)和l11环(蓝色)。覆盖bbr(变构位点，pdb入口1t4j)和tcs401(活性位点，pdb入口1c83)的结合配置用于参考。图24b阐释了在每个位点处引入的示例性破坏性突变。设计突变以改变靶向残基的大小和/或极性。表示为“yaya”(y152a/y153a)的突变，其在之前的研究中被鉴定，减弱了c‑末端和wpd环之间的变构通讯。图24c阐释了由来自(b)的突变引起的抑制(eq.1中的f)中的示例性分数改变。遍及蛋白质分布的五个突变降低了通过aa和tcs401的抑制，但对通过bbr的抑制的作用忽略不计。大多数突变对aa和tcs401的相似作用表明了两种抑制剂结合至活性位点。误差线表示se(来自eq.1中每个v的n≥9独立测量的传播)。70.图25a‑d阐释了aa结合的示例性计算分析。71.图25a‑b阐释了分子动力学模拟的示例性结果：(a)无aa的ptp1b的骨架迹线(trace)和图25b阐释了示例性氨基酸(aa)‑结合状态。迹线的粗细指示了局部运动的振幅和方向(方法)。aa的结合增加了wpd、e和l10环的柔性。wpd和l10环含有具有显著的csp的残基(红色)，表明了md和nmr分析的结果之间的一致性。图25c阐释了aa(绿色)的示例性代表性结合构象。在结合至活性位点，aa(i)与减弱r221和e115之间结合的r221形成氢键和(ii)防止当wpd环闭合时形成的w179和r221之间氢键(红色)的形成。两种作用增强了wpd环的构象动力学。图25d显示了对接计算的示例性结果，与混合型抑制一致：aa的结合防止wpd环闭合和破坏，但不排除，pnpp的结合(蓝色球)。72.图26a‑b阐释了示出立体化学、形状、大小和化学官能度的差异的示例性类萜。图26a)松香酸(aa)的结构类似物：长白楤木酸(ca)、异海松酸(ia)、脱氢枞酸(deaa)和二氢松香酸(diaa)。图26b)饱和度的差异产生效力的显著差异(即，ic50)，但没有选择性。误差线表示95％置信区间。73.图27a‑c病理相关突变的分析。74.图27a阐释了动力学表征的突变的示例性柱状图。接近(<4a)五个或更多个网络残基的所有突变是“有影响的”(即，它们改变kcat或km>50％或对抑制具有可检测的影响)；相反地，非间接突变(non‑consequentialmutation)具有更少邻近网络残基。图27b阐释了ptpib的示例性晶体结构(灰色，pdbruk3a5j)，突出了网络残基上有影响的突变的位置；颜色指示它们是否被引入生物物理研究中或在疾病中发现。图27c阐释了示例性的两个累积分布函数，描述了接近(i)疾病中鉴定的突变和(ii)位点的随机选择的网络残基的数量。两个分布彼此无法区分(p<0.05)，表明疾病相关的突变不优选地在变构网络附近发生。75.图28a‑d阐释了且显示了使用将ptp活性与感兴趣的基因(goi)的输出联系的基因操纵子的示例性数据。76.图28a显示了操纵子a的实施方式。操纵子的实例。s，酪氨酸底物；p，磷酸根基团；ci，434噬菌体ci阻遏物；rpoz和rpω，rna聚合酶的ω亚单元；ciop，434噬菌体ci阻遏物的结合序列；和rb，rna聚合酶(rnap)的结合位点。酪氨酸底物的磷酸化(通过c‑src激酶)导致底物‑rpω融合体与sh2‑ci融合体的结合；接着，该结合事件将rna聚合酶定位于rb，触发goi的转录。ptp1b将底物结构域去磷酸化，防止底物‑rpω融合体和sh2‑ci的缔合，从而，停止goi的转录。接着，ptp1b失活重新使得能够goi转录。图28b阐释了提出的用于膜可渗透的抑制剂的中通量筛选的一个实施方式：大肠杆菌的菌株用操纵子转化并且在小分子存在的情况下生长；ptp1b的小分子抑制剂以剂量依赖性方式调节goi的转录(例如，发光、荧光或抗生素抗性的基因)。条形图显示了数据的预测趋势。图28c显示了操纵子b的实施方式。操纵子能够对于选择性抑制剂筛选。该操纵子包括操纵子a，其具有(i)第二底物‑蛋白质融合体(红色)，一种“诱饵”，其可结合至sh2‑ci融合体，但未特异性结合至dna或rna聚合酶，和(ii)在诱饵的底物结构域上有活性的第二ptp(例如，tc‑ptp)。因为，诱饵和sh2‑ci之间的复合物不触发转录，诱饵通过与ci‑底物竞争结合位点抑制转录。相应地，抑制ptp1b而不抑制tc‑ptp(其使诱饵去磷酸化)的分子—即，选择性抑制剂—引起最大转录活化。相反地，抑制两种酶的分子导致较少活化。图28d显示了操纵子c的实施方式。该操纵子使得能够对光控开关酶筛选。该操纵子包括操纵子a的版本，其中ptp1b已经用ptp1b的光控开关版本替换。在该情况下，goi的转录在不同光源下是不同的(例如，更高或更低)。在显示的实例中，光抑制ptp1b‑lov2嵌合体的活性，因此，增强goi的转录。77.图29a‑b显示了示出goi的磷酸化依赖性表达的示例性初步结果。图29a显示了操纵子a的一个实施方式，其中goi是细菌荧光素酶(luxab)。ptp1b抑制发光(即，减少goi的转录)，而ptp1b的催化非活化版本(ptp1b的抑制版本的模拟物)增强发光。图29b显示了操纵子a的一个实施方式，其中goi是对大观霉素抗性的基因(specr)。ptp1b抑制大观霉素生长，而ptp1b的催化非活化版本(ptp1b的抑制版本的模拟物)增强生长。本文使用的是midt底物。78.图30a‑b阐释了操纵子的优化。79.图30a显示了来自a的操纵子的一个实施方式，其中goi是细菌荧光素酶(luxab)，ptp1b是缺失的，并且底物是来自kras、midt、shca或egfr的肽。尽管所有底物可通过src激酶磷酸化，但是仅两个底物与sh2结构域结合足够紧密，以能够进行超过背景(0％阿拉伯糖)的显著发光。图30b显示了来自a的操纵子的一个实施方式(这里，在单个质粒上含有)，其中goi是细菌荧光素酶(luxab)且ptp1b是缺失的。底物结构域上的y/f突变(蓝色)防止其被磷酸化。rbs位点触发src激酶的表达。80.图31a‑d阐释了操纵子的应用。81.图31a阐释了ptp1b的微生物可合成的抑制剂的筛选的示例性构想。当用操纵子a(或操纵子b)的一个实施方式转化时，能够合成ptp1b‑抑制代谢产物的细胞将产生与不产生这种代谢产物的细胞相比不同的goi输出。因为，松香烷型二萜可(i)抑制ptp1b并且(ii)在大肠杆菌中合成，我们相信含有操纵子a和构建松香烷型二萜的途径两者的大肠杆菌的菌株可被“进化”以构建ptp1b的抑制剂。这里，goi可以是发光或荧光(低通量)或抗生素抗性(高通量)的基因。图31b阐释了光控开关酶的筛选的示例性构想。考虑了ptp1b与lov2或bphp1的融合体(这里，突出的螺旋显示了这两个蛋白质上的n‑末端连接点)。对于该实例，用455nm光照射ptp1b‑lov2减小其活性；用650nm光照射ptp1b‑bphp1融合体减少其活性，而用750nm光照射ptp1b‑bphp1融合体增强其活性。当用操纵子c(其将含有这些融合体之一)转化时，细胞在不同照射条件下将产生不同goi输出。图31c阐释了酶的选择性突变体的筛选的示例性构想。当用操纵子b的版本转化时，其中(i)ptp1b在诱饵上也有是有活性的和(ii)第二ptp(在我们的实例中的tc‑ptp)是缺失的，当ptp1b仅在诱饵底物上有活性时，含有ptp1b的突变体的细胞将最有效地转录goi。图31d阐释了选择性底物的筛选的示例性构想。当用操纵子b的版本转化时，其中(i)诱饵是缺失的，(ii)第一酶(在我们的实例中的ptp1b)在诱导型启动子下，(iii)第二ptp(在我们的实例中的tc‑ptp)在第二诱导型启动子下，和(iv)goi包括抗生素抗性的基因和在非必需底物存在的情况下产生有毒产物的基因，当含有突变的底物结构域的细胞结合至ptp1b，但不结合至tc‑ptp时，其将在条件1(ptp1b的诱导物和非必需底物)和条件2(tc‑ptp的诱导物)二者下生长。82.图32a‑b呈现出进化上保守的变构网络的示例性证据。83.图32a涉及统计耦合分析的示例性结果。橙色和蓝色簇表示两组相互连接的残基，被称为“分区(sector)”，其在氨基酸的非随机分布中展现出强烈的组内相关性。突出变构位点(绿色抑制剂，pdb入口1t4j)、wpd环(紫色球)和活性位点(红色抑制剂，3eb1)用于参考。图32b涉及用md模拟建模的ptp1b的口袋之间串扰的示例性分析。口袋表示为球，根据其沿着md轨迹的持久性着色；每个球的大小指示其md模拟中的平均体积。连接的粗细与口袋中间合并和分裂事件(即，通讯)的频率成正比。独立的两组相互连接的口袋与sca中鉴定的分区紧密相联系，因此，表明这两个分区表示进化上保守的变构网络的不同结构域。在图1的ptp1b‑lov2融合体中，lov2通过利用由分区a限定的变构网络调节ptp1b的活性。因此，用ptp家族的统计耦合分析鉴定分区a指示图1中描述的光控的构架广泛地应用于所有蛋白酪氨酸磷酸酶。84.图33a‑e阐释了连接酶的活性与感兴趣的基因(goi)的表达的基因编码系统的实施方式。图33b‑e中的误差线表示标准偏差，n＝3个生物重复。85.图33a阐释了检测磷酸化依赖性蛋白质‑蛋白质相互作用的细菌双杂交系统的实施方式。组分包括(i)融合至rna聚合酶的ω亚单元的底物结构域(黄色)、(ii)融合至434噬菌体ci阻遏物的sh2结构域(浅蓝色)、(iii)434ci的操纵基因(深绿色)、(iv)rna聚合酶的结合位点(紫色)、(v)src激酶和(vi)ptp1b。底物结构域的src‑催化磷酸化使底物‑sh2相互作用能够活化感兴趣的基因(goi，黑色)的转录。底物结构域的ptp1b‑催化去磷酸化防止该相互作用；ptp1b的抑制重新使其能够进行。图33b涉及来自图33a的双混合系统的实施方式，其(i)缺乏ptp1b和(ii)含有luxab作为goi。我们使用可诱导的质粒来增加特定组分的表达；src的过度表达增强发光。图33c涉及来自图33a的双混合系统的实施方式，其(i)缺乏ptp1b和src二者和(ii)包括“superbinder”sh2结构域(sh2*，即，具有增强其对磷酸肽的亲和力的突变的sh2结构域)、可变底物结构域和luxab作为goi。我们使用可诱导的质粒来增加src的表达；发光对p130cas和midt最突出增加，表明src作用于底物结构域两者。图33d涉及来自具有两种底物：p130cas或midt之一的图33c的双混合系统的实施方式。我们使用第二质粒来过度表达(i)src和ptp1b或(ii)src和ptp1b的失活变体(c215s)。含有ptp1b或ptp1b(c215s)的系统之间发光的差异对于midt是最大的，表明ptp1b作用于该底物。右：双混合系统的优化版本(bb030作为ptp1b的rbs)出现用于参考。图33e显示了使用包括sh2*、midt底物、优化的启动子和核糖体结合位点(ptp1b的bb034)和specr作为goi的优化的b2h进行示例性生长偶联测定的结果。在图的顶部处阐释该系统。示例性生长结果表明ptp1b的失活使大肠杆菌的菌株能够携带该系统以在高浓度的大观霉素(>250μg/ml)存活。86.图34阐释了用于优化图33中描绘的b2h系统的示例性实验。87.图35阐释了用于优化用于生长偶联测定的图33中描绘的b2h系统的示例性实验。88.图36a‑c描绘了类萜的生物合成的示例性代谢途径。89.图36a描绘了用于类萜生物合成的质粒负载途径：(i)pmbis，其携带酿酒酵母的甲羟戊酸‑依赖性类异戊二烯途径，将甲羟戊酸盐转变为异戊基焦磷酸(ipp)和法尼基焦磷酸(fpp)。(ii)pts，其编码萜合酶(ts)，和必要时香叶基香叶基二磷酸合酶(gpps)，将ipp和fpp转变为倍半萜烯和/或二萜。90.图36b描绘了示例性萜合酶：来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶(ads)、来自北美冷杉的γ‑蛇麻烯合酶(ghs)、来自北美冷杉的松香二烯合酶(abs)和来自短叶红豆杉的紫杉烯合酶(txs)。91.图36c显示了含有(i)优化的细菌双混合(b2h)系统的实施方式(即，来自图33e的b2h系统)和(ii)用于类萜生物合成的途径的实施方式(即，来自图35a的途径)二者的大肠杆菌菌株的示例性生长偶联测定的结果。92.图37a‑c提供了通过大肠杆菌的不同菌株产生的类萜的抑制作用的示例性分析。93.图37a描绘了包含(i)无抑制剂和(ii)从含ads的菌株的培养发酵液的提取化合物的dmso的抑制作用的我们分析的结果。图37b描绘了含有(i)来自含ghs的菌株(ghum)的培养发酵液的提取化合物或(ii)来自包括ghs的l450y突变体的菌株的培养发酵液的提取化合物的dmso的抑制作用的我们分析的结果。图37c描绘了含有(i)无抑制剂、(ii)来自含abs的菌株的培养发酵液的提取化合物、(iii)来自含txs的菌株的培养发酵液的提取化合物和(iv)来自含abs的催化失活变体的培养菌株的培养发酵液的提取化合物的dmso的抑制作用的我们分析的结果。94.图38显示了能够在大观霉素存在的情况下生长的ghs突变体的产物特征的示例性分析。95.图39显示了将其他ptp的抑制与细胞存活联系的示例性b2h系统的分析。96.图40a‑e描绘了将酶活性与感兴趣的基因的表达联系的基因编码系统的示例性实施方式，并且那些实施方式应用于(i)抗性突变的预测、(ii)对抗抗性突变的抑制剂的构建和(ii)激酶抑制剂的进化。97.图40a描绘了检查潜在的抗性突变中的示例性第一步骤。通过进化代谢途径以产生抑制已知的药物靶标(例如，ptp1b)的分子；这些分子将允许在选择压力存在(例如，存在大观霉素，一种抗生素)的情况下赋予存活的感兴趣的基因(goi)的表达。图40b描绘了检查潜在的抗性突变中的示例性第二步骤。在大肠杆菌的第二菌株中，我们将用赋予有条件的毒性(例如，sacb，其将蔗糖转变为果聚糖，一种有毒的产物)的第二感兴趣的基因(goi2)替换最初感兴趣的基因；我们将进化药物靶标以变得对内源抑制剂是抗性的，而仍保留其活性。该突变体将防止有毒基因的表达。图40c描绘了对抗抗性突变中的示例性第三步骤。在大肠杆菌的第三菌株中，我们将进化产生抑制突变的药物靶标的分子的代谢途径。这样，我们预测—和通过我们的第二进化的途径，处理—可能导致对基于类萜的药物的抗性的突变。图40d描绘了检测src激酶抑制剂的示例性基因编码系统。简言之，src活性使有毒基因(goi2)能够表达；接着，src的抑制赋予存活。图40e表明了用于图40b中描述的b2h系统的最高原理(roofofprinciple)的一个实施方式。这里显示的系统包括两个goi：specr和sacb。goi的表达在大观霉素存在的情况下赋予存活；goi的表达在蔗糖存在的情况下导致毒性。图像描绘了在各种浓度的蔗糖存在的情况下在大肠杆菌的菌株上进行的生长偶联测定的结果。携带活性形式的ptp1b的菌株(wt)比携带非活化形式的ptp1b的菌株(c215s)在高蔗糖浓度下生长地更好。98.图41a描绘ptp1b抑制剂的进化的示例性策略。99.图41a描绘了用于鉴定萜合酶活性位点中的诱变的靶标的示例性结构分析。其显示了abs(灰色，pdb入口3s9v)和txs(蓝色，pdb入口3p5r)的i类活性位点与abs(红色)上突出的靶向于位点‑饱和诱变(ssm)的位点的位置的比对。txs的底物类似物(黄色)出现用于参考。图41b描绘了用于将多样性引入代谢途径的文库的示例性策略：萜合酶上关键位点的ssm(如在a中)、整个萜合酶基因的易错pcr(epcr)、萜功能化酶上位点的ssm(例如，p450)和整个萜功能化酶的epcr的反复组合。图41c描绘了存在于具有各种含ts的菌株的提取物的dmso样品中总类萜的示例性量化。简言之，我们在ads上的六个位点(类似于图41a中显示的位点)进行位点‑饱和诱变；我们将ssm文库铺在含有不同浓度大观霉素的琼脂平板上；我们挑选在含有高浓度(800μg/ml)大观霉素的板上生长的菌落并且使用每个菌落来接种单独的培养物；我们使用己烷覆盖物来提取分泌入每个培养物发酵液中的类萜；我们在旋转蒸发器中干燥己烷提取物并且在dmso中再悬浮固体；并且我们使用gc‑ms来量化存在于dmso中的类萜的总量。图41d描绘了各种提取物对ptp1b的抑制效果的示例性分析。简言之，该图显示在图41c中量化的类萜存在的情况下，对硝基苯基磷酸盐(pnpp)的ptp1b‑催化水解的初始速率。ads的两个突变体(g439a和g400l)特别地生成有效的ptp1b抑制剂。100.图42描绘了b2h活化和细胞存活之间的联系的示例性分析。大肠杆菌的示例性菌株含有(i)优化的细菌双混合(b2h)系统(图33e)和(ii)图36a中描绘的类萜途径二者。注意：仅当abs或txs存在时，pts包括ggpps；“y/f”操纵子对应于b2h系统，其中底物结构域不能被磷酸化。在高浓度的大观霉素下的存活需要b2h系统的活化(即，底物结构域的磷酸化，一种被ptp1b的抑制促进的过程)。101.图43提供了携带各种萜合酶的大肠杆菌的菌株的示例性产物特征。对于该图，大肠杆菌的菌株携带(i)优化的b2h系统(图33e)和(ii)类萜途径(图36a)。对应每个特征的途径仅在pts质粒的组成上不同，pts质粒含有txs(来自短叶红豆杉的紫杉烯合酶和来自加拿大紫杉的香叶基香叶基二磷酸合酶)；ghs(来自北美冷杉的γ‑蛇麻烯合酶)；ads(来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶)；abs(来自北美冷杉的松香二烯合酶和来自加拿大紫杉的香叶基香叶基二磷酸合酶)；g400a(来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶的g400a突变体)和g439l(来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶的g439l突变体)。注意，ads的两个突变体产生的产物特征与野生型酶(ads)的不同；我们的结果指示产物由这两个突变体生成的产物比由野生型酶生成的那些更是抑制性的(图41e)。102.图44a‑d提供了支持将b2h系统延伸至其他蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)的示例性基于结构和序列的证据。103.图44a提供了示例性结构比对ptp1b和ptpn6，两种与b2h系统相容的ptp(参见用于相容性证据的更新a的图1e和7)。我们使用pymol的对齐功能以将ptpn6的每种结构与ptp1b的催化结构域的(i)无配体(3a5j)或(ii)结合配体(2f71)的结构对齐。对齐功能进行序列比对，随后结构叠加，因此，有效地对齐两种蛋白质的催化结构域。图44b提供了ptp1b和ptpn6的示例性结构比较；ptp1b和ptpn6的对齐结构的均方跟偏差(rmsd)范围从0.75至图44c证明了ptp1b和ptpn6的催化结构域的示例性序列比对(embossneedle1)。图44d提供了ptp1b和tppn6的催化结构域的示例性序列比较。序列共享34.1％序列同一性和53.5％序列相似性。概括来说，该图的结果指示我们的b2h系统可易于延伸至拥有催化结构域的ptp，该催化结构域(i)结构上类似于ptp1b的催化结构域(这里，我们定义结构相似性为这样的两个结构，当对齐时，具有≤rmsd的rmsd，框架类似于通过pymol的对齐功能使用的一个)，和/或(ii)序列类似于ptp1b的催化结构域(这里，我们定义序列相似性为≥34％序列同一性或≥53.5％序列相似性，如由embossneedle算法定义的)。104.定义105.如本文使用的，术语“操纵子”的使用可指在单个启动子的控制下的基因簇(如在操纵子的经典定义中的)和还可指包括多个操纵子的基因编码系统(例如，细菌双杂交系统)。106.如本文使用的，“磷酸化‑调节酶”指调节磷酸化的蛋白质。107.如本文使用的，“磷酸化”指涉及将磷酸盐添加至有机化合物的生物化学过程。108.如本文使用的，“光遗传致动器”指经历光诱导的构象变化的基因可编码蛋白质。109.如本文使用的，“动态范围”指黑暗和光状态中活性的比例(即，黑暗中初始速率/在455nm光存在的情况下初始速率)。110.如本文使用的，“操纵子”指由调节负责蛋白质合成的其他基因的多个基因构成的单元。111.如本文使用的，“可操作地连接”指一个或多个基因(即dna序列)适当地在dna分子中定位和定向，用于转录以从相同启动子被启动。可操作地连接至启动子的dna序列意指dna序列的表达在启动子的的转录启动调节下。112.如本文使用的，“构建体”指工程化的分子，例如连接的dna的碎片(piece)作为dna构建体；作为源自dna构建体的表达的一种连续序列的rna构建体。113.如本文使用的，“融合体(fusion)”指工程化的构建的表达产物，即几个连接序列的组合作为编码最初由两个基因编码的蛋白质‑蛋白质融合体的一个分子或单个基因。114.如本文使用的，“表达载体”或“表达构建体”指为宿主细胞中的构建体的dna表达设计的操纵子、质粒或病毒，其通常含有宿主细胞内可操作的启动子序列。115.如本文使用的，“启动子”指启动特定dna序列的转录的dna区域。启动子位于朝向有义链的5'区域的转录开始位点附近。启动子可以是组成型启动子，比如哺乳动物细胞中的巨细胞病毒(cmv)启动子，或诱导型启动子，比如哺乳动物细胞中的四环素‑诱导型启动子。116.如本文使用的，“转化”指递送至原核宿主细胞中的外源核酸序列或质粒，例如，插入宿主细胞或由宿主细胞吸收的表达质粒(例如质粒表达构建体)。117.如本文使用的，“转染”指将核酸序列插入真核细胞中。118.转化和转染可以是瞬时的，使得被引入宿主细胞中的核酸序列或质粒不会永久地并入细胞基因组中。稳定转化和转染指宿主细胞将外源核酸序列或质粒保留多代，无论核酸或质粒是否整合入宿主细胞的基因组中。119.如本文使用的，关于细胞的“宿主”指旨在接收核酸序列或质粒或已经携带核酸序列或质粒的细胞，例如细菌。120.如本文使用的，“缀合物”指至少两个化合物的共价附着，例如，附着至磷酸酶蛋白质的光敏元件。121.如本文使用的，关于蛋白质构建体的“诱饵”不能结合至dna和/或rna聚合酶。具体实施方式122.本发明涉及基因工程的领域。特别地，本发明涉及产生生物活性剂的操纵子的构建。例如，可构建操纵子以产生控制生物化学途径蛋白质(例如，蛋白磷酸酶、激酶和/或蛋白酶)功能的试剂。这种试剂可包括可用于研究或控制与磷酸酶途径或表达水平异常相关的磷酸酶功能中的抑制剂和调节剂。融合蛋白，比如光活化的蛋白磷酸酶，可被基因编码且被表达为光控开关磷酸酶。提供用于控制活细胞内的磷酸酶功能或鉴定与细胞信号传导相关的蛋白磷酸酶的小分子抑制剂/活化剂/调节剂分子的系统。123.本发明也涉及用于检测和/或构建生物活性剂的基因编码系统(例如，一个或多个操纵子)的组装。例如，可组装系统以便完成一个或多个目标，例如(i)以检测和/或合成影响调节酶(例如，蛋白磷酸酶、激酶和/或蛋白酶)活性的小分子；(ii)以检测和/或进化由光调节的调节酶(例如，光反应蛋白磷酸酶、激酶或蛋白酶)等。小分子调节剂可包括已知与人疾病相关或涉及引起或保持人疾病的磷酸酶的抑制剂；涉及或已知与人疾病(例如，糖尿病、肥胖和癌症)相关的磷酸酶活化剂；这种小分子可用作细胞信号传导的研究中的化学探针；作为结构开始点(即，指引)等，用于治疗人疾病的药物化合物的开发。光敏酶可包括融合至光遗传致动器(例如，如果向光素1是lov结构域)的蛋白酪氨酸磷酸酶。这种融合体可用作对活细胞中的蛋白质酪氨酸磷酸化进行时空控制的工具。124.此外，提供了设计用于鉴定小分子抑制剂、活化剂或调节剂分子、的光控开关酶或生物组分(包括细胞内表达分子)的微生物操纵子，其包括，例如具有用于全细胞微生物筛选测定系统的组分的操纵子。使用本文描述的组合物、系统和方法发现的抑制剂/调节剂分子预期用于治疗疾病比如糖尿病、ii型糖尿病、肥胖、癌症和阿尔茨海默氏疾病等与蛋白磷酸酶相关的其他紊乱。125.在一个实施方式中，本发明涉及蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)。ptp1b代表该研究的有价值的开始点，因为四个原因：(i)它与糖尿病5、肥胖6、癌症30、焦虑31、炎症32、免疫应答7和胚胎干细胞中的神经特化33有关系，(ii)很好理解其亚细胞定位的机制(短c‑末端锚形物将其连接至er；该锚形物的蛋白质水解将其释放至胞质溶胶)2934。(iii)可容易地表达、纯化和分析35，(iv)它是一类结构上相似的酶(ptp)的成员，其可促进快速延伸构架(architecture)以使其可光控开关的。ptp1b表示用于测试光学控制的策略的实验易处理的模型系统和考虑了对其光学调制以允许详细分析各种不同的疾病和生理学过程的酶两者。126.特别地涉及示例性图：图1、2、3、4、8、9、12和13描述了可用操纵子进化、改善或优化光遗传和成像技术(即，光敏酶和基因可编码生物传感器)；图10和11描述了使用操纵子以进化、改善或优化光敏酶的策略；图5、6、14、15、16、17、18、19、20、28、29、30和31支撑了(i)用于检测和/或进化抑制已知的药物靶标的小分子的操纵子的开发和(ii)那些分子的随后表征；图22、23、24、25、26、27和32提供了抑制ptp1b的微生物可合成分子的动力学和和生物物理特性的实例。127.i.与疾病有关的蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)和蛋白酪氨酸激酶(ptk)。128.蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)和蛋白酪氨酸激酶(ptk)是两类酶，其有助于各种疾病(例如，糖尿病、癌症、动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏疾病等)中的异常信号传导事件，并且理解疾病进展14,36。此外，它们涉及调节记忆力、恐惧、食欲、能量消耗和代谢，因此这种磷酸化调节酶的使用可揭露看似不同的生理学过程之间的联系14,22,13。129.本文描述了使用光作为用于控制ptp和ptk的光控开关构建体的实施方式。相应地，除了用于鉴定与特定疾病(比如糖尿病等，包括疾病的亚型，即早发型、晚发型等的，和特定类型的癌症)相关的ptp和/或ptk的特定等位基因(即基因序列或蛋白质)—或其他它们调节的酶，并且用于筛选和测试用于治疗与这些等位基因相关的疾病的分子(包括小分子)的用途，如本文描述的开发的ptp和ptk的光控开关构建体的实例应当对于理解健康的和患病的细胞如何处理化学信号的感兴趣的生物医学研究人员是广泛有用的。130.尽管其他参考文献描述了蛋白质的光控制，其包括使用lov2缀合物，这些参考文献不提及使用磷酸酶。fan等，“opticalcontrolofbiologicalprocessesbylight‑switchableproteins.”wileyinterdisciprevdevbiol.4(5):545‑554.2015。该参考文献描述了蓝光‑氧‑电压‑感受(lov)结构域，其包括来自燕麦向光素的lov2c‑末端α‑螺旋，被称为jα。lov结构域的连接可笼避(cage)感兴趣的蛋白质(poi)，而光诱导的lov结构域构象变化导致其解笼(uncage)。作为一个实例，肽激酶抑制剂可通过与lov2的c‑末端融合被笼避。暴露于光导致用于细胞中光调节蛋白激酶活性的抑制剂的解笼。wo2011133493。2011年10月27日公布的“allostericregulationofkinaseactivity.”。该参考文献描述了融合蛋白，其包括激酶(作为实例包括酪氨酸激酶(src)、丝氨酸/苏氨酸激酶(p38))和配体结合结构域，例如光调节的lov结构域(其中考虑了配体结合的照度)，其被插入n‑末端和/或c‑末端中或催化结构域附近，以使用光依赖性激酶产生变构调节。此外，lov结构域包括来自燕麦向光素i的lov2结构域和/或ja结构域。日文的wo2012111772(a1)，英语摘要。该参考文献摘要描述了用于钙信号传导的光学控制的多肽，其包括包含seqidno:1的lov2结构域的氨基酸序列或与seqidno:1具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。构建体具有lov2结构域，随后在构建体的n末端处具有lov2‑jα光开关。us8859232。“geneticallyencodedphotomanipulationofproteinandpeptideactivity.”，2014年10月14日发布。该参考文献描述了包括蛋白光开关的融合蛋白，和光操纵融合蛋白的活性以研究蛋白质功能和分析亚细胞活性的方法，以及诊断和治疗方法。更特别地，融合蛋白包括融合至包括光、氧或燕麦(燕麦(oat))向光素1的电压(lov2)结构域的蛋白光开关的感兴趣的蛋白质，其中融合蛋白的照度活化感兴趣的蛋白质或使感兴趣的蛋白质失活。感兴趣的蛋白质是人蛋白质的功能结构域。作为实例，向光素1(404‑547)的lov2‑jα序列被融合至raci的n‑末端，以便其闭合构象中的lov结构域将可逆地阻断效应子与raci的结合。131.a.蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)。132.蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)是一类调节酶，在其各种不同的疾病中展示异常活性。因此，对这些酶的变构通讯的详细绘制可揭示影响其催化状态的生理相关的—和可能是治疗有用的—扰动(即突变、翻译后修饰或结合事件)的结构基础。该研究将蛋白酪氨酸磷酸酶ib(ptpib)的详细生物物理研究与大规模生物信息学分析结合，以检查ptp中的变构通讯。x‑射线晶体学、分子动力学模拟和基于序列的统计分析的结果指示，ptpib具有广泛分布的变构网络，其在整个ptp家族中进化上是保守的，并且来自动力学研究的发现显示该网络在序列多样的ptp中是功能上完整的。在该研究中解决的变构网络揭示了靶向ptp变构抑制剂的新位点，并且有助于解释各种疾病相关突变的功能影响。133.在一个实施方式中，如本文描述的酪氨酸磷酸酶和光敏蛋白质可附着至药物，用于医学治疗。与ep2116263相反，2009年11月11日公开的“reversiblylight‑switchabledrug‑conjugates.”未提及酪氨酸磷酸酶，并且其描述了附着至光异构基团b并且还附着至用于医学治疗的药物(这些基团没有一个是基因可编码的)的蛋白磷酸酶钙调磷酸酶的光控开关缀合物。ep2116263中作为一个实例，通过抑制蛋白磷酸酶钙调磷酸酶抑制肿瘤生长。对于近uv(例如370nm)或近ir(例如740nm)诱导的活性的光异构基团b不包括光反应植物蛋白质向光素1lov2n‑末端α螺旋。134.考虑了受体ptp用于缀合至光敏感蛋白质，如本文描述的。相反，karunarathne等，“subcellularoptogenetics–controllingsignalingandsingle‑cellbehavior.”jcellsci.128(1):15‑25,2015描述了光敏结构域，比如细菌光‑氧‑电压‑感受(lov和lov2)结构域，包括c‑末端螺旋jα区域，其连接至受体酪氨酸激酶(rtks)，没有具体的实施例，没有提及酪氨酸磷酸酶或植物向光素1lov2n‑末端α螺旋。显示了肌醇5‑磷酸酶的光活化，但肌醇5‑磷酸酶不是蛋白磷酸酶。135.b.酪氨酸残基的酶促磷酸化。136.酪氨酸残基的酶促磷酸化在细胞功能中起作用，并且在多种疾病(例如糖尿病、癌症、自身免疫失调和noonan综合征)中被异常地调节。它受两类结构上柔性的—和动态可调节的—酶：催化酪氨酸残基的atp依赖性磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(ptk)，和催化磷酸酪氨酸的水解去磷酸化的蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)协同作用的控制(5，6)。通过这些酶对活性‑调节的结构扰动(即，突变、翻译后修饰或结合事件)的应答的机制的详细理解，从而可阐明它们对各种疾病的贡献，并且促进设计新的ptk‑或ptp‑靶向疗法。在过去的几十年中，许多生物物理研究已剖析了ptk的催化机制和调节功能(7，8)，其是药物制剂的常见靶标。(9)相反，ptp的详细分析已经落后了。(10)这些酶表示了生物医学见解和治疗潜力的未开发来源(没有ptp抑制剂已经清除临床试验)；因此，它们是该研究的焦点。137.ptp使用两个环对酪氨酸残基去磷酸化。八个‑残基p‑环通过带正电的精氨酸结合磷酸盐部分，其使附近的半胱氨酸能够亲核攻击，并且十个‑残基wpd环含有普通酸催化剂—天冬氨酸—使酪氨酸离去基团质子化且使磷酸酶中间体水解^11‑13)。在催化期间，p‑环保持固定，而wpd环在打开和闭合状态之间移动～10a；核磁共振(nmr)分析显示该移动控制催化的速率(14)。138.用于治疗糖尿病、肥胖和乳腺癌的药物靶标的蛋白酪氨酸磷酸酶ib(ptpib)的最近分析，指示其wpd环的运动受延伸至其c‑末端的变构网络调节(图1b)(15，16)。该网络通过以下两者：(i)替换其c‑末端a7螺旋的抑制剂(17，18)和(ii)破坏(α)7螺旋和wpd环之间的通讯的突变(15)而易受调制；使在ptp1b和其他ptp中能够变构通讯的残基的特定收集仍没有完全解决。139.蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)。ptp1b表示有价值的用于鉴定潜在疗法的工具，因为至少四个原因：(i)它牵涉糖尿病5、肥胖6、癌症30、焦虑31、炎症32、免疫应答7和胚胎干细胞的神经特化33，(ii)很好理解其亚细胞定位的基础机制(短c‑末端锚形物将其连接至er；该锚形物的蛋白水解将其释放至胞质溶胶)2934。(iii)其可被容易地表达、纯化和分析35，(iv)它是一类结构上相似的可促进快速延伸构架以使其是光控开关的酶(ptp)的成员。因此，ptp1b表示用于测试光学控制的策略的实验易处理的模型系统，也是其光学调制允许详细分析各种不同疾病和生理学过程的酶。140.空间调节和细胞内信号传导。通过示例，ptp1b表明光控开关酶对研究细胞内信号传导中空间调节的价值。假设通过以下使受体酪氨酸激酶失活：(i)内体和er之间的接触37,38，(ii)质膜和er的延伸区域之间的接触39和(iii)通过其部分蛋白水解和释放入胞液中实现直接蛋白质‑蛋白质相互作用34。ptp1b‑底物相互作用的不同机制(或位置)的作用在确定那些相互作用的结果中的角色理解较差。表明了ptp1b的位置和其在信号传导中的作用之间的关系的证据在肿瘤发生的研究中已经呈现。抑制ptp1b可抑制乳腺癌30,40、肺癌3,41、结肠直肠癌9和前列腺癌42,43中肿瘤生长和转移，同时其上调在淋巴瘤中的作用类似3,44。最近证据表明前一种作用可由抑制胞质ptp1b引起45；后者的原因不清楚。目前，没有工具来调查空间上不同的ptp1b亚群对相同细胞内肿瘤相关的信号传导事件的不同影响。ptp1b的光控开关变体代表这种工具。141.网络生物学。信号传导网络通常表示通过线(相互作用)连接的节点(蛋白质)46。这种图捕获了生物化学中继系统(relaysystem)的连通性，但模糊了空间背景—单个相互作用在多个位置发生并且可能刺激多个信号传导效果的能力。该研究开发了一套将能够详细研究空间背景在引导信号通过生物化学网络传播的作用的工具；这种检查有助于理解ptp1b在细胞信号传导(和与肿瘤发生相关的过程)中的作用，并且通常与细胞内空间上不同的亚群中存在的任何酶的研究有关。142.ii.光遗传致动器。143.光遗传致动器(经历光诱导的构象变化的基因可编码蛋白质)提供了在光学控制下安排生物化学事件的方便方式。单独或当融合至其他蛋白质时，它们能够在活细胞中以毫秒和亚微米分辨率进行生物分子传输、结合和催化的光学操作。我们的方式解决了现存技术中两个主要缺陷：观察性干扰和照明使事故减半(halfthestory)。现存的用光控制酶活性的策略干扰蛋白质产生、定位和相互作用(通常通过设计)的天然模式，因此，进行直接问诊和/或控制那些模式—其确定如何处理生物化学信号—是困难的。有几种用光控制蛋白激酶的方法，但没有用于控制蛋白磷酸酶的类似方法。由于信号传导网络受两类酶的协同作用调节，所以那些网络的全面控制和/或详细分析需要两种控制方法。144.本文描述的实施方式包括：(i)在不破坏其野生型活性的情况下用光控制蛋白质活性的方法和(ii)在如下特别重要的蛋白质上的该方法的证明：蛋白质酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)，一种用于治疗糖尿病、肥胖和癌症的细胞信号传导的调节剂和一种验证的药物靶标。没有已知的光控开关蛋白酪氨酸磷酸酶。该文件中报道的ptp1b‑lov2构建体是第一个。(ii)lov2的n‑末端α螺旋在大多数研究(甚至对光开关的综述)中都被忽略，并且还没有被用作酶的光调制的排他性连接点。145.通过将该酶的c‑末端变构结构域融合至蛋白光开关的n‑末端α螺旋(即，来自燕麦的向光素1的lov2结构域)上，我们开发了ptp1b的光控开关版本。我们提出了这样的证据，这种通用构架—在远离ptp1b的活性位点(最小破坏性)的lov2位置上是独特的—可延伸至其他ptp，并且可能ptk。例如，我们使用统计耦合分析以显示在我们的ptp1b设计中利用的变构网络在整个ptp家族中保留。146.单独或当融合至其他蛋白质时，光遗传致动器能够以毫秒和亚微米分辨率进行生物分子传输、结合和催化的光学操作15,16。至少三个缺陷限制其用于详细研究信号传导网络：观察性干扰。现存的用光控制酶活性的策略干扰蛋白质产生、定位和相互作用16,17(通常通过设计)的天然模式，因此，进行那些模式的直接问诊—其确定如何处理生物化学信号10—是困难的。照明使事故减半。有几种用光控制蛋白激酶的方法18,19，但没有用于控制蛋白磷酸酶的类似方法。由于信号传导网络受两类酶的协同作用调节，所以那些网络的详细分析需要两种控制的方法。有限的致动器的调色板(palette)。使亚细胞能够控制酶活性的光遗传致动器需要使用蓝色或绿色的光15。这些波长展示出明显的光毒性20，遭受短的生物渗透深度21，和由于其光谱相似性，将致动限制为单个信号传导事件，而不是同时的多个事件。147.a.光控开关构建体：相对于其他示例性技术的优势。148.如本文描述的，光控开关描述了蛋白质‑蛋白质构架(例如，ptp1b‑lov2融合体)，以其单体形式是光学活性的。参考文献，wo2013016693。“near‑infraredlight‑activatedproteins.”公布日期2013年1月31日，依靠同源二聚化。相反，与wo2013016693中的不同，如本文描述的光学控制超过蛋白质的更大范围，其包括需要同源二聚化的那些和不需要同源二聚化的那些二者。此外，该参考文献描述了感光模块的类型，其包括植物中发现的蓝光‑敏感的黄素蛋白；使用黄素腺嘌呤二核苷酸(bluf)的蓝光光感受器；光、氧或电压感受(lov)类型，其包括植物和细菌光感受器；和对光敏感的植物/微生物光敏素，即红色‑至‑nir区域中光诱导的螺旋旋转。实施例更特别地描述的是基于细菌光敏素(bph)的光活化的融合蛋白，使用融合至蛋白质比如蛋白磷酸酶、蛋白激酶、膜受体等的来自类球红细菌(bphg)的光反应α螺旋。修饰大肠杆菌，以便展示出这些表达的融合蛋白的光活性水平，即在红色‑至‑nir光存在或不存在的情况下。尽管在对光应答中描述了表达融合蛋白的大肠杆菌中的蓝色变化，但是这些蓝色细菌是使用光活化融合蛋白的远红外/nir‑光的结果，所述融合蛋白又在xgal存在的情况下活化lacz表达，而不是对暴露于蓝光的光响应。然而，没有具体提及酪氨酸磷酸酶或植物向光素1lov2n‑末端α螺旋。事实上，关于光遗传的评论倾向于将lov2描述为具有一个末端螺旋：c‑末端jα螺旋。而有研究/专利指示简单的lov2结构域的插入能够进行光控制，它们依赖于以下假设，jα螺旋正在解旋以产生控制效果，不是如本文描述的aα螺旋。149.b.用光控制蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸激酶的“无笼”方法。150.当前的使用光控制酶活性(与其浓度或位置相对)的策略依赖于基于笼的系统：光反应蛋白质当融合至感兴趣的酶时，控制其活性位点的访问16,47。不幸地，这种构架可改变酶对结合伙伴的亲和力并且改变其对活性调节修饰(例如，磷酸化)的敏感性16,18。这些效果使得用光遗传来研究信号传导复杂化。该研究将开发“无笼”、基于变构的光学控制方法，其最小化酶和其底物(和其他结合伙伴)之间的干扰。该方法将帮助保存蛋白质定位、相互作用和翻译后修饰的天然模式，因此，促进那些模式对细胞内信号传导的影响的研究。151.2.基因编码的光控开关磷酸酶。没有基因可编码光控开关磷酸酶；该建议中开发的嵌合体将是第一个。ptp1b的光控开关变体将能够详细研究各种不同感兴趣的ptp1b‑调节过程(例如，胰岛素、内源性大麻素和表皮生长因子信号传导49,51，以及细胞粘合和迁移52)。一般而言，光控开关磷酸酶将提供用于研究细胞生物学的有用的工具类别(特别地和光控开关激酶相呼应，其能够进行互补实验)。152.假设：ptp和ptk的催化结构域拥有c‑末端a‑螺旋，所述c‑末端a‑螺旋远离其活性位点，仍能够调节其催化活性(对于至少酶的子集—该功能的普遍性是未知的)23,24。我们假设，该螺旋与来自燕麦的向光素1的光‑氧电压2(lov2)结构域—一种具有响应蓝光解旋的末端螺旋的感光结构域25,26—的n‑末端a‑螺旋的融合将生产酶‑lov2嵌合体，其展示光依赖性催化活性，仍保留其天然底物特异性和结合亲和力。153.实验方法：我们在同源的交叉点处将ptp1b的c‑末端a‑螺旋附着至lov2的n‑末端a‑螺旋，并且我们将评估光活化对所得嵌合体的催化活性的影响。该尝试将涉及使用(i)动力学测定和结合研究以表征底物特异性和光控开关构建体的结合亲和力和(ii)晶体学和光谱学分析以检查光控制的结构基础。通过这些研究提供信息，我们将我们的方法延伸至纹状体富集的蛋白酪氨酸磷酸酶(step)和蛋白酪氨酸激酶6(ptk6)，分别牵涉阿尔茨海默氏疾病和三阴性乳腺癌的酶。154.我们将组合精密的生物物理研究、合成生物学和荧光显微镜以(i)开发这样的蛋白质构架，其能够光学控制蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)和蛋白酪氨酸激酶(ptk)，而不会干扰其野生型活性或结合特异性，(ii)进化通过红光调节的ptp和ptk，和(iii)开发成像方法以研究活细胞中空间定位的信号传导事件。155.我们将以ptp1b开始我们的研究，ptp1b是一种验证的治疗糖尿病、肥胖和乳腺癌的药物靶标和其光遗传工具将特别地用于解决当前的知识的空缺(例如，空间上不同的ptp1b亚群促进或抑制肿瘤的生长的作用22)的酶。使用其作为模型，我们将通过将它们延伸至其他ptp和ptk建立我们的方法的普遍性。156.c.ptp1b的光控开关变体。157.我们的第一个目标寻求使用lov2(一种具有响应蓝光解旋的末端螺旋的蛋白质)来控制ptp1b(一种用于c‑末端a‑螺旋的解旋通过扭曲其催化必要的wpd环破坏活性的酶)的活性(图1ab，图6)。为了评估该目标的可行性，我们构建了五个ptp1b‑lov2嵌合体(在同源交叉点处连接)：三个嵌合体对4‑甲基伞形磷酸酯(4m)显示光依赖性催化活性(图1g)。随后对一种嵌合体的突变分析指示，将ptp1b连接至lov2的a‑螺旋中的突变可改善催化活性和动态范围(dr，黑暗/光活性的比例；图1g)。我们通过筛选少量构建体来构建—和开始优化—光控开关ptp1b‑lov2嵌合体的能力表明，合理的设计将允许我们构建足够用于细胞内信号传导研究的嵌合体。我们注意到：我们大多数光控开关嵌合体具有2.2的dr；先前的成像研究表明，3‑10的dr足够控制细胞内信号传导218,19。158.更具体地说，图1c展示了相对于其他类型的光学控制的一些差异。顶部图的y‑轴指示在黑暗中每种构建体的活性(即，ptp1b催化的对硝基苯基磷酸酯水解的初始速率)；底部图的y‑轴指示在黑暗和光状态下的活性比例(即，在黑暗中的初始速率/在455nm光存在的情况下的初始速率)，即动态范围。159.黑色条显示交叉点不同的一组八个初始构建体的活性和动态范围(参见图1b的底部)。这些构建体的一些是光控开关，而一些不是。版本7显示了最大光控开关能力—动态范围是约1.8。160.更特别地，颜色与不同类型的构建体相关。黑色：不同交叉点(对于交叉点，参见图1b)；灰色：连接体的不同分区(参见，以下连接体部分)；浅蓝色：jα螺旋—这是在lov2结构域的c‑末端；深蓝色：a'α螺旋—这是在lov2结构域的n‑末端，并且因此，在将其连接至ptp1b的区域上；黄色：ptp1b的α7螺旋—这是在ptp1b的c‑末端，并且因此，在将ptp1b连接至lov2的区域上；橙色：组合：来自先前颜色的位点的组合，另外信息参见以下。161.这些结果是令人惊讶的，部分是因为最近对光遗传学的评论显示，光控制活性需要lov2的jα螺旋(其中jα是c‑末端螺旋，其以抵靠(against)lov域核心的折叠状态驻留)附着至感兴趣的蛋白质，参见repina,n.a.,rosenbloom,a.,mukherjee,a.,schaffer,d.v.&kane,r.s.atlightspeed:advancesinoptogeneticsystemsforregulatingcellsignalingandbehavior.annu.rev.chem.biomol.eng.8,13–39(2017)。用蓝光的光活化将lov核心与其结合的黄素发色团fmn之间的非共价相互作用通过保守的半胱氨酸残基转化为共价相互作用。伴随的光诱导的构象变化使jα螺旋移开远离蛋白质核心，导致融合的效应子结构域(例如，phot1的激酶结构域)解笼。由于蛋白质‑辅因子键的自发衰减，jα螺旋在几分钟内恢复至其黑暗状态笼状构象。162.天然aslov2结构域的几个限制促使人们努力工程化改进的变体。首先，当融合至外源蛋白质结构域时，jα螺旋的自发分离(undocking)可导致相对高的黑暗状态活性，导致aslov2解笼后的低动态范围(26)。例如，光诱导的dna结合系统lovtap在黑暗和照明状态之间的dna亲和力只具有五倍的变化(27)。为了解决这个问题，strickland等(26)使用合理的设计将四个突变引入aslov2中，这稳定了jα与lov核心的对接。这使lovtap的动态范围从5倍增加至70倍，方法可应用于其他lov结构域光遗传系统，以减少黑暗状态活性。aslov2融合体对连接体长度以及附着的结构域的大小和结构也特别地敏感(28，29)，因此，每个新的融合蛋白开关需要优化，以实现哺乳动物细胞中低黑暗状态和高光状态活性。163.与jα螺旋‑蛋白质嵌合体相反，如本文显示，a’α螺旋而不jα螺旋附着至感兴趣的蛋白质以形成光控开关构建体，例如ptpb1。164.示例性连接体。165.图1c的灰色条显示了版本7的突变体的活性和动态范围，其中连接体已被重新分区。换句话说，版本7具有以下连接体区域：lshedlattl，其中加下划线的区域“lshed”对应于ptp1b的c‑末端，而区域“lattl”对应于lov2的n‑末端。版本7.1具有序列lshedattl；版本7.2具有序列lshedttl等。这里，我们发现版本7.1与版本7具有相同动态范围，但活性更高。因此，我们使用版本7.1用于进一步优化。166.示例性突变体。167.浅蓝色条显示了版本7.1的突变体的活性和动态范围，其中jα螺旋含有螺旋‑稳定的突变。奇怪的是，这些提高了7.1的活性，但未提高其动态范围。168.深蓝色条显示了版本7.1的突变体的活性和动态范围，其中a’α螺旋含有螺旋‑稳定的突变。这些突变之一(t406a)提高了动态范围；我们使用该版本进一步研究。169.黄色条显示了版本7.1的突变体的活性和动态范围，其中ptp1b的α7具有螺旋‑稳定的突变；橙色条显示了版本7.1的突变体的活性和动态范围，其中组合多个突变。与黄色和橙色条相关的构建体没有一个显示提高的7.1(t406a)的特性。170.最小破坏性方法。两个动力学研究指示，我们用于光控制的构架不干扰天然底物特异性或ptp1b的结合行为：(i)嵌合体e3(来自图1d)对对硝基苯基磷酸酯(pn)的活性分析指示，光影响kcat，但不影响km(图2k和l)。(ii)对三种不同大小的底物(4m、pn和肽)的活性分析显示，所有三种的dr相同(图2l‑k)。两个研究的结果与我们假设的光控制机制一致：lov2诱导的ptp1b的c‑末端a‑螺旋的解旋破坏了其催化必要的wpd环的移动，wpd环控制了催化的速率，但对底物结合亲和力影响很小。171.生物物理研究。光控开关嵌合体表达的效价(‑100mg/l)足以进行详细的生物物理分析。我们对嵌合体e3进行了一组初步的这些分析。(i)我们使用圆形二色性(cd)以检查光活化对其二级结构的影响；光谱测量指示光活化减少了a‑螺旋含量(222nm；图2b)。(ii)我们使用222nm处的振幅以测量a‑螺旋含量的活化后恢复时间：tr‑30s(图2e)。该值类似于先前开发的基于lov2的光控开关构建体的恢复时间，(iii)我们使用色氨酸荧光以测量色氨酸残基的活化后恢复时间：tr‑50s(图2f)。色氨酸荧光是ptp1b构象的粗略度量(与lov2中的一个相比，其具有七个色氨酸残基)。因此，该较慢的恢复时间表明ptp1b比lov2需要更长时间重新折叠。(iv)我们鉴定了一组结晶条件(以前用于结晶ptp1bwt的那些条件)以生长e3的晶体(图2f)。(v)我们收集了ptp1bwt的二维1h‑15nhsqc光谱，并且指定了‑65％的非脯氨酸峰。这些最近的nmr实验必须包括ptp1b‑lov2嵌合体；但是我们容易进行它们(一次尝试)表明嵌合体的相似分析是直接的。ptp1b‑lov2嵌合体的实验易处理性将能使具有不同光物理特性的变体能够进行全面的生物物理分析。172.示例1.开发“无笼”方法以用光控制蛋白酪氨酸磷酸酶和激酶。本部分开发了将酶放置于光学控制下而不破坏其天然相互作用的方法。我们将用ptp1b表明该方法，然后，将其延伸至step和ptk6。当我们具有在光和黑暗状态之间展现出三到十倍的活性变化的ptp1b‑lov2嵌合体时，以及当我们鉴定了促进微调ptp1b、step和ptk6的光控开关变体的光物理特性的基于结构的设计规则时，我们将知道我们是成功的。173.d.ptp1b的光控开关变体的开发。174.本部分中的工作假定——并且用晶体学、动力学和结合研究尝试证实——位于远离活性位点的光遗传致动系统不太可能破坏位于附近的致动系统的野生型行为。初步ptp1b‑lov2嵌合体的动力学研究(即，其中ptp1b的c‑末端螺旋连接至来自燕麦的向光素1的lov2结构域的n‑末端螺旋的嵌合体)支持该假说：光通过影响kcat而不是km抑制其活性，并且它们在4‑甲基伞形酮基磷酸酯(4m)(一种模型底物)上显示野生型动力学(图1g和图2k)。kcat而不是km的光调制表明lov2利用变构网络以扭曲wpd环(图6)。175.我们的初始构建体，其代表首先报道的示例光控开关蛋白磷酸酶，将促进不同嵌合体构架的功能优势的系统研究。我们特别感兴趣的是了解(i)连接ptp1b和lov2的连接体的长度和(ii)lov2的末端螺旋的稳定性如何影响催化活性和动态范围。我们将通过结合光谱分析与动力学研究来研究这些关系。光谱分析将显示不同ptp1b‑lov2嵌合体在照度下如何重排的(例如，我们将使用cd和荧光光谱来测量a‑螺旋含量和色氨酸荧光的光调制)，并且动力学研究将揭示那些重排对催化活性和动态范围的影响。176.我们的生物物理分析结果将有助于优化我们的嵌合体，用于体外细胞研究。我们将靶向具有以下特性的嵌合体(以下称为ptp1bps)：3‑10的动态范围(dr)、tr～15‑60s的恢复时间和野生型活性(以其活化状态)。以前的光遗传研究表明这些属性使细胞信号传导能够光学控制2,18,19。我们注意到：ptp1b的生物物理研究指示去除其c‑末端a‑螺旋可减少其活性四分之三(afactoroffour)57；相应地，我们相信lov2可调节ptp1b的活性至少四倍(当然，lov2可与简单的截断的那些相比更明显触发结构扭曲。177.e.ptp1b‑底物和ptp1b‑蛋白质相互作用的表征。178.我们将通过使用动力学分析评估lov2对ptp1b的底物特异性的影响。特别地，我们将比较ptp1bwt和ptp1bps对以下三种底物的活性：(i)对硝基苯基磷酸酯，一种酪氨酸磷酸酶的一般底物、(ii)etgteepymkmdlg，一种与ptp1b密切相关的ptp底物和(iii)rrliedaepyaarg，一种对ptp1b特异性的底物。比较这些底物的kcat和km值(图2k显示示例动力学研究)将揭示ptp1bwt和ptp1bps的催化活性和特异性的差异。这些研究还将允许我们来评估光控开关能力(即，dr)的底物依赖性。通常假定光调制不依赖与底物。然而，这种假设没有生物化学基础(特别地在基于笼的系统中，其中底物可以不同亲和力结合，因此具有与笼形蛋白竞争的不同能力)。我们将测试其。179.我们将通过测量两种酶对ptp1bwt的两个天然结合伴侣：lm04和stat3的亲和力，来评估ptp1bps参与与ptp1bwt相同的蛋白质‑蛋白质相互作用的能力。基于ptp1b的色氨酸荧光变化的结合等温线将促进该研究(图7)。180.我们的ptp1bwt和ptp1bps的生物化学比较可能看起来很乏味，但是我们认为该分析对建立未来光遗传学观察与野生型过程的相关性是必要的。181.生物结构表征。我们将通过使用x‑射线晶体学和nmr光谱研究在ptp1bps中光控制的结构基础。x‑射线晶体结构将显示lov2如何影响ptp1b的结构(并且反之亦然)；nmr光谱将显示lov2如何调节催化活性。对于晶体学研究，我们将通过筛选先前用于lov2、ptp1b和lov2‑蛋白质嵌合体(其全部具有晶体结构有2,35,58)的结晶条件在其黑暗状态下结晶ptp1bps(我们将使用c450s突变，其防止半胱氨酸加合物的形成2,26)；初步结果表明些用于生长ptp1bwt晶体的那些也产生ptp1b‑lov2嵌合体的晶体(图2j)。对于nmr研究，我们将使用异核单量子相干(hsqc)光谱和横向弛豫优化光谱(trosy)来监控照射之前和之后ptp1bps的构象和骨架动力学的变化。(我们注意到：骨架1h、13c和15n化学位移已分配给ptp1b和lov259,60)。182.g.研究活细胞中亚细胞信号传导事件的示例性成像方法。183.本部分使用ptp1bps(ptp1b‑lov2嵌合体)以开发使用共焦显微术探查和研究亚细胞信号传导事件的方法。我们将知道当我们可以使亚细胞区域内失活，用基于fret的传感器监测该失活的效果和分开ptp1b的不同亚群(例如，er结合的胞质的)对传感器磷酸化的贡献时，这个目标是成功的。184.假设。ptp和ptk的亚细胞定位由接近其催化核心的结构域控制23,24。我们假设这些结构域对光控开关嵌合体的附着将供给它们野生型定位模式，并且能够使用共焦显微术研究ptp和ptk在空间上不同的亚群对细胞信号传导的贡献。实验方法：在细胞内，ptp1b存在于两个空间上不同的亚群：附着至内质网的胞质表面，并且游离于胞质溶胶中—其短(‑80残基)c‑末端er锚形物的蛋白水解的结果。我们将(i)使得野生型ptp1b(ptp1bwt)的er锚形物附着至我们的ptp1b‑lov2嵌合体，(ii)比较所得嵌合体与ptp1bwt嵌合体的亚细胞定位，(iii)使用共焦显微术—结合用于磷酸酶活性的基于fret的传感器—来控制和监测细胞内的ptp1b活性，和(iv)开发反应扩散模型以评估ptp1b的空间上不同亚群对传感器磷酸化随时间和空间变化的贡献。该工作将为研究活细胞中空间定位的信号传导事件产生通用方法。185.ptp1bps的定位。186.为了检查活细胞中ptp1bps的定位，我们将在cos‑7细胞中表达三种变体(i)ptp1bps_c45os、(ii)附着至仅含有跨膜结构域(但不含有蛋白水解位点)的ptp1bwt的c‑末端er锚形物的短片段(‑20氨基酸29)的ptp1bps_c45os和(iii)附着至ptp1bwt的全部c‑末端er锚形物(～80氨基酸29)的ptp1bps‑c45os。我们假设这些构建体将分别具有(i)胞质定位模式、(ii)er‑结合定位模式和(iii)胞质的和er‑结合(即，野生型)定位模式两者。使用共焦显微术，我们将通过使用lov2的荧光以定位每个嵌合体来测试该假设70。(在这些研究中，我们将用荧光标记的sec61b(一种er相关的传输复合物)定位er71。以其荧光状态锁定lov2的c450s突变，将防止成像期间的光活化)。187.cos‑7细胞，源自非洲绿猴肾组织的成纤维细胞样细胞，特别是与上述分析相兼容，有三个原因：(i)它们大而扁平，因此促进空间分隔的亚细胞区域的成像72，(ii)它们与商业上可得的转染剂相容73，(iii)诱导内吞作用71和钙蛋白酶表达74(这两个过程影响亚细胞活性和ptp1b的定位)的方法很好开发用于这些细胞。188.活细胞中ptp1bps的控制。我们将通过共焦显微术与用于蛋白质磷酸化的基于fret的传感器配对来检查亚细胞区域内ptp1b的活性(由umezawagroup开发的54；图12)。该传感器将由激酶底物结构域、短的柔性连接体和磷酸化识别结构域组成——所有被夹在两种荧光蛋白(clover，绿色荧光蛋白和mruby2，红色荧光蛋白质)之间。底物结构域的磷酸化将导致其结合至识别结构域，从而调节(即，增强或或减少)两种荧光蛋白之间的fret。使用与ptp1b和src相容的底物和sh2结构域23,55的我们的初步传感器响应磷酸化展现出fret的20％变化。我们将尝试通过筛选不同的底物结构域、sh2结构域和连接体长度来进一步优化我们的传感器。ouyang等建立了用于src激酶活性的fret传感器，其当磷酸化时展现出‑120％的fret变化55。我们将使用该传感器的架构—或可能是传感器本身—来报告我们的设计。189.在我们的成像实验中，我们将使用455nm激光以使亚细胞区域(1‑10urn圈)内的ptp1b失活和荧光寿命成像显微镜(flim)来监测由失活引起的传感器磷酸化的变化(图13)。对于这些实验，我们将使用sirna来消耗ptp1bwt和sec61b以标记er。输出将是一系列图像，其中像素的强度与clover的荧光寿命(和，因此，传感器磷酸化的程度)成比例。190.用该研究，我们特别感兴趣研究(i)ptpibps活化/失活的位置、(ii)活化/失活区域的大小和(iii)传感器的磷酸化状态变化的位置和时间之间的关系。我们将使用反应扩散模型研究这些关系。方程式1提供了简单的控制方程式示例：[0191][0192]勇敢与磷酸化的传感器(sp)。这里，ds是传感器的扩散系数；ks是结合至未磷酸化的传感器的酪氨酸激酶的浓度；psp是结合至磷酸化的传感器的ptp1b的浓度；p和sp分别是游离ptp1b和游离磷酸化的传感器的浓度；k^at和k^at分别是酪氨酸激酶和ptp1b的催化常数；和k％n是传感器‑ptp1b缔合的动力学常数。假定激酶和磷酸酶仅与它们的产物弱结合(假设以后可容易地重新检查)。我们还可以使用比如bionetgen的工具补充该模型，bionetgen是基于网络的平台，用于从用户指定的生物分子相互作用的机制和位置的规则来产生生物化学相互作用75；可适应细胞异质性的这种工具(例如，细胞器和其他隔室)，将有助于支持和扩展我们的动力学模型。[0193]我们假设，在胞质ptp1bps存在的情况下，其中磷酸酶自由扩散的我们的动力学模型的版本将更精确地捕获传感器的磷酸化状态(在从辐射区域指定的时间和位置)。相反，在er‑结合ptp1bps存在的情况下，其中磷酸酶不能自由扩散的模型的版本将更精确地捕获传感器的行为。针对成像数据的任一模型的回归，将能够评估胞质的和er‑结合的ptp1b对传感器磷酸化随着时间和空间变化的贡献程度。[0194]图像分析。er作为遍布整个细胞的泡状网络存在；使完全是er或完全是胞质溶胶的亚细胞区域失活是困难的。为了能够分析在空间上不同的ptp1b亚群，因此，我们必须评估辐射的不同区域中的er量。er异质性(‑20‑100pm)和辐照(‑1‑10pm)的长度尺度的差异将允许这种评估。我们将用两个度量：(i)标记的er的总荧光和(ii)标记的er的各向异性工作。通过促进评估照明区域中胞质的和er‑结合的ptp1b的种群，这两个度量将有助于我们来评估那些种群对传感器磷酸化变化的贡献。[0195]空间调控和细胞内信号传导。[0196]通过示例，ptp1b表明了光控开关酶对研究细胞内信号传导的空间调控的价值。假设通过以下使受体酪氨酸激酶失活：(i)内体与er之间的接触37,38，(ii)质膜与er的延伸区域之间的接触39，和(iii)通过其部分蛋白水解和释放入胞质溶胶中能够进行直接蛋白质‑蛋白质相互作用34。ptp1b‑底物相互作用的不同机制(或位置)在确定那些相互作用的结果中的作用理解甚少。表明了ptp1b的位置和其在信号传导中的作用之间的关系的证据在肿瘤发生的研究中出现。抑制ptp1b可抑制乳腺癌30,40、肺癌3,41、结肠直肠癌9和前列腺癌42,43中肿瘤生长和转移，而其上调在淋巴瘤中作用类似3,44。最近证据表明前一种作用可由抑制胞质ptp1b引起45；后者的原因不清楚。目前，没有工具来调查空间上不用的ptp1b亚群的对相同细胞内肿瘤相关的信号传导事件的不同影响。ptp1b的光控开关变体代表这种工具。[0197]网络生物学。信号传导网络通常表示通过线(相互作用)连接的节点(蛋白质)46。这种图捕获了生物化学中继系统的连通性，但模糊了空间背景—单个相互作用在多个位置发生，并且可能刺激多个信号传导效果的能力。该研究开发了一套工具将能够详细研究空间背景在引导信号通过信号生物化学网络传播的作用；例如，理解ptp1b在细胞信号传导(和与肿瘤发生相关的过程)中的作用，并且通常与细胞内空间上不同的亚群中存在的任何酶的研究有关。[0198]蛋白酪氨酸磷酸酶和激酶的方法的一般化。[0199]两个观察表明用于光控制的我们的构架(即，lov2的n‑末端与酶的c‑末端a‑螺旋的附着)广泛地应用于ptp和ptk。(i)结构比对显示所有ptp都拥有或具有一些突变，可拥有与ptp1b相同的变构通讯网络(图8a)23。(ii)ptk含有c‑末端a‑螺旋，其在其活性位点的远端，但还能够调节其催化活性(图8b)61。[0200]我们将通过构建纹状体富含的蛋白酪氨酸磷酸酶(step)和蛋白酪氨酸激酶6的光控开关变体来评估我们方法的通用性(ptk6；图8a)。step是神经元特异性磷酸酶，其在几种神经紊乱，主要是阿尔茨海默氏疾病、精神分裂症和药物上瘾中过度活跃62,63。ptk6(其可在一些信号传导途径中与ptp1b正交(orthogonally)起作用)在近似70％的三阴性乳腺癌中表达，并且促进转移50,64。step和ptk6的光控开关变体(都存在于细胞内多个空间上不同的亚群中50,62)，将能够详细研究其细胞内信号传导作用，其仍然被差地表征。[0201]对于step和ptk6，我们将通过使用几种动力学测定开发和测量光控开关嵌合体的底物特异性。对于step，我们将使用类似于以ptp1b采用的那些测定。对于ptk6，我们将使用由promega，inc.开发的adp‑glo试剂盒65。与任何肽底物相容的该测定将由ptk‑催化的肽磷酸化产生的adp转变为发光信号。对于这两种酶，我们将收集最佳嵌合体的晶体结构。[0202]用于在哺乳动物细胞中或在微生物细胞的操纵子内表达的示例性光控开关构建体序列。在一些实施方式中，可优化序列用于微生物表达。[0203]pptp1b‑lov2，版本7.1(t406a)：dna序列seqidno:xx：[0204][0205]蛋白质序列：seqidno:xx：[0206][0207]ptp1b‑lov2，版本7.1(s286a)：dna序列：seqidno:xx：[0208][0209][0210]蛋白质序列：seqidno:xx：[0211][0212][0213]tcptp‑lov2，最佳版本：[0214]dna序列：seqidno:xx：[0215][0216][0217]加下划线的字母指示来自ptp1b的序列。蛋白质序列：seqidno:xx：[0218][0219]tcptp‑lov2v2：dna序列：seqidno:xx：[0220][0221][0222]蛋白质序列：seqidno:xx：[0223][0224]fret传感器。考虑了forster共振能量转移(fret)用于监测活细胞中ptp1b的活性。当用src激酶处理时，传感器展示出fret信号降低20％(图21b)。先前的成像研究指示，fret20％的变化足以监测细胞内激酶活性54‑56。为了在成像研究中提高空间分辨率，我们将尝试进一步优化我们的传感器(并将其用于体外测量ptp1b的活性)。[0225]示例性fret传感器：加下划线的mclover3‑sh2‑连接体‑加粗底物–加下划线的和加粗mruby3。[0226]mclover3‑mruby3：dna序列：seqidno:xx：[0227][0228][0229]蛋白质序列：seqidno:xx：[0230][0231]示例性哺乳动物表达载体用于在哺乳动物细胞中表达光控开关构建体。[0232]对于插入哺乳动物表达载体，例如慢病毒载体，pacgfp1‑c1(clontech)；ptp1b‑lov2(上面)；启动子，例如cmv：seqidno:xx：gcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatc；rbs，例如kozak共有翻译起始位点：gccaccatg；基因内间隔区，例如p2a：dna序列：seqidno:xx：ggcagcggcgccaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggcccc；蛋白质序列：gsgatnfsllkqagdveenpgp等。[0233]示例性fret传感器包括：启动子：与以上相同；rbs：与以上相同等。[0234]考虑了示例性fret传感器以避免lov2的激发/发射波长(455/495，我们注意到lov2仅是弱的荧光70)和我们的fret对(clover的505/515和mruby2的560/605)之间的重叠。而我们仍然希望在成像期间看到一些串扰，以前的三色成像研究71表明其将不会干扰我们进行本部分中描述的实验的能力。[0235]考虑的实施方式包括但不限于侵袭性伪足形成和egfr调节。[0236]考虑了ptp1b的光控开关变体以确定通过蛋白水解从er释放的胞质ptp1b是否专门负责调节侵袭性伪足的形成，或er结合ptp1b是否可起到相似的作用。侵袭性伪足——使基质能够降解的富含肌动蛋白的突起的——形成促进了癌细胞侵入和转移45。[0237]ptp1b和ptk6二者调节表皮生长因子受体(egfr)，一种在许多癌症和炎症性疾病中展示处异常活性的细胞增殖和迁移的调节剂51,76。我们将使用通过红光刺激的ptp1b变体和通过蓝光刺激的ptk6变体(或反之亦然)来进行ptp1b和ptk6对细胞不同区域内egfr调节的协同贡献的组合分析。[0238]第i部分、第ii部分和第v部分的参考文献列于以下并通过引用并入本文：[0239]1.wray,j.,kalkan,t.,gomez‑lopez,s.,eckardt,d.,cook,a.,kemler,r.&smith,a.inhibitionofglycogensynthasekinase‑3alleviatestcf3repressionofthepluripotencynetworkandincreasesembryonicstemcellresistancetodifferentiation.nat.cellbiol.13,838‑45(2011).[0240]2.wu,y.i.,frey,d.,lungu,o.i.,jaehrig,a.,schlichting,i.,kuhlman,b.&hahn,k.m.ageneticallyencodedphotoactivatableraccontrolsthemotilityoflivingcells.nature461,104‑108(2009).[0241]3.liu,h.,wu,y.,zhu,s.,liang,w.,wang,z.,wang,y.,lv,t.,yao,y.,yuan,d.&song,y.ptp1bpromotescellproliferationandmetastasisthroughactivatingsrcanderk1/2innon‑smallcelllungcancer.cancerlett.359,218‑225(2015).[0242]4.danial,n.n.&korsmeyer,s.j.celldeath:criticalcontrolpoints.cell116,205‑219(2004).[0243]5.johnson,t.o.,ermolieff,j.&jirousek,m.r.proteintyrosinephosphatase1binhibitorsfordiabetes.nat.rev.drugdiscov.1,696‑709(2002).[0244]6.koren,s.&fantus,i.g.inhibitionoftheproteintyrosinephosphataseptp1b:potentialtherapyforobesity,insulinresistanceandtype‑2diabetesmellitus.bestpract.res.clin.endocrinol.metab.21,621‑640(2007).[0245]7.pike,k.a,hutchins,a.p.,vinette,v.,theberge,j.‑f.,sabbagh,l.,tremblay,m.l.&miranda‑saavedra,d.proteintyrosinephosphatase1bisaregulatoroftheinterleukin‑10‑inducedtranscriptionalprograminmacrophages.sci.signal.7,ra43(2014).[0246]8.rhee,i.&veillette,a.proteinty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s以鉴定那些变体，(iii)制备型hplc和快速色谱以分离它们，和(iii)等温滴定量热法以确定其结合的自由能、焓和熵。在一些实施方式中，考虑了一组结构变化的抑制剂，其具有(i)相差100倍的亲和力和/或(ii)提示了可选的结合几何的结合的焓和熵。[0330]为了检查酶‑类萜相互作用中亲和力和活性的分子基础和热力学起源。[0331]假设。结合、功能化和/或合成类萜的酶具有大的非极性结合口袋。我们假设(i)酶对类萜的亲和力和(i)类萜上酶的活性二者由其结合口袋的一般形状和水合结构决定，而不是由特定蛋白‑类萜接触的位置决定。[0332]在一些实施方式中，考虑了一套精密的生物物理工具(等温滴定热量法、x‑射线晶体学、分子动力学(md)模拟和nmr光谱学)用于(i)确定蛋白质‑配体接触、水的重排和构象限制如何有助于类萜抑制剂之间的亲和力的差异，和(ii)开发一组经验关系，其预测萜合酶和萜‑功能化酶的突变如何影响其产物的一般属性(例如，形状)。[0333]为了进化ptp1b的高亲和力类萜抑制剂。[0334]假设。来自次级代谢(例如，萜合酶/细胞色素p450和卤化酶)的突变体是高度混杂的；其活性位点中或附近的单个突变可极大地改变其产物特性。根据其合成和/或功能化二萜的能力选择的少量(即，2‑4种)这种酶的诱变，将能够开发具有亚微摩尔亲和力的ptp1b抑制剂。[0335]在一些实施方式中，通过将(i)用于检测抑制剂的高通量方法与(ii)位点‑饱和度和随机诱变配对考虑了ptp1b的高亲和力抑制剂。对于(i)，我们将开发四种可选的荧光或生长偶联测定，以筛选突变途径(和其各自产物)的文库。对于(ii)，我们使用生物结构分析和序列比对，以鉴定可能的残基，从而产生具有有利产物特性的酶。[0336]为了鉴定使任意蛋白质靶标的类萜抑制剂能够进化的结构‑活性关系。[0337]假设。与类似类别的分子相互作用的蛋白质(通过结合或催化)具有结构上相似的结合口袋。评估这些结构相似性—和其对酶活性的影响—的方法可使得鉴定能够合成任何指定的蛋白质抑制剂的酶。[0338]在一些实施方式中，考虑了使用蛋白质的晶体结构作为起始点来鉴定能够合成该蛋白质的抑制剂的酶的生物物理框架。我们将检查(和形式化)(i)用于合成ptp1b的变构抑制剂的酶的活性位点和(ii)ptp1b的变构结合口袋之间的结构关系，并且我们将通过使用它们以鉴定—和然后测试—能够合成ptp1b和(单独的)十一碳二烯基二磷酸合酶(用于治疗抗生素抗性的细菌感染的靶标)的抑制剂的新酶验证这些关系。[0339]糖尿病、肥胖和癌症。[0340]蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)有助于2型糖尿病中的胰岛素抗性7，肥胖中的瘦蛋白抗性8以及乳腺癌、结直肠癌和肺癌中的肿瘤生长9,11。迄今为止，ptp1b的选择性紧密‑结合抑制剂的开发(即，治疗糖尿病、肥胖和癌症)已经由其活性位点的结构阻碍，其中极性残基限制紧密结合至带电的膜不可渗透分子，并且其中类似于其他蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)的活性位点的结构导致脱靶相互作用12,14。在该提议中，我们将构建与其c末端变构位点(在磷酸酶中不保守的大部分非极性区域)结合的ptp1b选择性抑制剂。先前对大分子文库的筛选已经鉴定了几个结合至该位点的配体，但还未生产临床上批准的药物16,13。鉴定新的分子替代物—该建议解决的难题—仍然是开发选择性ptp1b抑制疗法的努力目标。[0341]药物的开发。酶抑制剂—或先导物—的开发代表了药物开发的昂贵部分；为了每个成功的药物，先导物鉴定和优化花费平均3年和$250m来完成(将药物推向市场的总时间和花费的‑20‑30％)17。通过缩小先导物发现中的分子搜索空间，通过能够快速构建结构上变化的先导物(通常称为“备用物(backup)”18)以及通过促进分子合成的规模化，该提议中开发的技术可加速药物开发的速度并降低药物开发成本。[0342]分子识别。疏水作用—水溶液中非极性物质的自由能量上有利的缔合—平均占蛋白质‑配体缔合的自由能的‑75％19。不幸地，配体和蛋白质之间的疏水相互作用—在刚性(rigidity)、形貌、化学官能度和水合结构中极大不同—仍然难以预测20。该研究使用详细的生物物理分析和显式水计算来检查类萜和蛋白质结合口袋之间疏水相互作用的热力学基础。它将开发模型系统—和相应的概念框架—用于研究在结构上变化的蛋白质‑配体复合物情况下的疏水作用，在生物合成途径的设计中考虑该作用，并且在新的药物先导物的构建中使其得到利用。[0343]新的天然产物的生物合成。[0344]合成生物学为发现和产生天然产物提供了有希望的途径。当将一种生物体的代谢机制安装到基因控制的产生宿主(例如，酿酒酵母或大肠杆菌)中时，其能够以高效价(相对于天然宿主)合成复杂的化合物。这种方法已经能够从不可培养或低产的生物体中有效生产药学上相关的代谢产物21,22，但是，不幸地，在途径发现和优化上需要大量的时间和资源投资；结果，其用途通常限于新发现的基因簇的低通量表征或限于已知的药学上相关的分子(例如紫杉醇、青蒿素或阿片样物质)的生产22"24。[0345]在一些实施方式中，考虑了使用合成生物学构建新的分子功能的策略。其从病理学上相关的蛋白质靶标开始，并且工程化途径酶以产生选择性抑制该靶标的分子。这种方法将生产可在微生物宿主中产生的分子，而无需大量途径优化(其依赖于默认下可表达的酶)；因此，其将使合成生物学的用途扩展到先导物和备用物的产生中。其不能替代合成复杂天然产物的常规方法，而是构建增强开发药物制剂的效率的新的化合物的互补策略。[0346]在突变的代谢途径(例如，基于植物的类萜产生途径的版本，其中萜合酶已经突变)存在的情况下，我们的操纵子将能够筛选大量代谢产物其抑制我们感兴趣的蛋白质的能力。这样的平台可以用于进化具有特定生物学活性的代谢产物。[0347]检测和/或进化高选择性分子。我们已经开发了我们的操纵子版本的想法，以检测相对于高度相似的蛋白质抑制一种蛋白质的分子。目前，对分子选择性的筛选仍然非常困难。[0348]相对于用于检测小分子抑制剂的一些其他系统的，本文描述的方法和系统的优势包括但不限于能够检测调节或改变酶的催化活性的分子。而且，本文描述的系统的一些实施方式允许检测通过结合在其表面上的任何地方而改变酶活性的测试分子。作为一个示例，考虑了通过结合至其c‑末端变构位点而使ptp1b失活的抑制剂的检测。该结合事件——其扭曲了wpd环的催化必须运动——并不一定阻止酶‑底物缔合。相反，通过引用以其整体并入本文的美国专利号us6428951能够通过竞争底物结合位点(即，活性位点)来检测防止酶‑底物结合的分子。作为另一示例，作为一个实施方式考虑了检测活化感兴趣的酶的分子。相反，通过通过引用以其整体并入本文的美国专利号us6428951具有仅检测防止酶与其底物结合或以其他方式改变酶对其底物的亲和力的分子的方法。作为另一示例，作为实施方式考虑了检测不需要酶和底物以任何特定亲和力、取向或半衰期相互作用的分子。相反，通过引用以其整体并入本文的美国专利号us6428951需要酶和底物用能够组装断裂报道分子(splitreporter)的亲和力和取向彼此结合。结果，可需要对酶进行修饰。相反，发明人使用ptp1b的“底物捕获”突变体来改善其对底物结构域的亲和力。[0349]作为另一示例，一些实施方式能够检测野生型酶的抑制剂。相反，通过引用以其整体并入本文的tus.的专利号us6428951需要酶被融合至断裂报道分子的一半。[0350]此外，以下两个出版物是用于检测只是破坏酶与底物结合的分子的方法的示例。除其他外，该特性与通过引用以其整体并入本文的美国专利号us6428951，"proteinfragmentcomplementationassaysforthedetectionofbiologicalordruginteractions."公布日期:2008年1月31日，相反，该专利描述了基于高通量细菌的蛋白质‑片段互补测定(pca)，其中当源自酶二氢叶酸还原酶(dhfr)的两个蛋白质片段作为融合分子在大肠杆菌中共表达时，观察到在抑制剂不存在的情况下的相互作用，然后浓度依赖性菌落生长。该参考文献指出，pca可以适用于检测蛋白质小分子的相互作用，并且提供示例，其包括互补片段融合和诱饵融合片段。事实上，提供了蛋白酪氨酸磷酸酶ptp1b用于检测酶底物相互作用的示例和用于使用氨基糖苷类激酶(ak)检测蛋白质底物相互作用的存活测定的示例，用于基于显性选择大肠杆菌的pca的抗生素抗性标记物的示例。此外，pca被描述为应用于鉴定酶的小分子抑制剂；来自潜在治疗价值的化合物文库的天然产物或小分子；可用作文库筛选的存活测定；用于检测内源性dhfr抑制剂，例如雷帕霉素；和用于蛋白质‑药物相互作用。在例如，源自mel操纵子的具有调解区序列(intercedingregionsequence)的单独的诱导型或组成型启动子的控制下，pca互补片段和融合的cdna文库/靶基因的表达可在单个质粒上组装成单个操纵子，或具有多顺反子表达。pca可以适用于检测蛋白质与小分子的相互作用。在该概念中，两个蛋白质融合至pca互补片段，但是两个蛋白质彼此不相互作用。相互作用必须由第三实体触发，该实体可以是将同时结合至两种蛋白质或通过引起一个或两个配偶体的构象变化诱导两种蛋白质相互作用的任何分子。而且，pca策略在细菌中示例性应用于蛋白质工程/进化以生成具有新颖的结合特性的肽或蛋白质，所述结合特性使用噬菌体展示技术可具有治疗价值。进化的一个示例产生了新颖的拉链序列。描述了产生内源毒素的进化的其他示例。[0351]通过引用以其整体并入本文的wo2004048549，dep‑1receptorproteintyrosinephosphataseinteractingproteinsandrelatedmethods.公布于2004年6月10日，描述了改变ptp和是ptp的底物的酪氨酸磷酸化的蛋白质之间的相互作用的抑制剂的筛选测定，例如通过dep‑1底物的密度增强磷酸酶‑1(dep‑1)的去磷酸化。在适当的启动子，例如大肠杆菌阿拉伯糖操纵子(pbad或para)的控制下，dep‑1多肽可在细菌细胞(包括大肠杆菌)中表达。该参考文献类似地限制于通过引用以其整体并入本文的美国专利号us6428951的重点中；其能够检测破坏底物与酶的结合的分子，而不是检测调节(即，增强或减弱)酶活性的分子。[0352]相对于用于检测小分子抑制剂的一些其他系统，本文描述的方法和系统的优势包括但不限于使改变酶催化活性的代谢产物能够进化。通过引用以其整体并入本文的badran等，"continuousevolutionofbacillusthuringiensistoxinsovercomesinsectresistance".nature,vol533:58,2016中描述的技术；和通常连续进化的平台已经用于进化对其他蛋白质/肽底物具有不同亲和力的蛋白质。然而，其还没有用于进化产生改变酶活性或蛋白质‑蛋白质相互作用强度的小分子(即，代谢产物)的酶。[0353]相对于用于检测小分子抑制剂的一些其他系统，本文描述的方法和系统的另一优势包括发现具有靶向生物活性但未知结构的代谢产物(例如，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1b的能力)。有许多与在大肠杆菌或酿酒酵母中产生类萜有关的发明(例如，moses等，"bioengineeringofplant(tri)terpenoids:frommetabolicengineeringofplantstosyntheticbiologyinvivoandinvitro."newphytologist，第200卷，第1期)，其中该参考文献描述了青蒿酸的合成，青蒿酸是作为在大肠杆菌中表达的二萜的抗疟疾药物青蒿素的前体。此外，连同增强大肠杆菌中类萜的产生的讨论，描述了酶工程化或定向进化类萜生物合成酶，例如工程酶以接受非天然底物并且以与天然酶相当的效率的催化区域和立体特异性反应；在许多情况下，负责制造这些类萜的代谢途径被突变以改善生产水平。然而，生物传感器(即报告各种代谢产物浓度的构建体)的使用已集中在特定中间体(例如，法尼基焦磷酸，类萜的前体)的检测上，而不是用于组合(i)代谢途径的诱变和(ii)用于发现新的生物活性分子(可具有未知结构)的特定生物活性(例如，抑制ptp1b的能力)的生物传感器。[0354]高通量代谢工程化。[0355]用高通量筛选最有效地优化微生物途径。不幸地，目前，这种筛选非常少，并且可用的那些筛选依赖于信号(例如，吸光度或荧光、与产物‑特异性转录因子的缔合或基本代谢产物允许的生长)，其难以扩展至广泛类的分子(例如，没有明显的光学或代谢特性的那些)27。提出的工作开发了用于具有靶向活性—抑制ptp1b的能力—而不是靶向结构的类萜的高通量筛选。这些专注活性的筛选可广泛地用于构建(即进化)新的生物活性小分子。[0356]鉴定新的抑制剂：起始点。我们最近发现，树脂酸的主要成分的松香酸是ptp1b的变构抑制剂(图22)。我们将使用该分子的直接前体松香二烯作为抑制剂设计的起始点。松香二烯具有几个使其与我们的方法特别相容的属性：(i)可在大肠杆菌中以允许纯化、nmr分析和量热研究的效价(200mg/l)合成28，(ii)其相关萜合酶‑松香二烯合酶‑的突变体生产了一系列立体化学、形状和大小不同(并且仍然能够分析和纯化)的碳氢化合物支架29‑31，(iii)其—和相似的分子—可通过细胞色素p450和卤化酶官能化32‑34。[0357]代谢工程化。我们已经工程化大肠杆菌的菌株来以足以允许分析方法(即，gc/ms、itc和nmr)的效价(>150mg/l)产生松香二烯。我们的生物合成途径具有两个必备的操纵子：将(rj‑甲羟戊酸盐转变至法尼基焦磷酸盐(fpp)的mbis和将法尼基焦磷酸盐转变至松香二烯的ts。当甲羟戊酸盐不包括在媒介中时，一个任选的操纵子—mevt，其将乙酰辅酶a转变至(rj‑甲羟戊酸盐—是必要的35。质粒pmevt和pmbis由keaslinglaboratory开发36。含有来自北美冷杉的松香二烯合酶(abs)的质粒pts如在morrone28中开发为具有来自ajikumar的香叶基香叶基二磷酸合酶的基因37。[0358]改善的抑制剂。我们通过比较四种结构相关(和商业上可得)的分子：松香酸、新松香酸、左旋海松酸和二氢松香酸，评估了松香二烯衍生物的较小结构扰动以生产改善的抑制剂的能力(图16)。令人吃惊地，二氢松香酸的抑制力是松香酸的十倍(k，～25um与250um)。我们在该小的筛选中发现改善的抑制剂的能力表明，在该研究中探索的结构变化的种类—和生成的分子文库的大小—很可能会产生改善的抑制剂。[0359]松香二烯的功能化。我们通过将五个容易获得的突变体(g3、ksa‑4、9‑1oa、139‑3和j，其对紫穗槐二烯38和类固醇39的活性进行工程化)安装到我们的异源途径，评估细胞色素p450bm3突变体对松香二烯样分子的功能化的能力。三种突变体产生羟基化的和/或羧化的产物，产生多至0.3mg/l的松香酸(图17)。最初为其他靶标工程化的突变体的松香二烯‑功能化活性表明，我们将能够开发对松香二烯‑样分子具有更高活性的p450bm3的突变体。[0360]生物结构分析。我们已经在我们的实验室中结晶了ptp1b，与lawrenceberkeleynationallab(lbnl)的peterzwart合作收集了x射线衍射数据，并且解决了其晶体结构(图17a插图)。我们还以松香酸共结晶了ptp1b。我们将在7月下旬(第一可用的光束时间)分析这些晶体。[0361]最近，与harvardmedicalschool的haribabuarthanari合作，我们表达了n15标记的ptp1b，并且将其用于收集了二维1h‑15nhsqc光谱(图17a主图)。光谱包括(分别)结合至松香酸和已知的抑制剂的ptp1b；目前，我们正在处理数据。初步结果(x射线和nmr)表明结合至不同抑制剂的ptp1b的生物结构研究将很简单。[0362]高通量筛选。结合至抑制剂(竞争和变构的)时，ptp1b展示出猝灭其色氨酸荧光的构象变化(我们的四个高通量筛选之一的基础)。图17b指示，这种猝灭可用于来自产生松香二烯的大肠杆菌的菌株的抑制提取物(即，己烷覆盖物)和来自对照菌株的非抑制提取物(即，具有催化非活化abs的那种)之间的区分。图17c指示这种变化也可用于检测50um(15mg/l)的松香酸。我们检测(i)培养提取物中的松香二烯和(ii)低浓度的松香酸(即，比我们的松香二烯的效价低十倍)的能力表明我们将能够检测ptp1b的改善的抑制剂，即使他们伴随着效价的降低。[0363]提供对变构结合口袋具有不同亲和力的结构上变化的类萜。本部分描述了开发一组具有由结构的系统差异引起的亲和力的增量差异的抑制剂。目标(成功度量)：最少‑15的结构变化的抑制剂具有(i)对ptp1b的亲和力相差100倍和/或(ii)显示可替选的结合几何的结合的焓和熵。[0364]研究计划。在以下部分中，我们使用酶来构建ptp1b的选择性类萜抑制剂。该酶是我们工作的最初重点，因为它是糖尿病、肥胖和癌症的治疗靶标，并且可易于表达、结晶和测定15。因此，其用作药学上相关的模型系统，用其开发用于酶促构建药物先导物的通用方式。[0365]结构改变的假设。在本部分中，我们使用混杂酶来构建在立体化学、形状、大小和化学官能度不同的类萜。我们相信，这些修饰将通过改变以下来影响配体对ptp1b的亲和力：(i)它们参与变构结合口袋中具有非极性残基(例如，f280、l192和f196)的范德华相互作用的能力，(ii)它们参与具有近端极性残基(例如，n193、e200和e276)的直接或水介导的氢键的能力，(iii)它们参与具有任一组残基的卤素键的能力，(iv)它们对分子构象限制的影响；和(v)它们在结合期间重组水的能力。该假设(其部分由图16支持)推动了本文描述的合成策略。[0366]立体化学、形状和大小。我们将通过使用abs的突变体以生成立体化学和形状不同的二萜开始(图18a)。abs使用两个活性位点以将ii型(质子化‑依赖性)和i型(电离‑依赖性)环化的香叶基香叶基焦磷酸盐(ggpp，c2o)顺序催化为松香二烯29。先前的研究指示，其活性位点的氨基酸取代可改变其产物的立体化学或形状29,31。我们将使用影响去质子化、分子内蛋白质转移或碳阳离子稳定性的位置的突变(新鉴定的和先前鉴定的)(图8b)。将这些突变体安装到大肠杆菌后，我们将使用gc/ms来搜索新的产物(比如metfrag40或acd/msfragmenter41的片段化工具将有助于鉴定新的化合物)。[0367]我们将通过使用增加/减少abs活性位点体积的突变生成大小不同的类萜。先前改变萜合酶的底物特异性的尝试42,43表明，这种突变能够增强对法尼基焦磷酸盐(fpp，ci5)和法尼基香叶基焦磷酸盐(fgpp，c2s)的活性。为了合成fgpp，我们将并入先前在大肠杆菌中表达的fgpp合酶44。[0368]我们将通过使用快速色谱和hplc中分离出效价特别高的新的类萜的一个子集(在几个研究中已确定可行性的任务28,31,45)，并且我们将使用itc来测量结合至ptp1b的自由能(ag°结合)、焓(ah°结合)和熵(‑tas°结合)。配体之间的ag°结合差异将揭示结构变化如何影响结合强度。ah°结合和‑tas°结合的差异将揭示它们对结合几何的影响46,47。[0369]羟基化和卤化。对于6.1.2中选择的三种配体，我们将使用来自巨大芽孢杆菌的细胞色素p450bm3(p450bm3)和/或来自北美云杉的cyp720b4(p45072o)的突变体来构建在不用位置具有羟基或羧基基团的五种变体(图19a和19b)。p450bm3可羟基化各种不同的底物，其包括类萜48。p45072o可羧基化超过20种二萜，其包括松香二烯49。两种酶都可在大肠杆菌中表达,4a。[0370]我们将处理几组突变：对于p450bm3，我们将使用(i)允许倍半萜和二萜的立体选择性羟基化的三种(v78a、f87a和a328l)50，(ii)能够使生物碱和类固醇羟基化的五种(l75a、m177a、l181a和l437a)51，和(iii)允许杂芳族化合物羧化的两种(f87v和a82f)(图18d)52。对于p45072o，我们将检查可能改变氧化位置的‑10相似突变。我们将再次筛选大肠杆菌中的每个突变体，分离出感兴趣的产物，并且使用itc对它们分析。[0371]对于两种高亲和力的氧化的配体的每一种，我们将在不同位置以溴化物或碘化物构建六种变体(图18c)。这两种卤素可参与与蛋白质中的氧、氮或硫接纳体的卤素键合53，并且可在它们的表面上结合小的非极性倾斜面(declivities)54。与两种相互作用相关的能量贡献往往从br增加至i54,55，因此适合于系统分析(即，物理有机方法)。为了生成卤化的配体，我们将使用来自毒三素链霉素的色氨酸6‑卤化酶(stth)和来自acaryochlorismarina的钒卤素过氧化物酶(vhpo)的突变体。这些酶可将卤素(氯化物、溴化物或碘化物)引入生物碱或类萜的sp2‑杂化碳中(环化之前或之后)56,57。对于每种酶，我们将检查几种已知改变区域选择性的突变(例如，对于stth的l460f、p461e和p452t56)和5‑10种可能改变结合的图19示例：(图19a)羧化的、(b)羟基化的、配体(图19e)的方向的突变。我们将再次筛选(图19c)和卤代二萜。(图19d‑e)在大肠杆菌中每种突变体的残基，并且使用itc靶向(图19d)p450bm3和(图19e)stth中的诱变。[0372]iv.进化ptp1b的高亲和力类萜抑制剂。[0373]本部分开发了四个用于快速评估ptp1b抑制剂强度的高通量筛选，并且其连同位点‑饱和度和随机诱变使用那些方法来进化新的抑制剂。目标：一组具有特别高亲和力(kd^1um)和/或不可预测的结构(即，与合理设计不一致的结构)的进化的抑制剂。[0374]生物选择。选择方法(即，生长偶联筛选)，其中大肠杆菌的存活与抑制剂效力相联系将能够快速筛选非常大的分子文库(1010)66。在本部分中，我们开发这种方法。[0375]ptp1b催化几种细胞表面受体的去磷酸化—和失活。我们将使用这些受体的含酪氨酸的区域来构建操纵子，其将ptp1b的抑制与细胞生长相关。该操纵子将需要六个组分(图21a)：(i)拴在dna结合蛋白的底物结构域(受体的含酪氨酸的区域)，(ii)拴在rna聚合酶的共亚单元的底物识别结构域(在其磷酸化后结合含酪氨酸的区域的蛋白质)，(iii)酪氨酸激酶，(iv)ptp1b，(v)抗生素抗性基因，和(vi)该基因的操纵基因。使用该系统，ptp1b抑制剂将使底物和底物识别结构域能够结合，将rna聚合酶募集至dna上，并且转录抗生素抗性的基因。先前的小组已经使用相似的操纵子来进化蛋白质‑蛋白质结合伙伴。这里，我们采取了下述另外步骤：(i)使用由酶(ptp1b和激酶)介导的蛋白质‑蛋白质相互作用，和(ii)在那些酶之一的潜在抑制剂存在的情况下筛选该相互作用。[0376]我们将从基于发光的系统开始开发我们的操纵子，并且作为最后的步骤我们将添加抗生素抗性基因。在我们使用liu等67优化的系统进行的初步工作中，我们获得了表达两个结合伙伴的菌株和表达一个结合伙伴的菌株之间基于lux的发光的十倍差异(图21e；阿拉伯糖诱导第二个伙伴表达)。现在，我们计划引入—和测试—不同的底物结构域、识别结构域和激酶(egfr和src)。[0377]用于ptp1b活性的fret传感器。ptp1b的抑制与细胞荧光相关的高通量筛选将能够经荧光‑活化细胞分选(facs)进行快速筛选。该技术倾向与选择相比产生更多的假阳性，并且将文库限制于107‑108的大小，但是它需要的异源基因更少27,66。[0378]对于该策略，我们将使用通常用于监测哺乳动物细胞中激酶和磷酸酶活性的fret(福斯特共振能量转移)传感器68,69。这些传感器由激酶底物结构域、短的柔性连接体和磷酸化识别结构域——都夹在两个荧光蛋白之间——组成。底物结构域的磷酸化导致其结合至识别结构域，从而在两个荧光蛋白质之间诱导fret。在ptp1b相容的传感器中，ptp1b抑制剂将增加fret(图21b)。我们已经开始通过尝试底物结构域、识别结构域和激酶的不同组合来开发这种传感器。(注意：facs能够进行基于fret的筛选70,71)。[0379]用于ptp1b构象的改变的fret传感器。其中由结合‑诱导的ptp1b构象改变导致的细胞荧光改变的基于facs的筛选将比策略2和3(其可用于任何激酶或磷酸酶)通用性更低，但是仅需要一个异源基因。[0380]对于该策略，我们将使用由tonksgroup进行的fret实验13。这些研究人员试图显示trodusquemine与ptp1b的结合导致蛋白质变得更致密。为此，他们将fret对的构件附着至ptp1b的每个末端(图21c)。在蛋白‑配体缔合后，fret信号的增加指示其末端彼此接近。我们假设该构建体可用作鉴定结合至ptp1b的变构位点的其他分子的传感器。我们将开始用各种已知的抑制剂测试其(tonksgroup未采取的步骤)。[0381]ptp1b的色氨酸荧光的结合‑诱导的改变。其中将ptp1b的抑制与色氨酸荧光的改变相关的筛选(图21d)将在微量滴定板中能够快速筛选中等大小的文库(103‑104)27。在5.6中描述了我们使用色氨酸荧光的结合‑诱导的改变。在未来的工作中，我们计划将该方式扩展至其他蛋白酪氨酸磷酸酶，其中许多是变构的且具有许多色氨酸(例如，shp‑2，努南综合征的靶标72)。[0382]诱变。为了使用我们的高通量筛选来进化ptp1b抑制剂，我们将通过使用下述构建突变的类萜途径的文库：(i)位点‑饱和诱变(ssm；我们将靶向位点的二元组合)和(ii)易错pcr(ep‑pcr)。[0383]对于ssm，我们将通过开发类似于方程式1的函数来鉴定可能容纳有用突变的“可塑(plastic)”残基。该函数基于残基容纳影响活性位点的体积和水合结构的突变的能力对残基评分；s是残基允许突变的倾向性的度量，cr2是其他酶活性位点中类似位置的残基的体积差异，[0384]s＝4+rtw(eq1}[0385]a^w是那些残基的亲水性差异，和nv和nhw是标准化因子。在我们的abs初步分析中，我们成功地使用方程式1(和来自紫杉烯、y‑蛇麻烯、5‑selenine和epi‑isozizaene合酶的结构/序列信息)来鉴定已知的产生新的产物的突变(例如，abs的h348)的残基31。我们注意：先前鉴定可塑残基的尝试已经扫描了结合底物附近的每个位点73；我们的方式以其包括来自以下生物物理考虑因素将是独特的：(i)我们对最佳配体属性的研究(6.2.1)和(ii)我们对带来它们的突变类型的研究(6.2.2)。[0386]对于文库构建，我们将探索突变我们的途径(i)逐个酶(例如，abs，然后p450bm3，并且然后vtth)或(ii)随机的。第二种方法可让我们获得难以用先导物设计的常规方法找到的结构。[0387]为了鉴定使任意蛋白质靶标的类萜抑制剂能够进化的结构‑活性关系。本部分开发了用于使用蛋白质的晶体结构来鉴定能够制造该蛋白质的抑制剂的酶的生物物理框架。目标：使用该框架来鉴定—然后测试—能够合成ptp1b和(单独)十一碳二烯基二磷酸合酶(upps)(一种抗生素抗性细菌感染的靶标)新抑制剂的酶。[0388]结合口袋之间的关系。我们将通过确定结合口袋的特定特性(例如，体积、极性和形状)的相似性如何使酶合成、功能化和/或结合相似分子开始。该努力将涉及比较ptp1b的变构结合口袋与抑制剂合成中涉及的酶的结合口袋(即，活性位点)。对于这些比较，我们将构建两个基质：基质a，其中每个元素(ay)表示结合口袋i和j((0<aij<1，其中1是高度相似))之间特定特性的相似性，和基质b，其中每个元素(by)描述了结合口袋i和j结合相似分子的能力(0<by<1，其中1表示相同的结合特异性)。这两个基质(ab)的产物形成的基质的等级将显示确定代谢途径中酶的功能相容性所必需的独立变量(即，活性位点属性)的数量；特征值将显示所研究的属性的相对重要性(由基质a描述)。[0389]我们将用基于pymol和md的蛋白质晶体结构分析来构建基质a。我们将通过检查功能化类萜及其前体结合至类萜合成中涉及的每种酶来构建基质b。这些配体/蛋白质组合中的一些的结合亲和力将用itc测量；大部分将用对接计算(oedocking78)评估。[0390]本部分的结果将是类似于方程式2的方程，其中j是活性位点合成结合特定结合口袋的类萜的能力的度量[0391]j＝wvv+wpp+wil+www(方程式2)；v、p、l和w表示该活性位点的特定特性(体积、极性、最长直径和最短直径)；w代表加权因子。变量的最终数量—和其各自的权重—将通过上述分析确定。在参数化方程式时，我们计划检查结合口袋(例如形状)的特性的不同度量和探索/开发不同的基质处理方法。[0392]校验和扩展。[0393]用于抑制剂合成的有希望的活性位点基序的鉴定将需要搜索可用的蛋白质结构数据。我们将通过使用probis(probis.nih.gov79)(使用指定结合位点在蛋白质数据库中的其他蛋白质上找到相似的结合位点的基于比对的平台)进行这种搜索。即使当包围那些口袋的蛋白质折叠不同，probis仍可鉴定形状相似的结合口袋(即，其检测到相似型的氨基酸)。[0394]首先，我们将使用基于probis的搜索来鉴定具有与下述具有一定水平的结构相似性的活性位点的酶(我们将探索不同的阈值)：(i)ptp1b的变构结合位点或(ii)能够合成ptp1b抑制剂的酶的活性位点。使用方程式2，我们将选择具有最有利的活性位点的酶，并且用我们的抑制剂开发平台将其测试)。[0395]我们将通过尝试构建upps(已知结合类萜和多环分子的蛋白质)的抑制剂，来评估我们方法的通用性80。基于结构的搜索将使用两个起始点：(i)upps和(ii)abs的突变体，p450bm3或我们生物物理分析显示可生产upps抑制剂的类似酶。我们将再次选择酶的一个子集来使用我们的平台测试。[0396]用于iii‑iv节的参考文献：[0397]1.koh,h.‑l,yau,w.‑p.,ong,p.‑s.&hegde,a.currenttrendsinmodernpharmaceuticalanalysisfordrugdiscovery.drugdiscov.today8,889‑897(2003).earlydrugdiscovery.br.j.pharmacol.162,1239‑1249(2011).[0414]18.kennedy,t.managingthedrugdiscovery/developmentinterface.drugdiscov.today2,436‑444(1997).[0415]19.snyder,p.w.,lockett,m.r.,moustakas,d.t.&whitesides,g.m.isittheshapeofthecavity,ortheshapeofthewaterinthecavity？eur.phys.j.spec.top.223,853‑891(2014).[0416]20.klebe,g.applyingthermodynamicprofilinginleadfindingandoptimization.nat.rev.drugdiscov.14,95‑110(2015).[0417]21.chang,m.c.y.&keasling,j.d.productionofisoprenoidpharmaceuticalsbyengineeredmicrobes.nat.chem.biol.2,674‑681(2006).[0418]22.george,k.w.,alonso‑gutierrez,j.,keasling,j.d.&lee,t.s.isoprenoiddrugs,biofuels,andchemicals‑artemisinin,farnesene,andbeyond.advbiochemengbiotechnol148,355‑389(2014).[0419]23.cragg,g.m.&newman,d.j.naturalproducts:acontinuingsourceofnoveldrugleads.biochim.biophys.acta‑gen.subj.1830,3670‑3695(2013).[0420]24.galanie,s.,thodey,k.,trenchard,i.j.,filsingerinterrante,m.&smolke,c.d.completebiosynthesisofopioidsinyeast.science(80‑.).349,1095‑1100(2015).[0421]25.govindarajan,s.,recabarren,r.&goldstein,r.a.estimatingthetotalnumberofproteinfolds.proteins35,408‑414(1999).[0422]26.atanasov,a.g.,waltenberger,b.,pferschy‑wenzig,e.m.,linder,t.,wawrosch,c,uhrin,p.,temml,v.,wang,l.,schwaiger,s.,heiss,e.h.,rollinger,j.m.,schuster,d.,breuss,j.m.,bochkov,v.,mihovilovic,m.d.,kopp,b.,bauer,r.,dirsch,v.m.&stuppner,h.discoveryandresupplyofpharmacologicallyactiveplant‑derivednaturalproducts:areview.biotechnol.adv.33,1582‑1614(2015).[0423]27.lauchli,r.,rabe,k.s.,kalbarczyk,k.z.,tata,a.,heel,t.,kitto,r.z.&arnold,f.h.high‑throughputscreeningforterpene‑synthase‑cyclizationactivityanddirectedevolutionofaterpenesynthase.angew.chemie‑int.ed.52,5571‑5574(2013).[0424]28.morrone,d.,lowry,l.,determan,m.k.,hershey,d.m.,xu,m.&peters,r.j.increasingditerpeneyieldwithamodularmetabolicengineeringsystemine.coli:comparisonofmevandmepisoprenoidprecursorpathwayengineering.appl.microbiol.biotechnol.85,1893‑1906(2010).[0425]29.peters,r.j.&croteau,r.b.abietadienesynthasecatalysis:mutationalanalysisofaprenyldiphosphateionization‑initiatedcyclizationandrearrangement.proc.natl.acad.sci.u.s.a.99,580‑584(2002).[0426]30.wilderman,p.r.&peters,r.j.asingleresidueswitchconve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转化为含b2h的细胞，并且我们在含有各种浓度大观霉素的平板上培养它们。在具有高浓度大观霉素的平板上形成的菌落含有能够生成活化b2h系统(即，抑制ptp1b)的分子的途径。该途径将不会天然地自行进化。因此，我们可将其从第一宿主细胞中去除，并且将其转化为另一大肠杆菌菌株以制造高浓度的抑制剂。[0509]本文描述的系统的实施方式能够快速鉴定可易于在微生物宿主中合成的药物先导物。它允许同时解决在药物开发期间遇到的两个问题，所述问题通常分别检查：1)先导物的鉴定和2)在1)中鉴定的先导物的随后合成。[0510]本文描述的系统具有至少五个用途：[0511]1.能够鉴定生成药物靶标的抑制剂的蛋白质的基因。简言之，当类萜生物合成的途径生成靶标‑抑制分子时，细胞在高抗生素浓度存活。通过交换萜合成和/或功能化酶的基因，我们可鉴定构建这种抑制剂的酶的基因。[0512]2.能够构建新型的—和可能非天然的—抑制剂。通过使类萜生物合成的途径突变，我们可生成在高抗生素浓度赋予存活的途径。这些途径含有突变的(即，非天然)基因，因此可生成在自然界中未发现的抑制剂分子。[0513]3.能够构建克服药物抗性的抑制剂。简言之，在构建生成靶标‑抑制分子的菌株后，我们可进行两个步骤：(i)我们可使药物靶标突变，直到其对该抑制剂变得抵抗。(ii)我们可使代谢途径突变，直到其生成突变的药物靶标的抑制剂。这样，我们可以(i)预测药物‑抗性突变且(ii)通过生成克服它们的新的抑制剂来解决那些突变。[0514]4.能够构建蛋白酪氨酸激酶的抑制剂。使用类似于3.ii中描述的选择策略，我们可使代谢途径突变，直到其生成src激酶的抑制剂。[0515]b.将蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制与细胞存活联系在一起的基因编码系统。[0516]在一个优选的实施方式中，如本文描述的，开发且使用基因编码系统来检测选择的酶，例如药物靶标酶的催化结构域的小分子抑制剂的存在，同时在选择性生长培养基存在的情况下允许宿主细胞的存活。换句话说，当基因编码系统是大肠杆菌中表达质粒的部opensoftwaresuite.trendsgenet.16,276–277(2000).[0528]c.抑制ptp1b的类萜的生物合成使细胞能够存活。[0529]当pts含有ads或ghs时，其不含有ggpps；当pts含有abs或txs，其也含有ggpps；absd404a/d621a指abs的催化失活变体；和b2h*含有ptp1b(c215s)。ads和，很少地abs能够在大观霉素存在的情况下存活，结果显示这些对萜合酶生成ptp1b抑制剂的能力。[0530]图36a‑c图4|显示了用于提供在使细胞能够存活图36c的抑制ptp1b的类萜的生物合成图36b期间的示例性结果的操纵子(图36a)的阐释。[0531]图36a‑c图4描绘了类萜的生物合成的示例性代谢途径。[0532]图36a描绘了用于类萜生物合成的质粒负载途径：(i)pmbis，其携带酿酒酵母的甲羟戊酸‑依赖性类异戊二烯途径，将甲羟戊酸盐转变为异戊基焦磷酸(ipp)和法尼基焦磷酸(fpp)。(ii)pts，其编码萜合酶(ts)，和必要时香叶基香叶基二磷酸合酶(gpps)，将ipp和fpp转变为倍半萜烯和/或二萜。[0533]图36b描绘了示例性萜合酶：来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶(ads)、来自北美冷杉的γ‑蛇麻烯合酶(ghs)、来自北美冷杉的松香二烯合酶(abs)和来自短叶红豆杉的紫杉烯合酶(txs)。[0534]图36c显示了含有(i)优化的细菌双杂交(b2h)系统的实施方式(即，来自图33e的b2h系统)和(ii)用于类萜生物合成的途径的实施方式(即，来自图35a的途径)二者的大肠杆菌菌株的示例性生长偶联测定的结果。[0535]简言之，我们生长了携带(i)用于生成直链类异戊二烯前体的相同途径和(ii)编码萜合酶的不同质粒(pts)的大肠杆菌的菌株。pts质粒含有下述之一：(i)来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶(ads)、(ii)来自北美冷杉的γ‑蛇麻烯合酶(ghs)、(iii)与香叶基香叶基二磷酸合酶(ggpps)可操作的组合的来自北美冷杉的松香二烯合酶(abs)、(iv)与ggpps可操作的组合的来自短叶红豆杉的紫杉烯合酶(txs)、(v)abs的失活变体(即，absxx，其对应于absd404a/d621a)或(vi)ghs的l450y突变体。在这些菌株生长后，我们比较它们的产物抑制ptp1b的能力，这通过进行下述步骤：(i)我们使用己烷覆盖物以提取来自每种培养基的疏水产物(例如，萜样产物)，然后我们在旋转蒸发器中干燥产物，我们在二甲基亚砜(dmso)中溶解干燥的提取物，和我们测量在含提取物的dmso存在和不存在的情况下对硝基苯基磷酸盐(pnpp)的ptp1b‑催化水解。我们注意到：ghs的l450y突变体被包括在我们的分析中，因为ghs的野生型形式在抗生素存在的情况下不允许b2h‑介导生长，但是我们的初步数据指示ghs的l450y突变体不允许这种生长。相应地，我们假设该突变体产生的分子是比野生型ghs生成的分子更强的ptp1b抑制剂。参见，图37a‑c通过结构上不同的类萜证明差别抑制。[0536]在检查图37a‑c中，我们观察到趋势：来自菌株的提取物含有赋予对高浓度抗生素抗性的萜合酶(见图36)，其中ads和ghsl450y比来自不赋予抗性的菌株的提取物例如txs和absxx更有抑制性。我们注意到：含有ads和ghs的菌株也包括优化的细菌双杂交(b2h)系统，但是选择在用于通过这些图描述的实验的产物类萜的实验中未进行。[0537]图37a‑c提供了通过大肠杆菌的不同菌株产生的类萜的抑制作用的示例性分析。[0538]图37a描绘了包含(i)无抑制剂和(ii)从含ads的菌株的培养发酵液的提取化合物的dmso的抑制作用的我们分析的结果。图37b描绘了含有(i)来自含ghs的菌株(ghum)的培养发酵液的提取化合物或(ii)来自包括ghs的l450y突变体的菌株的培养发酵液的提取化合物的dmso的抑制作用的我们分析的结果。图37c描绘了含有(i)无抑制剂、(ii)来自含abs的菌株的培养发酵液的提取化合物、(iii)来自含txs的菌株的培养发酵液的提取化合物和(iv)来自含abs的催化失活变体的培养菌株的培养发酵液的提取化合物的dmso的抑制作用的我们分析的结果。[0539]简言之，我们在不同浓度的大观霉素上生长含有(i)优化的细菌双杂交系统和(ii)具有突变体γ‑蛇麻烯合酶(ghs；1突变体/细胞)的类萜途径的大肠杆菌的菌株。上面：具有在高抗生素浓度赋予存活的ghs突变体的菌株的产物特征。参见，图38。[0540]图38显示能够在大观霉素存在的情况下生长的ghs突变体的产物特征的示例性分析。[0541]简言之，我们构建了细菌双杂交系统的版本，其包括sh2*、midt底物、优化的启动子和核糖体结合位点、specr和可替选的ptp：ptpn6(例如，shp‑1)和ptp1b405(ptp1b的全长版本)的催化结构域。注意：这些系统和图33e中描绘的b2h系统是相同的，除了它们仅拥有以下ptp基因之一：ptp1b(如图33e中)、ptpn6(不同于图33e)或全长ptp1b。ptpn6和全长ptp1b二者的催化结构域的失活使携带相应操纵子的大肠杆菌的菌株能够在高浓度大观霉素(>400μg/ml)存活。为了将我们的操纵子扩展至其他ptp，我们计划修饰底物、sh2和/或激酶结构域。参见，图39。[0542]图39将其他ptp的抑制与细胞存活联系在一起的示例性b2h系统的分析。[0543]我们也生成了包括sh2*、midt底物、优化的启动子和核糖体结合位点、specr和可替选的ptp：ptpn6(例如，shp‑1)和ptp1b405(ptp1b的全长版本)的催化结构域的细菌双杂交系统版本。ptpn6和全长ptp1b的催化结构域的失活使携带相应操纵子的大肠杆菌的菌株能够在高浓度的大观霉素(>400μg/ml)存活。为了将我们的操纵子扩展至其他ptp，我们计划修饰底物、sh2和/或激酶结构域。[0544]图40a‑e描绘了将酶活性与感兴趣的基因的表达联系的基因编码系统的示例性实施方式，并且那些实施方式应用于(i)抗性突变的预测、(ii)对抗抗性突变的抑制剂的构建和(ii)激酶抑制剂的进化。[0545]图40a描绘了检查潜在的抗性突变中的示例性第一步骤。通过进化代谢途径以产生抑制已知的药物靶标(例如，ptp1b)的分子；这些分子将允许在选择压力存在(例如，存在大观霉素，一种抗生素)的情况下赋予存活的感兴趣的基因(goi)的表达。图40b描绘了检查潜在的抗性突变中的示例性第二步骤。在大肠杆菌的第二菌株中，我们将用赋予有条件的毒性(例如，sacb，其将蔗糖转变为果聚糖，一种有毒的产物)的第二感兴趣的基因(goi2)替换最初感兴趣的基因；我们将进化药物靶标以变得对内源抑制剂是抗性的，而仍保留其活性。该突变体将防止有毒基因的表达。图40c描绘了对抗抗性突变中的示例性第三步骤。在大肠杆菌的第三菌株中，我们将进化产生抑制突变的药物靶标的分子的代谢途径。这样，我们预测—和通过我们的第二进化的途径，处理—可能导致对基于类萜的药物的抗性的突变。我们注意到，图40a‑40c描述了使用我们的基因编码系统来进化抑制剂，但是步骤2和3可用于预测允许对内源供应的抑制剂抗性的突变，并且随后鉴定可对抗该抗性的新的内源供应的抑制剂。图40d描绘了检测src激酶抑制剂的示例性基因编码系统。简言之，src活性使有毒基因(goi2)能够表达；接着，src的抑制赋予存活。[0546]b2h构架的构造的一个实施方式使当ptp1b是活性的时候，即，当src激酶的活性成功地被取消时，能够存活。在ptp1b不存在的情况下，该构造可用于进化src激酶抑制剂；这种抑制剂可通过防止底物结构域的磷酸化类似地用于ptp1b(如图40e中显示)。src激酶是验证的药物靶标；酪氨酸激酶是超过40种fda‑批准的药物的靶标。[0547]图40e表明了用于图40b中描述的b2h系统的最高原理(roofofprinciple)的一个实施方式。这里显示的系统包括两个goi：specr和sacb。goi的表达在大观霉素存在的情况下赋予存活；goi的表达在蔗糖存在的情况下导致毒性。图像描绘了在各种浓度的蔗糖存在的情况下在大肠杆菌的菌株上进行的生长偶联测定的结果。携带活性形式的ptp1b的菌株(wt)比携带非活化形式的ptp1b的菌株(c215s)在高蔗糖浓度下生长地更好。[0548]图41a描绘ptp1b抑制剂的进化的示例性策略。[0549]图41a描绘了用于鉴定萜合酶活性位点中的诱变的靶标的示例性结构分析。其显示了abs(灰色，pdb入口3s9v)和txs(蓝色，pdb入口3p5r)的i类活性位点与abs(红色)上突出的靶向于位点‑饱和诱变(ssm)的位点的位置的比对。txs的底物类似物(黄色)出现用于参考。图41b描绘了用于将多样性引入代谢途径的文库的示例性策略：萜合酶上关键位点的ssm(如在a中)、整个萜合酶基因的易错pcr(epcr)、萜功能化酶上位点的ssm(例如，p450)和整个萜功能化酶的epcr的反复组合。图41c描绘了存在于具有各种含ts的菌株的提取物的dmso样品中总类萜的示例性量化。简言之，我们在ads上的六个位点(类似于图41a中显示的位点)进行位点‑饱和诱变；我们将ssm文库铺在含有不同浓度大观霉素的琼脂平板上；我们挑选在含有高浓度(800μg/ml)大观霉素的板上生长的菌落并且使用每个菌落来接种单独的培养物；我们使用己烷覆盖物来提取分泌入每个培养物发酵液中的类萜；我们在旋转蒸发器中干燥己烷提取物并且在dmso中再悬浮固体；并且我们使用gc‑ms来量化存在于dmso中的类萜的总量。[0550]“adswt”、“adsf514e”、“adsf370l”、“adsg400a”、“adsg439a”和“adsg400l”描述了由携带紫穗槐二烯合酶(ads)的突变体的大肠杆菌的菌株生成的分子的混合物。标签描述了突变体：“g439a”对应于松香二烯合酶的突变体，其中甘氨酸439已经突变为丙氨酸，等。在未来的工作中，我们计划(i)纯化来自这些混合物的不同类萜、(ii)评估它们在体外对ptp1b的抑制作用、(iii)分析它们在体外对其他ptp(尤其tc‑ptp和ptpn11)的抑制作用和(iv)分析它们对哺乳动物细胞的影响。参见，图41d。[0551]图41d描绘了各种提取物对ptp1b的抑制效果的示例性分析。简言之，该图显示在图41c中量化的类萜存在的情况下，对硝基苯基磷酸盐(pnpp)的ptp1b‑催化水解的初始速率。ads的两个突变体(g439a和g400l)特别地生成有效的ptp1b抑制剂。[0552]图42描绘了b2h活化和细胞存活之间的联系的示例性分析。大肠杆菌的示例性菌株含有(i)优化的细菌双杂交(b2h)系统(图33e)和(ii)图36a中描绘的类萜途径二者。注意：仅当abs或txs存在时，pts包括ggpps；“y/f”操纵子对应于b2h系统，其中底物结构域不能被磷酸化。在高浓度的大观霉素下的存活需要b2h系统的活化(即，底物结构域的磷酸化，一种被ptp1b的抑制促进的过程)。[0553]图43提供了携带各种萜合酶的大肠杆菌的菌株的示例性产物特征。对于该图，大肠杆菌的菌株携带(i)优化的b2h系统(图33e)和(ii)类萜途径(图36a)。对应每个特征的途径仅在pts质粒的组成上不同，pts质粒含有txs(来自短叶红豆杉的紫杉烯合酶和来自加拿大紫杉的香叶基香叶基二磷酸合酶)；ghs(来自北美冷杉的γ‑蛇麻烯合酶)；ads(来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶)；abs(来自北美冷杉的松香二烯合酶和来自加拿大紫杉的香叶基香叶基二磷酸合酶)；g400a(来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶的g400a突变体)和g439l(来自黄花蒿的紫穗槐二烯合酶的g439l突变体)。注意，ads的两个突变体产生的产物特征与野生型酶(ads)的不同；我们的结果指示产物由这两个突变体生成的产物比由野生型酶生成的那些更是抑制性的(图41e)。[0554]d.鉴定用于位点饱和诱变(ssm)的位点。[0555]萜合酶和细胞色素p450的活性位点含有氨基酸的群集，其以两种方式指导催化：(i)它们控制反应底物可得的构象空间和(ii)它们改变底物周围水的组织8–10。我们鉴定可能调节萜合酶的i类活性位点中的这些属性的“可塑”残基，其通过进行以下步骤进行：(i)我们对齐abs的晶体结构与txs的晶体结构。(ii)我们选择txs的i类活性位点的底物类似物(2‑氟‑香叶基香叶基二磷酸盐)的8埃(angstom)内的所有残基，和我们鉴定了abs和txs之间不同的位点的子集。(iii)我们对齐abs的序列，[0556][0557]ghs，δ‑selenine合酶(dss)和epi‑isozizaene合酶(eis)。(iv)我们使用eq.s1来基于其分析的五种酶的大小和亲水性的可变性对每个位点评分。在该方程式中，是体积的变化、是hopp‑woods指数的变化以及nv和nhw是标准化因子(基于该研究中测量的最高变化)。(v)我们根据s排列每个位点并选择六个最高的评分位点。我们注意到：对于该分析，我们选择abs和txs，因为它们是结构上相似的具有晶体结构的酶(即，都具有α，β，和γ结构域)；我们选择ghs、dss和eis，因为它们已经显示，展示突变‑响应产物特征。[0558]图44a‑d提供了支持将b2h系统延伸至其他蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)的示例性基于结构和序列的证据。[0559]图44a提供了示例性结构比对ptp1b和ptpn6，两种与b2h系统相容的ptp(参见用于相容性证据的更新a的图1e和7)。我们使用pymol的对齐功能以将ptpn6的每种结构与ptp1b的催化结构域的(i)无配体(3a5j)或(ii)结合配体(2f71)的结构对齐。对齐功能进行序列比对，随后结构叠加，因此，有效地对齐两种蛋白质的催化结构域。图44b提供了ptp1b和ptpn6的示例性结构比较；ptp1b和ptpn6的对齐结构的均方跟偏差(rmsd)范围从0.75至图44c证明了ptp1b和ptpn6的催化结构域的示例性序列比对(embossneedle1)。图44d提供了ptp1b和tppn6的催化结构域的示例性序列比较。序列共享34.1％序列同一性和53.5％序列相似性。概括来说，该图的结果指示我们的b2h系统可易于延伸至拥有催化结构域的ptp，该催化结构域(i)结构上类似于ptp1b的催化结构域(这里，我们定义结构相似性为这样的两个结构，当对齐时，具有≤rmsd的rmsd，框架类似于通过pymol的对齐功能使用的一个)，和/或(ii)序列类似于ptp1b的催化结构域(这里，我们定义序列相似性为≥34％序列同一性或≥53.5％序列相似性，如由embossneedle算法定义的)。为了鉴定能够调整p450bm3的活性的“可塑”残基，我们进行类似于以上描述的方式：(i)我们使用突变体数据库11(http://www.muteindb.org)来鉴定p450bm3的功能变体中25个最常突变的位点。(ii)我们使用eq.s1基于其不同突变体中大小和疏水性的变化性对每个位点评分。(iii)我们根据s排名每个位点和选择7个最高的评分位点。位点s1024基于s评分高，但是由于其位于p450还原酶结构域上被省略。[0560]e.示例性纯化的产物。[0561]参见关于快速色谱和hplc的部分1–3。[0562]f.示例性测试产物的浓度范围。[0563]我们计划用1‑400μm的抑制剂孵育哺乳动物细胞；我们将通过使用以下描述的测定评估那些抑制剂的生物化学影响。[0564]g.示例性基于细胞的测定。[0565]我们将以至少两种方式表征新开发的抑制剂的生物活性：[0566]1.我们将测定抑制剂对胰岛素受体磷酸化的影响。简言之，我们在抑制剂存在和不存在的情况下将hepg2、hela、hek393t、mcf‑7和/或cho‑hir细胞暴露于胰岛素冲击(shock)，并且我们将使用蛋白质印迹和/酶联免疫吸附测定(elisa)来测量抑制剂对胰岛素受体磷酸化的影响。在一些实施方式中，我们可使用细胞‑可渗透的ptp1b抑制剂来增强胰岛素受体磷酸化。[0567]2.我们将检查本文描述的系统中鉴定的抑制剂对her2(+)和tn乳腺癌的细胞模型的形态学和/或生长作用。[0568]简言之，我们将通过评估它们对抑制为her2(+)的bt474和skbr3细胞，而不是为her2(‑)的mcf‑7和mda‑mb‑231细胞的迁移的能力，来检查抑制剂对her2(+)乳腺癌的相关性。接着，通过对tn细胞系(例如，atcctcp‑1002)的组(panel)进行活力和增殖测定，我们将检查抑制剂与三阴性乳腺癌的相关性。所有细胞系可获得自atcc(atcc.org)并且先前已经用于表征her2(+)和tn亚型的潜在疗法4,5。[0569]这不意味着限制类萜合成的途径。的确，考虑了生物碱生物合成途径用于鉴定，[0570]生物碱生物合成的示例性途径由以下三个模块组成(nakagawa，a等abacterialplatformforfermentativeproductionofplantalkaloids.nat.commun.(2011).doi:10.1038/ncomms1327，通过引用并入本文)(i)第一模块，能够过度表达使l‑酪氨酸过量生产的我们的酶：tkt、peps、fbr‑dahps和fbr‑cm/pdh；(ii)第二模块，能够表达对构建多巴胺和3,4‑dhpaa必要的三种酶：tyr、dodc和mao；和(iii)第三模块，能够表达构建来自3,4‑dhpaa和多巴胺的(s)网脉碱的四种酶：ncs、6omt、cnmt和4’omt。酶如下：tkt，转酮酶(tkta，genbank登录号x68025)；peps，磷酸烯醇丙酮酸(pep)合酶(ppsa，genbank登录号x59381)；fbr‑dahps，反馈‑抑制抗性3‑脱氧‑d‑阿拉伯‑庚二酸‑7‑磷酸合酶(arogfbr，genbank登录号j01591)；fbr‑cm/pdh，反馈‑抑制抗性分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(tyrafbr，genbank登录号m10431)；tyr，链霉菌链球菌(streptomycescastaneoglobisporus)的酪氨酸酶(含有酪氨酸酶的sctyr和其衔接蛋白质，orf378，genbank登录号ay254101和ay254102)；dodc，恶臭假单胞菌的dopa脱羧酶(genbank登录号ae015451)；mao，藤黄微球菌的单胺氧化酶(genbank登录号ab010716)；ncs，日本黄连的去甲乌药碱合酶(genbank登录号ab267399)；6omt，日本黄连的去甲乌药碱6‑o‑甲基转移酶(genbank登录号d29811)；cnmt，日本黄连的乌药碱‑n‑甲基转移酶(genbank登录号ab061863)；4′omt，日本黄连的3′‑羟基‑n‑甲基乌药碱4′‑o‑甲基转移酶(genbank登录号d29812)。我们注意到；这三种模块可由两种质粒编码。[0571]用于v部分的参考文献，本文通过引用以它们的整体并入：[0572]1.jia,m.,potter,k.c.&peters,r.j.extremepromiscuityofabacterialandaplantditerpenesynthaseenablescombinatorialbiosynthesis.metab.eng.37,24–34(2016).[0573]2.criswell,j.,potter,k.,shephard,f.,beale,m.h.&peters,r.j.asingleresiduechangeleadstoahydroxylatedproductfromtheclassiiditerpenecyclizationcatalyzedbyabietadienesynthase.org.lett.14,5828–5831(2012).[0574]3.morrone,d.etal.increasingditerpeneyieldwithamodularmetabolicengineeringsystemine.coli:comparisonofmevandmepisoprenoidprecursorpathwayengineering.appl.microbiol.biotechnol.85,1893–1906(2010).[0575]4.dagliyan,o.etal.engineeringextrinsicdisordertocontrolproteinactivityinlivingcells.science(80‑.).354,1441–1444(2016).[0576]5.lehmann,b.d.etal.identificationofhumantriple‑negativebreastcancersubtypesandpreclinicalmodelsforselectionoftargetedtherapies.j.clin.invest.(2011).doi:10.1172/jci45014[0577]6.dempke,w.c.m.,uciechowski,p.,fenchel,k.&chevassut,t.targetingshp‑1,2andshippathways:anovelstrategyforcancertreatment？oncology(switzerland)(2018).doi:10.1159/000490106[0578]7.nakagawa,a.etal.abacterialplatformforfermentativeproductionofplantalkaloids.nat.commun.(2011).doi:10.1038/ncomms1327[0579]8.christianson,d.w.structuralbiologyandchemistryoftheterpenoidcyclases.chem.rev.106,3412–3442(2006).[0580]9.fasan,r.tuningp450enzymesasoxidationcatalysts.acscatalysis2,647–666(2012).[0581]10.jung,s.t.,lauchli,r.&arnold,f.h.cytochromep450:tamingawildtypeenzyme.currentopinioninbiotechnology22,809–817(2011).[0582]11.braun,a.etal.muteindb:themuteindatabaselinkingsubstrates,productsandenzymaticreactionsdirectlywithgeneticvariantsofenzymes.database(2012).doi:10.1093/database/bas028.[0583]vi.进化光遗传致动器：光控开关构建体。[0584]a.用红光和红外光的光学控制。[0585]当代使用光来控制酶活性的努力依赖于至少两种光遗传致动器：lov2，其具有由蓝光(‑450nm)去稳定的末端螺旋2,18,48，和dronpa，其响应绿光(‑500nm)从二聚体转变至单体19。不幸地，蓝光和绿光遭受限制它们在信号传导研究中使用的光毒性、渗透深度和光谱相似性的问题21。因此，在一个实施方式中，考虑了由红光或红外光刺激的光控开关酶，用于开发。这些波长比蓝色和绿光具有更低的光毒性和更大的渗透深度20,21，并且将允许与蓝光或绿光一起多色致动。[0586]b.进化光控开关构建体的操纵子。[0587]在一个实施方式中，考虑了将ptp1b的活性与细胞生长联系在一起的操纵子。简言之，该操纵子基于以下对照策略(图10中的一些另外细节)：激酶刺激两种蛋白质的结合，接着，促进必要基因的转录；ptp1b抑制这两种蛋白质的结合，因此，抑制转录。该操纵子允许拥有ptp1b的光控开关变体的细胞在一种光源存在的情况下比在另一种光源存在的情况下(例如，750nm与650nm)生长更快。生长速率的差异能够鉴定功能嵌合体。用基于lux的发光(基于由liu和同事开发的系统53)的操纵子的初始实验显示表达两个模型结合伙伴的菌株和表达一种的菌株之间发光的20倍差异(图3e)。我们将通过添加由ptp和ptk调节的蛋白质‑蛋白质相互作用继续开发该操纵子(参见以下)。[0588]该操纵子允许拥有ptp1b的光控开关变体的细胞在一种光源存在的情况下比在另一种光源存在的情况下(例如，750nm与650nm)生长更快。生长速率的差异能够鉴定功能嵌合体。用基于lux的发光的操纵子(基于由liu和同事开发的系统53)的初始实验显示表达两个模型结合伙伴的菌株和表达一种的菌株之间发光的20倍差异(图3e)。我们将通过添加由ptp和ptk调节的蛋白质‑蛋白质相互作用继续开发该操纵子。[0589]fret传感器。我们将使用forster共振能量转移(fret)来监视活细胞中ptp1b的活性。我们的初步传感器当用src激酶处理时展示出fret信号的20％减少(图3f)。先前的成像研究指示fret的20％变化足以监视细胞内激酶活性54"56。为了增强成像研究中的空间分辨率，我们将尝试进一步优化我们的传感器(和使用其来测量体外ptp1b的活性)。[0590]1.为了进化通过红光和红外光调节的磷酸酶和激酶。[0591]该部分使用定向进化来构建用红光和红外光可“打开”和“关闭”的酶。当我们(i)构建将ptp1b的活性与抗生素抗性联系在一起的基因操纵子，(ii)使用该操纵子来构建ptp1b‑光敏素嵌合体，其响应红光和红外光展示出活性的三倍至十倍变化和(iii)构建相似的step和ptk6的光敏素嵌合体时，我们将知道我们是成功的。[0592]假设。当暴露于红光和红外光时，光敏素蛋白展示出总体构象变化27,28，但迄今为止，已经避开合理的整合入光控开关酶。我们假设将ptp或ptk活性与细胞生长联系在一起的基因操纵子将能够通过红光或红外光刺激的ptp‑或ptk‑光敏素嵌合体进化。[0593]实验方式：我们将构建将ptp1b抑制与抗生素抗性联系在一起的操纵子，并且我们将使用操纵子以进化光控开关ptp1b‑光敏素嵌合体。该努力将涉及(i)构建连接体组成和/或连接体长度不同的ptp1b‑光敏素嵌合体的文库，(ii)使用我们的操纵子来筛选功能突变体的文库，(iii)最可光控开关的突变体的动力学和生物结构特性，和(iv)将该方式扩展至step和ptk6。该努力具有两个主要目标：通过红光和/或红外光调节的ptp1b的变体，和使用定向进化将光学控制扩展至新的酶和不同光波长的一般方式。[0594]2.用于进化ptp1b‑光敏素嵌合体的合成操纵子的开发。[0595]我们将通过将其c‑末端a‑螺旋附着至来自沼泽红假单胞菌的细菌光敏素蛋白1(bphp1)的n‑末端a‑螺旋，构建通过红光和红外光调节的ptp1b的变体(图9)；该蛋白质当暴露于650nm和750nm光时经历可逆的构象改变。光敏素比如bphp1对光控制是有价值的，因为它们可在构象之间主动地切换(即，“打开”和“关闭”)。然而，它们结构与基于笼的致动(它们不经历大规模“解旋”)相容；因此，它们已将在先前开发光控开关酶的努力中被忽视了。[0596]我们将通过使用将ptp1b活性与抗生素抗性联系在一起的基因操纵子进化光控开关ptp1b‑bphp1嵌合体。该操纵子将由下述六个组分组成(图10a‑b)：(i)拴在dna结合蛋白质的ptp1b底物结构域、(ii)拴在rna聚合酶的亚单元的底物识别结构域(即，底物同源性2结构域或sh2)、(iii)src激酶(能够磷酸化各种不同的底物的激酶)、(iv)ptp1b(或ptp1b的潜在光控开关的变体)、(v)抗生素抗性的基因和(vi)那种基因的操纵基因。[0597]具有该系统，ptp1b的光诱导失活将能够转录抗生素抗性的基因。先前的组已将使用相似的操纵子来进化蛋白质‑蛋白质结合伙伴(我们的系统是基于由liu等使用的操纵子来进化杀虫蛋白质53)；这里，我们采取另外(新的)步骤：(i)使用由酶(磷酸酶和激酶)介导的蛋白质‑蛋白质相互作用和(ii)在光存在和不存在的情况下筛选该相互作用。[0598]我们已经开始通过使用基于lux的发光作为输出开发我们的操纵子。初步结果显示，模型蛋白质‑蛋白质结合伙伴可引起发光的20倍变化(图3e)。我们计划用底物和sh2结构域交换出这些结合伙伴，并且与同时表达的ptp1b和src激酶一起测试新的系统(其具有一些互补的活性，且可在大肠杆菌中表达68,69)。[0599]使用表达光敏磷酸酶的操作子的优势包括但不限于能够高通量筛选光控开关酶的突变体，并且提供了筛选它们所激发的酶文库的方法，参见，图5a用于示例。相反，已经显示诱变光控开关酶可调整(即，改善)其动态范围(即，暗黑‑状态活性与光‑状态活性的比例)；而一些已公布的研究，如wo2011002977，geneticallyencodedphotomanipulationofproteinandpeptideactivity，2011年1月6日公布的，提出了，但没有证明蛋白光开关的诱变可使光控开关酶能够光谱调控。wo2011002977，提供了一列这样的位点，其可被突变以修饰lov2的黄素‑结合口袋，以接受在可选的波长吸收光的黄素。然而，它们的构建体被描述为燕麦(燕麦)向光素1(404‑546)的lov2结构域，其包括c‑末端螺旋延伸jα，其中ja解旋而不是本文描述的aα螺旋。尽管如此，还没有可用的方法来进行具有修饰的结合口袋的突变体的高通量筛选，本文描述的本发明为这样做提供了平台。此外，与wo2013016693，"near‑infraredlight‑activatedproteins"，公布日期2013年01月31日形成对照，本文描述的发明提供了一个这样的平台，其用于筛选潜在的改善/修饰的光控开关蛋白质的变体，比如植物光动蛋白1lov2。[0600]另外，筛选酶的文库的方法能够检测改变任何酶的活性的(i)分子或(ii)光控开关结构域，接着可调节与蛋白质‑蛋白质相互作用相关的亲和力或结果：证实了蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)和蛋白酪氨酸激酶(ptk)。而且，考虑了蛋白酶作为蛋白质添加至该系统。[0601]c.定向进化。[0602]我们将通过将重叠延伸pcr(oepcr)与易错pcr(eppcr)配对构建ptp1b‑bphp1嵌合体的文库。特别地，我们将使用oepcr来构建连接体长度不同的嵌合体(这里，我们定义连接体为包括ptp1b的c端a‑螺旋和bphp1的n端a‑螺旋的‑20残基区域)，并且我们将使用eppcr来改变连接体组成。取决于该初始文库的结果，我们可将易错pcr扩展至bphp1基因中，但我们不会将ptp1b突变超出其c端a‑螺旋。[0603]在少量的抗生素(即阻碍大肠杆菌生长的量)存在的情况下，我们的基因操纵子将引起含有功能ptp1b‑bphp1嵌合体的细胞在红光和红外光下展示不同生长速率。我们将利用这些差异来鉴定携带光控开关构建体的细胞。简言之，我们将(i)产生两个复制平板的细胞菌落，(ii)在红光下生产一个和在红外光下生产一个(图11a)，和(iii)选择显示不同生长的菌落的(热门产物)的子集。我们将通过在红光和红外光下在小范围液体培养基(例如，具有～1ml/孔的96孔板；图11b)中使它们生长，和通过测序显示生长速率最大不同的菌落的ptp1b‑bphp1基因，来进一步表征我们的热门产物。[0604]我们将通过寻求以下两个策略构建step和ptk6的酶‑光敏素嵌合体：(i)将用step或ptk6替换我们最终的ptp1b‑bphp1嵌合体中的ptp1b；该策略将允许我们来评估我们最终设计的模块性，(ii)我们将使用我们的基于操纵子的方式以进化功能step‑bphp1和ptk6‑bphp1嵌合体；该策略将允许我们来评估我们的进化方式的通用性。[0605]进化step‑bphp1和ptk6‑bphp1嵌合体的操纵子将非常类似于ptpib‑特异性操纵子。对于step，我们将使用step‑特异性底物和sh2结构域(具有广泛的底物特异性的src激酶可能在step底物的子集上具有互补的活性)；对于ptk6，我们将使用识别过程，其通过磷酸化被抑制—而不是活化(这里，我们可使用ptp1bwt作为互补酶)。[0606]d.扩展的方式。[0607]我们将尝试通过寻求以下两种策略构建step和ptk6的酶‑光敏素嵌合体：(i)我们将用step或ptk6替代我们最终的ptp1b‑bphp1嵌合体中的ptp1b；该策略将允许我们来评估我们最终设计的模块性，(ii)我们将使用我们的基于操纵子的方式以进化功能step‑bphp1和ptk6‑bphp1嵌合体；该策略将允许我们来评估我们的进化方式的通用性。[0608]进化step‑bphp1和ptk6‑bphp1嵌合体的操纵子将非常类似于ptpib‑特异性操纵子。对于step，我们将使用step‑特异性底物和sh2结构域(具有广泛的底物特异性的src激酶可能在step底物的子集上具有互补的活性)；对于ptk6，我们将使用识别过程，其通过磷酸化被抑制—而不是活化(这里，我们可使用ptp1bwt作为互补酶)。[0609]f.示例性考虑了表征：酶‑光敏素嵌合体的生物物理表征。[0610]我们将通过使用晶体学和动力学分析的子集检查最可光控开关的嵌合体中光控制的结构基础。x‑射线晶体结构将显示bphp1如何影响ptp1b、step和ptk6的结构。动力学研究将显示bphp1如何影响底物特异性和结合亲和力(或更特别地，km，其由结合亲和力影响)。[0611]表1.示例性启动子[0612][0613]表2.示例性核糖体结合位点[0614][0615]表3.示例性蛋白质序列(包括截短)[0616][0617][0618][0619][0620][0621][0622][0623]表4.示例性终止子[0624][0625]表5.示例性dna序列(包括截短):[0626][0627][0628][0629][0630][0631][0632][0633][0634][0635][0636][0637][0638][0639][0640][0641][0642][0643][0644][0645][0646][0647][0648][0649][0650][0651]缩写词[0652]ptpib，蛋白酪氨酸磷酸酶ib；tc‑ptp，t‑细胞蛋白酪氨酸磷酸酶；shp2，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体11型；bbr，3‑(3,5‑二溴‑4‑羟基‑苯甲酰基)‑2‑乙基‑苯并呋喃‑6‑磺酸‑(4‑(噻唑‑2‑基氨磺酰基)‑苯基)‑酰胺；tcs401，2‑[(羧基羰基)氨基]‑4,5,6,7‑四氢‑噻吩并[2,3‑c]吡啶‑3‑羧酸盐酸盐；aa，松香酸；sca，统计耦合分析。ptp1b1‑435，蛋白酪氨酸磷酸酶1b(全长)；sacb，果聚糖蔗糖酶；ghs，γ‑蛇麻烯合酶；ads，紫穗槐二烯合酶；abs(或agas)，松香二烯合酶；txs，紫杉烯合酶，ptpn5，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体5型；ptpn6，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体6型；ptpn11，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体11型；ptpn12，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体12型；pptn22，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型；rpoz，rna聚合酶的ω亚单元；ci(或ci434)，来自λ噬菌体的ci阻遏物蛋白质；kras(或p130cas)，p130cas磷酸酪氨酸底物；midt，来自仓鼠多瘤病毒的磷酸酪氨酸底物；egfr底物，来自表皮生长因子受体的磷酸酪氨酸底物；src，src激酶；cdc37，hsp90共伴侣cdc37；mbp，麦芽糖‑结合蛋白质；luxab，细菌荧光素酶模块a和b；specr，大观霉素抗性基因；ggpps，香叶基香叶基二磷酸合酶；p450(或p450bm3)细胞色素p450；lov2，来自向光素1的光‑氧‑电压结构域2；bphp1，细菌光敏素；galk，半乳激酶。[0653]实施例[0654]提供以下实施例是为了阐释本发明的各种实施方式，但不应被视为限制本发明的范围。[0655]动力学模型的统计分析。我们评估了如先前描述的四种动力学模型的抑制(19)。简言之，我们使用f检验以比较双参数混合模型与几个单参数模型，并且我们使用akaike信息标准(aic或ai)以比较单参数模型彼此。具有p<0.05的混合模型优于所有单参数模型，具有aj>10的单参数模型劣于参考(即“最佳拟合”)模型。[0656]ic50的示例性评估。我们通过使用动力学模型以评估将20mm的pnpp的ptp‑催化水解的初始速率降低50％所需的抑制剂浓度来估计bbr的半数最大抑制浓度(ic50)，并且我们使用matlab函数“nlparci”来确定那些估计值的置信区间(19)。[0657]以上说明书中提到的所有出版物和专利通过引用并入本文。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方式对本发明进行了描述，但应理解，如要求保护的本发明不应不适当地限制在这种具体的实施方式中。事实上，用于进行对于医学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、统计学或相关领域的那些技术人员来说是显而易见的本发明的所描述的模式的各种修饰意欲在所附权利要求的范围内。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3