TCR配体的高通量肽-MHC亲和力筛选方法与流程

本发明涉及一种高通量筛选tcr结合肽配体/mhc分子复合体(包括稳定的肽-mhc分子)的方法以及所述方法的各自用途。本发明进一步涉及包含稳定mhc分子或其肽结合片段或由该稳定mhc分子或其肽结合片段组成的多肽、包含所述多肽的药物组合物、包含所述药物组合物的疫苗以及所述疫苗在制备药物和/或预防癌症中的用途。本发明进一步涉及编码所述多肽的核酸和包含所述核酸的载体。发明背景细胞表面mhc分子上提呈肽在病毒感染或癌症的免疫应答中起基础作用(1)。mhci类分子为三聚体复合体，其由多态性重链、β-2微球蛋白(β2m)和肽配体组成，通常为8至10个氨基酸长并源自胞质蛋白的降解。t细胞可用其克隆特异性t细胞受体(tcr)识别特异性肽-mhc复合体(pmhc)并启动免疫应答。可溶性pmhc复合体的产生对于科学和临床领域中以pmhc和tcr之间相互作用为主题的许多不同应用很重要。这些复合体于1992年使用蛋白质表达和重折叠技术首次产生，并且从那时起已用于多种应用场合，例如，透过流式细胞术或亲和力测量tcr-pmhc相互作用而鉴定抗原特异性t细胞(2-5)。tcr对其同源pmhc的亲和力对表达t细胞的功能性具有重大影响(6)。因此，在改善低亲和力tcr的亲和力以达到临床应用最佳水平方面已做出了很多努力(7)。大量的成熟实验产生了具有皮摩尔级别亲和力的tcr，该级别范围通常只有抗体能达到。它们(即使呈单体形式)以长相互作用半衰期与靶向pmhc结合，因此，作为双特异性t细胞参与形式中的肿瘤细胞参与组分引起关注(8，9)。woa013/030620公开了重组mhci类分子，其在细菌中产生并以检测表位特异性ctl的不溶性附着体存在。这些分子首先在离液剂溶液中变性。然后在存在所需肽(复性、重折叠)的情况下除去离液剂，并透过凝胶过滤色谱法从未折叠的蛋白质中分离肽i类复合体。wo2013/030620提出了一种编码mhci类分子的基因，所述mhci类分子具有α1螺旋和α2螺旋，所述基因被编码使得mhci类分子中的α1螺旋和α2螺旋之间形成一个键。因此，可提供一种用于分析t细胞频率的试剂盒。氨基酸139被半胱氨酸取代从而提供cys-139，氨基酸84被半胱氨酸取代从而提供cys-84或氨基酸85被半胱氨酸取代从而提供cys-85，在mhci类重链中的α-1螺旋和α-2螺旋之间的cys-139和cys-84之间或cys-139和cys-85之间形成二硫桥键。us2009-0117153公开了所谓的二硫键陷阱，其包含透过两个半胱氨酸之间延伸的二硫键共价附着至mhci类重链分子的抗原肽。在一些构型中，二硫键陷阱(例如，二硫键陷阱单链三聚体(dtsct))可包含单个连续多肽链。二硫键陷阱在细胞中合成后，在er中适当氧化并可被t细胞识别。在一些构型中，二硫键陷阱的肽部分不会被高亲和力竞争肽取代，即使该肽与重链相对较弱地结合。在各种构型中，二硫键陷阱可用于疫苗接种以引发cd8t细胞，以及用于多价mhc/肽试剂以枚举和跟踪t细胞。还公开了核酸，其包含编码二硫键陷阱的序列。此类核酸(可以是dna载体)，可用作疫苗。zeynephein等人(在：peptide-independentstabilizationofmhcclassimoleculesbreachescellularqualitycontrol.jcellsci2014127：2885-2897一文中)描述了鼠mhc-1同种异型h-2kb的变体，其中α1和α2螺旋透过靠近f袋的二硫键连接，从而限制它们的移动性。c84-c139二硫键允许正常的plc相互作用和抗原提呈，但使mhc-i表面表达成为tap和tap结合素(tapasin)非依赖性，加速顺行运送，并大大降低mhc-i内吞作用的速率。wo2011/101681公开了二硫键稳定的重组mhcii类分子，其透过位于所述α链的α2结构域与所述β链的β2结构域中的半胱氨酸残基之间的二硫键连接，其中所述半胱氨酸残基不存在于天然mhcii类α2和β2结构域中。wo2018/029350公开了kon-速率测定法和改进tcr配体koff-速率测定法，其透过与uv肽交换技术的新组合实现更广泛的应用。本公开以高通量方式实现koff-速率mhc单体制备，其后可用于在测定法(例如，先前不可行的tcr配体koff-速率测定法)中筛选扩展肽文库的tcr候选物。此外，uv肽交换搭配koff-速率mhc单体可实现对识别携带半胱氨酸氨基酸的特异性肽的tcr候选物的分析，所述半胱氨酸氨基酸先前可能干扰甚或终止koff-速率测量。newell等人(在：newellew，“higherthroughputmethodsofidentifyingtcellepitopesforstudyingoutcomesofalteredantigenprocessingandpresentation.”frontiersinimmunology.2013；4∶430一文中)公开了使用质谱流式细胞技术的高含量组合肽-mhc四聚体染色。bakker等人(在：bakkerah，hoppesr，linnemannc，etal.，“conditionalmhcclassiligandsandpeptideexchangetechnologyforthehumanmhcgeneproductshla-a1，-a3，-a11，and-b7.”pnas2008；105(10)：3825-3830一文中)公开了暴露于可设计用于人mhc分子hla-a2的长波紫外光后崩解的条件性配体。据称，这种肽交换技术可开发成为基于mhc高通量应用的一种普遍适用方法，以用于分析细胞毒性t细胞免疫。cochranandstern(在：“adiversesetofoligomericclassiimhc-peptidecomplexesforprobingt-cellreceptorinteractions.”chembiol.2000sep；7(9)：683-96一文中)公开了多种工具，以研究负责启动t细胞中激活过程的分子机制。透过改变引入的半胱氨酸残基位置以及新颖和市售交联试剂上携带的巯基反应性基团的数量和间隔，产生大小为二聚体至四聚体不等的拓扑学多样性人mhc蛋白hla-dr1寡聚体集。掺入交联试剂中的萤光探针有助于测量与t细胞表面结合的寡聚体。寡聚mhc-肽复合体(包括多种mhc二聚体、三聚体和四聚体)与t细胞结合并以抗原特异性方式启动t细胞激活过程。chong等人(在“high-throughputandsensitiveimmunopeptidomicsplatformrevealsprofoundinterferon-γ-mediatedremodelingofthehumanleukocyteantigen(hla)ligandome.”molecular&cellularproteomics：mcp.2018；17(3)：533-548一文中)公开了一种高通量、可重复和灵敏的方法，用于来自板形式中多达96个样本的hla-i和-ii肽的按次序免疫亲和力纯化，其适用于细胞系和组织。此方法旨在改善免疫肽组产线中声称的最关键步骤，即样品制备，因为其决定了总体肽产率和再现性。luimstra等人(在：luimstrajj，garstkama，roexmcj，etal.″aflexiblemhcclassimultimerloadingsystemforlarge-scaledetectionofantigen-specifictcells.”jexpmed2018；215(5)：1493-1504一文中)公开了使用温度介导肽交换平行生成许多不同mhci类(mhci)多聚体的一种声称简单、快速、灵活和有效的方法。他们设计了hla-a*02：01和h-2kb的条件性肽，其在低温下形成稳定肽-mhci复合体，但在暴露于所定义的升高温度时解离。所得的条件性mhci复合体(无论是单独的，还是制备为即用型多聚体)可以在不需额外处理的情况下在短时间内快速装载所选择的肽。tcr亲和力增强的潜在缺点是引入靶外毒性。由于tcr存在固有交叉反应性，这些缺点可透过不知不觉地增加对其他pmhc的亲和力而产生(10)。临床研究中已报告多个此类病例(11-13)。因此，全面筛选不仅对于确保疗效是必要的，对确保候选治疗剂的特异性和安全性也是必要的(14)。鉴于目前确立的免疫肽组大小(透过质谱法鉴定了至少150,000个mhci类配体肽)以及产生pmhc的可用方法，这是一项高度复杂的任务(15)。pmhc文库的大规模产生和随后的tcr高通量结合筛选(例如，产生结合基序或潜在交叉反应性肽的直接鉴定和表征)仍然难以使用上述的本领域常见技术实现。这种困难会延伸至高品质pmhc复合体的制备，即使对于个体或机构而言数量较少且无产生pmhc的技术上具有挑战性的必需设施(例如，在临床环境中时间敏感性按需生产)也是如此。因此，本发明的一个目的是提供本领域的改进策略。技术人员在阅读本发明的以下说明后，本发明的其他目的和方面将变得明了。根据本发明的第一方面，本发明的上述目的透过一种筛选tcr结合肽配体/mhc分子复合体(pmhc)的方法解决，其包括以下步骤：a)提供适当稳定的mhc分子，其中所述mhc分子在以下氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥：(i)在mhci的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和α2结构域氨基酸之间；和/或(ii)在mhci情况下，在所述稳定mhc分子α1结构域的两个氨基酸之间；或(iii)在mhcii情况下，在所述稳定mhc分子α1结构域的两个氨基酸或β1结构域的两个氨基酸之间；和/或(iv)在mhcii情况下，在所述稳定mhc分子α1结构域的一个氨基酸和β1结构域的一个氨基酸之间。b)使所述适当稳定的mhc分子与其大量肽配体接触，以形成肽配体/mhc(pmhc)分子复合体，以及c)筛选所述pmhc分子复合体的tcr结合。根据本发明所述的方法为优选，其中所述稳定mhc分子透过例如下列而包括两个氨基酸之间的至少一个人工引入的共价二硫键，更优选为α-螺旋之间的氨基酸之间的至少一个人工引入的共价键：(i)将mhci的第84位的氨基酸(在大多数hla中为酪氨酸，参见图13)和第139位的氨基酸(在大多数hla中为丙氨酸，参见图13)突变为半胱氨酸，和/或(ii)使第22位的氨基酸(在大多数hla中为苯丙氨酸，参见图13)和第71位的氨基酸(在大多数hla中为丝氨酸，参见图13)突变，和/或(iii)使第51位的氨基酸(在大多数hla中为色氨酸，参见图13)和第175位的氨基酸(在大多数hla中为甘氨酸，参见图13)突变或(iv)使第22位的氨基酸(在大多数hla中为苯丙氨酸，参见图13)和第71位的氨基酸(在大多数hla中为丝氨酸，参见图13)突变，以及使第51位的氨基酸(在大多数hla中为色氨酸，参见图13)和第175位的氨基酸(在大多数hla中为甘氨酸，参见图13)突变(基于igmt编号，但排除前24个氨基酸)。此类稳定mhc分子可称为二硫化物修饰的mhc分子或二硫化物修饰的mhc突变体。tcr或mhc分子可适当地固定于固体表面上，例如晶片、载玻片、生物感测器或珠上，特别是作为高通量筛选形式时。第二方面，本发明提出了包含稳定mhc分子或其肽结合片段或由该稳定mhc分子或其肽结合片段组成的多肽，其在以下位置之间包含至少一个人工引入的共价键：(i)mhciα1结构域的两个氨基酸之间；和/或(ii)mhci的α1结构域中的一个氨基酸和mchi的α2结构域中第160至179位氨基酸内的一个氨基酸之间；或(iii)mhcii的α1结构域的两个氨基酸或β1结构域的两个氨基酸；和/或(iv)mhcii的α1结构域的一个氨基酸和mhcii的β1结构域的一个氨基酸之间。透过例如人工引入半胱氨酸残基而非天然氨基酸修饰而形成共价键的两个氨基酸位置基于其相对距离选择。如果mhci或mhcii中不透过肽键彼此天然相连的两个氨基酸彼此之间的距离与共价键的距离相似，则优选它们被可形成共价键的氨基酸(例如，半胱氨酸)所取代。因此，优选情况是，修饰在折叠蛋白质中距离为3至的两个氨基酸(在各氨基酸的α碳之间确定)。大量mhci和mhcii分子的3d结构皆已知，并且技术人员可使用标准软件来确定折叠分子内两个给定氨基酸之间的距离。如果两个氨基酸在mhci的α1结构域中被修饰，则优选一个氨基酸在mhci的β1单元中被修饰，另一个在mhci的α1单元中被修饰。特别地，β1单元的合适区域在第12至32位氨基酸内，优选为在第17至27位氨基酸内，更优选为在第20至24位氨基酸内，最优选为在第22位氨基酸。特别地，α1单元的合适区域在第61至81位氨基酸内，优选为在第66至76位氨基酸内，更优选为在第69至73氨基酸内，最优选为在第71位氨基酸。在每种情况下，优选为在各别指示的氨基酸区段内选择在折叠mhci或mhcii蛋白质中距离为3至的两个氨基酸(在各氨基酸的α碳之间确定)。如果两个氨基酸在mhcii的α1结构域中被修饰，则优选一个氨基酸在mhcii的β1单元中被修饰，另一个在mhcii的α1单元中被修饰。特别地，β1单元的合适区域在第10至40位氨基酸内，优选为在第13至35位氨基酸内，更优选为在第22至25位氨基酸内，最优选为在第22位氨基酸。特别地，α1单元的合适区域在第45至78位氨基酸内，优选为在第50至70位氨基酸内，更优选为在第56至66位氨基酸内，最优选为在第59位氨基酸。在每种情况下，优选为在各别指示的氨基酸区段内选择在折叠mhci或mhcii蛋白质中距离为3至的两个氨基酸(在各氨基酸的α碳之间确定)。如果两个氨基酸在mhcii的β1结构域中被修饰，则优选一个氨基酸在mhcii的β3单元中被修饰，另一个在mhcii的α3单元中被修饰。特别地，β3单元的合适区域在第15至53位氨基酸内，优选为在第17至41位氨基酸内，更优选为在第21至28位氨基酸内，最优选为在第26位氨基酸。特别地，α3单元的合适区域在第52至88位氨基酸内，优选为在第66至76位氨基酸内，更优选为在第65至80位氨基酸内，最优选为在第75位氨基酸。在每种情况下，优选为在各别指示的氨基酸区段内选择在折叠mhci或mhcii蛋白质中距离为3至7.5a的两个氨基酸(在各氨基酸的α碳之间确定)。如果一个氨基酸在mhci的α1结构域中被修饰而一个氨基酸在mhci的α2结构域中第160至179位氨基酸内被修饰，则优选α1结构域中的一个氨基酸在α1单元中被修饰，优选为在第50至70位氨基酸内，更优选为在第50至60位氨基酸内，更优选为在第50至54位氨基酸内，最优选为在第51位氨基酸。优选α2结构域中的另一个氨基酸在α2单元中被修饰，合适区域在第165至178位氨基酸内，优选为在第170至177位氨基酸内，更优选为在第173至176位氨基酸内，最优选为在第175位氨基酸。在每种情况下，优选为在各别指示的氨基酸区段内选择在折叠mhci蛋白质中距离为3至的两个氨基酸。因此，在一特别优选实施方案中，稳定mhci包含第51位和第175位修饰的氨基酸。如果一个氨基酸在mhcii的α1结构域中被修饰而一个氨基酸在mhcii的β1结构域中被修饰，则优选的一个实施方案为：α1结构域中的一个氨基酸在α1单元中被修饰。在一对被修饰的氨基酸中，第一个被修饰的氨基酸在第50至70位氨基酸内，更优选为在第50至60位氨基酸内，更优选为在第50至54位氨基酸内，最优选为在第51位氨基酸。β1结构域内的另一个被修饰的氨基酸优选为在横跨第70至95位氨基酸的α3单元内，优选为在第74至94位氨基酸内，优选为在第83至93位氨基酸内，更优选为在第87至92位氨基酸内，最优选为在第89位氨基酸。在另一对被修饰的氨基酸中，第一个被修饰的氨基酸在第70至90位氨基酸内，更优选为在第70至85位氨基酸内，更优选为在第72至79位氨基酸内，最优选为在第76位氨基酸。β1结构域内的另一个被修饰的氨基酸优选为在横跨第50至95位氨基酸的α3单元内，优选为在第50至65位氨基酸内，优选为在第50至60位氨基酸内，更优选为在第50至55位氨基酸内，最优选为在第53位氨基酸。在每种情况下，优选为在各别指示的氨基酸区段内选择在折叠mhcii蛋白质中距离为3至的两个氨基酸。进一步优选为在一个mhc内包含两对被修饰的氨基酸。特别地，可组合的优选组合于上述适用mhci之(i)和(ii)项以及上述适用mhcii之(iii)和(iv)项中指示。因此，优选为第一对被修饰的氨基酸包含mhci的β1单元中被修饰的一个氨基酸和α1单元中被修饰的一个氨基酸。特别地，β1单元的合适区域在第12至32位氨基酸内，优选为在第17至27位氨基酸内，更优选为在第20至24位氨基酸内，最优选为在第22位氨基酸。特别地，α1单元的合适区域在第61至81位氨基酸内，优选为在第66至76位氨基酸内，更优选为在第69至73位氨基酸内，最优选为在第71位氨基酸。第二对被修饰的氨基酸包含一个在mhci的α1结构域中被修饰的一个氨基酸和一个在mhci的α2结构域中第160至179位氨基酸内被修饰的氨基酸。优选为α1结构域的一个氨基酸在α1单元中被修饰，优选为在第50至70位氨基酸内，更优选为在第50至60位氨基酸内，更优选为在第50至54位氨基酸内，最优选为在第51位氨基酸。特别地，α2结构域内修饰另一氨基酸的合适区域在第165至178位氨基酸内，优选为在第170至177位氨基酸内，更优选为在第173至176位氨基酸内，最优选为在第175位氨基酸。因此，在一特别优选实施方案中，稳定mhci包含第22位和第71位第一对被修饰的氨基酸以及第51位和第175位第二对被修饰的氨基酸。mhci的任何上述修饰物可进一步与一对修饰组合，其中第一个被修饰的氨基酸在第80至90位氨基酸内，优选为在第82至86位氨基酸内，更优选为在第84位氨基酸，第二个被修饰的氨基酸在第136至146位氨基酸内，优选为在第137至141位氨基酸内，更优选为在第139位氨基酸。令人惊讶的是，在mhci和mhcii的上述氨基酸区域中以及在各自指出的位置处的氨基酸修饰以及由此在非透过共价键天然连接的位置处之氨基酸之间引入共价键可产生如下的被修饰mhci和mhcii分子：(i)适当折叠，(ii)以高亲和力与肽结合，以及(iii)以高特异性和选择性被tcr分子识别。本发明第二方面优选的被修饰mhci和mhcii分子也可用于本发明的所有其他方面。本发明还包含被修饰mhci或mhcii分子的肽结合片段。如本领域所知，mhci和mhcii与肽结合，接着被与mhci或mhcii和肽相互作用的tcr结合。但是，仅需要部分mhci和mhcii分子与“提呈”至tcr的肽结合。在mhci中，α1和α2结构域折叠形成与肽结合的结合槽，在mchii中，α1和β1结构域形成与肽结合的结合槽。因此，mhci和mhcii的肽结合片段分别至少包含α1和α2结构域或α1和β1结构域。因此，结合片段可能缺少mhci中的跨膜结构域或另外的α3结构域或mhcii中的α2和/或β2结构域。至少缺少跨膜结构域的片段具有可溶性，特别适合用于药物组合物，特别是疫苗。本发明的第三方面提供了一种用于检测或产生tcr的特定氨基酸结合基序的方法，其包括进行根据本发明第一方面的方法(包含预选tcr)以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述预选tcr的特定氨基酸结合基序。本发明的第四方面提供了一种用于检测或确定tcr的交叉反应性的方法，其包括进行根据本发明第二方面的方法以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。本发明的第五方面提供了一种用于检测或确定tcr的交叉反应性的方法，其包括进行根据本发明第一方面的方法(包括预选tcr)以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。在本发明的第六方面，根据本发明的方法可用于筛选或体外引发(priming)细胞药物产品。与珠、丝、纳米颗粒或其他载剂结合的稳定的hla复合体可较容易地装载关注肽以模拟抗原提呈细胞，然后方便地与共刺激分子(例如，抗cd28、抗41bb)组合使用，作为“即用型”人工抗原提呈细胞以进行体外引发和扩增。目前用于大规模生成pmhc文库的方法(高亲和力tcr的高通量结合基序测定以及潜在交叉反应性肽的鉴定和表征)均存在稳定性问题，因此需要多聚体在不需额外处理的情况下在短时间内快速装载所选择的肽(如上文luimstra等人所述)，这也使得uv交换等技术不合适。本发明人利用当前技术获得了优于野生型分子或其他现有交换技术的多个优点：空的单体可在所需实验之前以批量方式产生，并且除了获得所需肽和快速肽装载反应之外，pmhc生成不受任何其他方法限制。本发明人已成功地将空单体在-80℃下储存至少一年并进行使用，而未检测到降解或肽接受性受损。本发明人还成功地将所得的pmhc复合体在4℃下保存至少两周，然后重新用于亲和力测量而未损失信号。除了透过引入修饰而实现的所有这些优点之外，由突变体显示所生成的pmhc复合体基本上代表了与tcr配体结合相关的野生型复合体。一方面，本发明提供了筛选tcr结合肽配体/mhc分子复合体的tcr结合的方法。所述方法包括使用适当稳定的mhc分子，所述适当稳定的mhc分子在mhci的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和α2结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，和/或在mhci情况下，在所述稳定mhc分子α1结构域的两个氨基酸之间含至少一个人工引入的共价桥，或在mhcii的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和β1结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥。主要组织相容性复合体i类和ii类共有一个整体上相似的折叠。结合平台由两个结构域组成，在mhci类的情况下来源于单个重α链(hc)，在mhcii类的情况下来源于两个链(α链和β链)。所述两个结构域演变在底部形成稍弯曲的β-折叠片，在顶部形成两个α-螺旋，它们的距离足够远能在其间容纳肽链。因此，对于两种mhc类别，均可实现根据本发明方法的适当稳定化。在一实施方案中，本发明涉及使用二硫键稳定的、最初为空的mhc分子，所述分子可在使用前透过简单地加入合适的肽来装载。使用此二硫键修饰的mhc分子所产生的pmhc代表了未修饰野生型变体，并适合于筛选(例如，高亲和力tcr的高通量结合基序测定以及潜在交叉反应性肽的鉴定和表征)。空的mhc在常用的表面(如，玻板)上基本不会降解，当装载肽时代表未修饰野生型变体并适合于筛选，而且即使固定在表面上也可快速产生pmhc。在本发明的背景下，这透过“适当稳定的”pmhc来实现并理解为“适当稳定的”或“稳定的”pmhc。在之前使用鼠mhci类分子h-2kb的研究中，透过将第84位的酪氨酸和第139位的丙氨酸突变为半胱氨酸而在f-袋中的相对残基之间引入二硫键能够稳定所述复合体。因此，在一实施方案中，例如，透过将mhci的第84位的酪氨酸和第139位的丙氨酸突变为半胱氨酸而在α-螺旋之间引入氨基酸之间的人工引入共价桥。虽然在某些情况下，没有任何肽配体可能难以分离单体，但可透过加入低亲和力肽来有效克服。术语“mhc”为短语“主要组织相容性复合体”的缩写。mhc是一组细胞表面受体，在对脊椎动物中改变的天然或外来蛋白质确立获得性免疫中起重要作用，这因而决定了组织内的组织相容性。mhc分子的主要功能为与衍生自改变蛋白质或病原体的抗原结合，并将它们展示于细胞表面上以被适当的t细胞识别。人mhc也称为hla(人白细胞抗原)复合体或hla。mhc基因家族分为三个亚组：i类、ii类和iii类。肽和mhci类的复合体由负载适当tcr的cd8阳性t细胞进行识别，而肽和mhcii类分子的复合体由负载适当tcr的cd4阳性辅助t细胞进行识别。由于cd8依赖型和cd4依赖型这两种反应共同并协同地促进抗肿瘤作用，因此，确定和表征肿瘤相关抗原和相应tcr在开发癌症免疫治疗(如：疫苗和细胞治疗)中非常重要。mhci分子由一条α链(也称为mhci重链)和一条β链(其构成β2微球蛋白分子)组成。在本发明的背景下，可与重链互换使用的α链包含三个α结构域，即，α1结构域、α2结构域和α3结构域。α1和α2结构域主要有助于形成肽袋，以产生肽配体mhc(pmhc)复合体。mhci的α1结构域横跨第1至90位氨基酸，且包含横跨第1-49位氨基酸的β折叠片二级结构(本文称为“β1单元”)，随后为横跨第50-84位氨基酸的α-螺旋结构(本文称为“α1单元”)。mhci的α2结构域横跨第91至182位氨基酸，且包含横跨第91-135位氨基酸的β折叠片二级结构(本文称为“β2单元”)，随后为横跨第138-179位氨基酸的α-螺旋结构(本文称为“α2单元”)。mhcii的β1结构域位于单独的多肽上，并在mhcii中实现mhci的α2结构域的结构作用。它横跨第1至95位氨基酸，且包含横跨第1-49位氨基酸的β折叠片二级结构(本文称为“β3单元”)，随后为横跨第50-95位氨基酸的α-螺旋结构(本文称为“α3单元”)。在本文以及任一指称mhci或mhcii分子氨基酸位置的情况下，位置基于igmt编号指示，但排除n-末端第一信号肽，其长度通常为20至29个氨基酸之间。本发明的稳定mhcii分子可能在两个单独的多肽上包含α1和β1结构域，或者它们可能在一个多肽中彼此连接以形成单链mhcii，例如，mhcii的α1结构域的c-末端直接或透过肽接头与mhcii的β1结构域的n-末端连接。hla分子的氨基酸序列在不同人之间有所不同。但是，hla可以透过国际公认的hla命名法(imgt命名法)来识别。例如，hla-a的分类基于给定hla与各hla的正式参考序列(透过序列比对产生)的同一性进行。因此，给定hla序列若与根据seqidno：6的hla-a序列具有最高序列同一性则被归类为hla-a。hla正式参考序列以及分类体系的资讯可在以下获得：www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/alignments.html。此网站提供了有关如何对任何给定hla序列进行分类的如下资讯：“生成的比对档使用以下命名和编号规范。这些规范基于已发布的关于人类基因突变的建议。这些建议由命名工作组编写，以规范如何命名和存储人类等位元基因变体的序列。这些建议可参见antonarakisse和《nomenclatureworkinggrouprecommendationsforanomenclaturesystemforhumangenemutations》(命名工作组人类基因突变命名体系建议)humanmutation(1998)111-3。-序列比对中只纳入hla系统因子whohla命名委员会正式认可的等位基因。-如同针对所有人类基因突变的建议，所有比对皆应使用标准参考序列。每个等位基因的参考序列的完整列表可参见下文。-参考序列将始终与同一(原始)登录号相关，除非此序列显示为有误。-所有等位基因均与参考序列比对。-序列的命名基于已发布的命名规范sgemarsh，etal.(2010)tissueantigens201075：291-455。”对于mhci类蛋白，以下hla参考蛋白质序列于2019年7月12日在网站上显示，其中各例所示的各hla登录号不会随时间推移而改变：mhci类蛋白hla-a(seqidno：6)(登录号hla00001)hla-b(seqidno：7)(登录号hla00132)hla-c(seqidno：8)(登录号hla00401)hla-e(seqidno：9)(登录号hla00934)hla-f(seqidno：10)(登录号hla01096)hla-g(seqidno：11)(登录号hla00939)hla-h(seqidno：12)(登录号hla02546)hla-j(seqidno：13)(登录号hla02626)hla-k(seqidno：14)(登录号hla02654)hla-l(seqidno：15)(登录号hla02655)hla-a基因位于染色体6的短臂上并编码hla-a的较大α链成分。hla-aα链的变异是hla功能的关键。这种变异促进了人群中的遗传多样性。由于每种hla对某些结构的肽均具有不同的亲和力，因此，更多种类的hla意味着在细胞表面上「提呈」更多种类的抗原。每个人最多可以表达两种各自来自父母的hla-a类型。有些人从父母双方遗传相同的hla-a，这降低了其个体hla多样性。但是，大多数人都遗传两种不同拷贝的hla-a。所有hla组都具有相同的模式。换句话说，每个人只能表达编码当前1740种活性蛋白的2432种已知hla-a等位基因中的一种或两种。hla-a*02表示特定的hla等位基因，其中字母a表示等位基因属于哪个hla基因，而首码“*02首码”表示a2血清型。在mhci类依赖性免疫反应中，肽不仅必须能与肿瘤细胞表达的某些mhc-i类分子结合，而且它们之后还必须能被负载特异性tcr的t细胞识别。在根据本发明优选方法的第二步骤中，使所述适当稳定的mhc分子与大量肽配体接触，以形成肽配体/mhc(pmhc)分子复合体。由于存在能够可逆地固定双特异性tcr构建体的多种可再生生物感测器，因此，使用pmhc复合体作为可溶性分析物来替代固定对于快速且具有成本效益的高通量筛选为优选。在本发明背景中，“接触”是指肽与空的和/或低亲和力肽装载mhc分子接触，使得大部分肽与所述空的和/或低亲和力肽装载mhc分子形成(“装载”)复合体。一优选实施例为：透过向合适缓冲液中的单体溶液加入和混合至少100∶1摩尔比的所需肽并在室温下孵育最少5分钟来装载mhc复合体。两个螺旋之间的凹槽可容纳肽，依据为(i)在所述mhc分子的侧链和所述肽的主链之间形成一组保守氢键，(ii)透过肽侧链占据所定义的袋(mhci类中的锚定残基p2或p5/6和pω以及mhcii类中的p1、p4、p6和p9)。个别肽侧链与mhc的相互作用类型取决于结合凹槽的几何形状、电荷分布和疏水性。在mhci类中，结合凹槽在两端透过保守酪氨酸残基封闭，导致结合肽的大小被限制为通常8-10个残基，且其c-末端进入f-袋中。相反，mhcii类蛋白质通常在其开放结合凹槽中容纳长度为13-25个残基的肽，且肽n-末端通常突出p1袋。据报告，mhci类的f袋区和mhcii类的p1区(包括p2位点)的相互作用似乎对稳定pmhc复合体的提呈和对某些肽表位的免疫优势具有显著影响。有趣的是，这些袋位于相应mhci类和mhcii类结构的结合凹槽的相对端。大量肽配体可包含至少约1,500个不同的mhc结合肽，优选为至少约5,000个不同的mhc结合肽，更优选为至少约15,000个不同的mhc结合肽，最优选为含有至少约150,000个mhc结合肽的免疫肽组制剂。所述肽包含对于mhci类蛋白而言长度为8-10个残基的结合基序及对于mhcii类蛋白而言长度为13-25个残基的结合基序，且所述肽的长度可以为8-100、优选为8-30、更优选为8至16个残基。最优选的为由实际结合基序组成的肽。在本发明背景中所使用的配体肽可衍生自与癌症相关、感染相关(细菌性或病毒性感染)、甚至免疫(例如，自身免疫)疾病相关的多肽。所述术语还包括适当突变或天然存在的突变配体肽，即，不同于它们在相应多肽中存在的潜在序列。根据本发明所述的一种方法为优选，其中所述接触包括在约4℃至37℃，优选为约室温(15°至25℃，优选为20℃)下将所述mhc结合肽装载到mhc上。令人惊讶的发现是，装载的hla/肽分子(pmhc或pmhc复合体)在约4℃下非常稳定的时间超过约1天，优选为超过1周(例如，超过2周)。与上述已知方法相比，这允许在更多应用场合中有效、方便地使用。在本发明的背景中发现以及相比之下上述文献中也有些发现，本方法明显优于使用wtpmhc分子的uv交换常用方法，可允许在表面(如，晶片或载玻片)上进行(特别是高通量方式)。虽然uv介导的肽配体交换可产生大量不同的pmhc复合体，但是交换效率根据肽及其与相应mhci类等位基因结合的亲和力而变化，这导致样本的pmhc浓度不同。这种不确定性对于用作可溶性分析物的pmhc的亲和力测量是一个问题，因为需要精确知道浓度才能确定准确的亲和力。由于二硫键稳定的mhc突变体在没有肽的情况下是稳定的，因此，此限制不适用。如果以足够高的浓度加入肽以使空的mhc复合体饱和，则知道pmhc的有效浓度，这可显著提高测量的准确性并避免假阴性结果。在本发明方法的下一步骤中，筛选所述pmhc分子复合体的tcr结合。这种相互作用的结合和动力学属性是保护性t细胞介导免疫的参数，tcr-pmhc相互作用较强，显示相互作用半衰期增加，因而比较弱者带来更优的t细胞激活和反应性。tcr和pmhc配体之间的相互作用强度通常描述和测量为解离常数kd，这是一个平衡常数，是特定相互作用的结合速率常数kon和解离速率常数koff之间的比率。解离常数kd与特定相互作用的结合强度负相关，因为kd值越小表示结合越强。筛选可包括测量和/或检测pmhc/tcr结合的任何合适和已知的方法，例如，结构tcr-pmhc亲和力/亲合力测量。一个实施例为：透过生物层干涉测量法(bli)筛选肽-mhc文库的tcr结合，所述bli是如本文所公开的一种特殊形式的反射干涉测量法(ri)，其中，检测到所述tcr的结合相互作用强于适合于kd1.0x10-5方法的灵敏度阈值且测得的kd值范围为3.7x10-9至7.2x10-6，或者当弱于灵敏度阈值时检测不到所述tcr的结合相互作用。其他方法涉及其他形式的ri，如：表面等离子共振(spr)技术或反射干涉光谱(rifs)技术或单色反射计(score，biametrics，图宾根，德国)，或基于标志物的测定法，例如，用ntamers(tcmetrix，埃帕林格斯，瑞士)或pmhc或tcr四聚体进行流式细胞术分析，或其他形式的萤光读数法(如：蛋白质微阵列)。当然，理想的情况是，这些方法可以用高通量方式执行/可以容易地调整为高通量方式。在本发明的背景中，除非另有说明，否则术语“约”表示包含给定值的+/-10％。本发明以一实施例提出了使用二硫键稳定的空hla-a*02：01分子，所述分子可在使用前透过简单地加入肽来装载。使用此修饰的mhc分子所产生的pmhc代表了未修饰野生型变体，因而证明用于高亲和力tcr的高通量结合基序测定以及潜在交叉反应性肽的鉴定和表征的合适性。根据本发明所述的一种方法为优选，其中所述mhc分子为hla，或选自二聚体、三聚体和四聚体组成组的hla、mhci或mhcii的多聚体。筛选中一次使用一种以上mhc分子的方法为本领域已知，例如，根据altman等人(在：“phenotypicanalysisofantigen-specifictlymphocytes.”，science.4oct1996：vol.274，issue5284，pp.94-969一文中)的方法。类似地，可使用二聚体或三聚体。所用的mhc分子包括氨基酸之间的至少一个人工引入的共价桥。所述桥选自重组引入的二硫桥键、引入待交联的非天然氨基酸、引入光交联氨基酸和化学方式引入的交联。本文描述了使用半胱氨酸引入交联；二聚体交联剂的实例为dpdpb和hbvs，三聚体交联剂的实例为tmea。根据本发明所述的方法为优选，其中氨基酸之间的所述至少一个人工引入的共价键透过例如下列引入α-螺旋之间：(i)将mhci第84位的氨基酸(在大多数hla中为酪氨酸，参见图13)和第139位的氨基酸(在大多数hla中为丙氨酸，参见图13)突变为半胱氨酸，和/或(ii)使mhci第22位的氨基酸(在大多数hla中为苯丙氨酸，参见图13)和mhci第71位的氨基酸(在大多数hla中为丝氨酸，参见图13)突变，和/或(iii)使mhci第51位的氨基酸(在大多数hla中为色氨酸，参见图13)和mhci第175位的氨基酸(在大多数hla中为甘氨酸，参见图13)突变或(iv)使mhci第22位的氨基酸(在大多数hla中为苯丙氨酸，参见图13)和mhci第71位的氨基酸(在大多数hla中为丝氨酸，参见图13)突变，以及使mhci第51位的氨基酸(在大多数hla中为色氨酸，参见图13)和mhci第175位的氨基酸(在mhci的大多数hla中为甘氨酸，参见图13)突变(基于igmt编号，但排除前24个氨基酸)。α1和α2结构域或整个mhc-i的分子动力学模拟试验表明，空的和肽结合的mhc-i之间存在一个显著差异：在没有肽的情况下，f-袋区域(α1和α2螺旋中分别为残基74-85和残基138-149)旁侧连接的螺旋部分的移动性显著更高。结合肽似乎限制了该区域的移动性，并且透过将肽结合袋的不同结构特征与共价键(优选为二硫键)连接可能实现类似有利和稳定性构形限制。为了确定每个给定hla等位基因中对应于上述残基22、5、71、74-85、138-149和175的位置处的氨基酸，各自序列与上述参考抗体比对。正式hla(mhci类)参考蛋白序列和鼠mhcih2kb蛋白的多个序列比对的实例，其中突出显示第22、51、71、84、85、139、140和175位氨基酸位置(粗体)以及适合引入稳定突变(灰色)的其他区域，如图13所示。图13将使得技术人员能够确定每个给定hla等位基因中对应于上述残基22、5、71、74-85、138-149和175的位置处的氨基酸。在一优选实施方案中，用于本发明的mhci分子为mhci类hla蛋白，优选为hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g、hla-h、hla-j、hla-k、hla-l。根据imgt命名的参考序列，这些优选的hla蛋白可分别在其α1结构域和α2结构域中突变。优选地，这些hla蛋白的一个或多个(优选为一个)氨基酸在第22位置内突变；一个或多个(优选为一个)氨基酸在第51位置内突变；一个或多个(优选为一个)氨基酸在第71位置内突变；一个或多个(优选为一个)氨基酸在第74-85位置内突变；一个或多个(优选为一个)氨基酸在第138-149位置内突变；一个或多个(优选为一个)氨基酸在第175位置内突变。更优选地，一个氨基酸在第84或85位突变以及一个氨基酸在第139或140位置突变。更优选地，一个氨基酸在第22位置突变、一个氨基酸在第71位置突变。更优选地，一个氨基酸在第22位置突变、一个氨基酸在第71位置突变、一个氨基酸在第51位置突变、一个氨基酸在第175位置突变。优选的氨基酸突变是将第74-85位置处的一个氨基酸和第138-149位置处的一个氨基酸取代为半胱氨酸。更为优选的氨基酸突变是将第22位置处的一个氨基酸取代为半胱氨酸。更为优选的氨基酸突变是将第51位置处的一个氨基酸取代为半胱氨酸。更为优选的氨基酸突变是将第71位置处的一个氨基酸取代为半胱氨酸。更为优选的氨基酸突变是将第175位置处的一个氨基酸取代为半胱氨酸。在另一优选的实施方案中，hla-a蛋白选自hla-a1、hla-a2、hla-a3和hla-all组成的组。根据imgt命名的参考序列，这些优选的hla-a蛋白可分别在其α1结构域和α2结构域中突变。优选地，这些hla蛋白可在第22、51、74-85、138-149和第175氨基酸位置处突变。更优选地，hla-a蛋白为hla-a*02蛋白。优选的hla-a等位基因为hla-a*02：01；hla-a*01：01或hla-a*03：01。在另一优选的实施方案中，hla-b蛋白选自hla-b*07、hla-b*08、hla-b*15、hla-b*35或hla-b*44组成的组。根据imgt命名的参考序列，这些优选的hla-b蛋白可分别在其α1结构域和α2结构域中突变。优选地，这些hlb蛋白可在第74-85和138-149氨基酸位置处突变。优选的hla-b等位基因为hla-b*07∶02；hla-b*08：01、hla-b*15：01、hla-b*35：01或hla-b*44：05。在本发明的背景中，术语“tcr”应包括任何包含tcr衍生或tcr样结合结构域的蛋白质分子/构建体，其中，所述分子/构建体适合于分析/检测本文所述的根据本发明的pmhc/tcr结合。在tcr的α-和/或β-链的情况下，可能包括两个链仍能够形成可发挥生物学功能的t细胞受体的分子(具有未修饰的α-和/或β-链或具有融合蛋白或修饰的α-和/或β-链)，特别是在肽激活后与(特异性)pmhc结合和/或功能性信号转导。根据本发明的方法为优选，其中所述tcr选自天然tcr、可溶性tcr分子、单链tcr和包含tcr衍生的或tcr样结合结构域(例如，衍生自抗体)的tcr样分子，如：双特异性(bs)tcr(例如，如本文所述一样的tcr)。与常用技术(包括uv交换相关方法)相比，优选实施方案中根据本发明的方法可平行检测、分析和/或筛选更多数量的肽配体和/或pmhc。透过i类和ii类人白细胞抗原(hla)分子提呈至细胞表面的一系列肽称为免疫肽组。2017年5月，报告了119，073个高可信度的hlai类肽和73，465个高可信度的hlaii类肽(shaow，pedriolipga，wolskiw，etal.thesystemhcatlasproject.nucleicacidsresearch.2018；46(databaseissue)：d1237-d1247)，因此可以预期，人免疫肽组超过各150,000个i类和ii类的mhc结合肽。目前的方法每天可分析约700个肽，因此需要“真正的”高通量方法，即所分析的大量肽配体包含至少约1,500个不同的mhc结合肽，优选为至少约5,000个不同的mhc结合肽，更优选为至少约15,000个不同的mhc结合肽，最优选为含有至少约150,000个mhc结合肽的基本完整免疫肽组制剂。本发明的方法可在一天的短时间内进行全免疫肽组的筛选。鉴于待检测/分析的pmhc/tcr结合的数量，根据本发明的方法为优选，其中，所述方法以高通量筛选(hts)形式进行。在hts中，在给定条件下，可对多达数十万个实验样品同时测试pmhc/tcr结合。所述样品通常并优选由实验室机器人处理，即，自动进行样品制备、处理和数据分析。因此，hts可容易且可靠地生成并使用大数据集来解答复杂的生物学问题，例如，如本文所述的pmhc/tcr结合动力学和生物学功能。hts通常需要以阵列形式制备样品。如需要，可让阵列样品在液体微量滴定板上或固体琼脂上生长。板密度范围可以为96、192、384、768、1,536或6,144。所有这些密度都是96的倍数，这反映了原始的96孔微量滴定板，其以8x12排列，间距为9mm(例如，也可参见beangj，jaegerpa，bahrs，idekert.“developmentofultra-high-densityscreeningtoolsformicrobial‘omics’，”plosone.2014jan21；9(1)：e85177一文)。对于与所检测/分析的以及如本文所述的pmhc/tcr结合动力学相关的用途，可使用固体表面(例如，晶片、生物感测器、载玻片或珠)，在所述表面可适当固定(例如，斑点化)一些分析试剂(例如，tcr或mhc分子)。对于固定，可使用任何合适的技术，例如，透过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用。本文所述实施方案的实例为结合测定法，其涉及至少一种可溶性tcr与至少一种固定pmhc的结合，或至少一种固定tcr与至少一种可溶性pmhc的结合。根据本发明所述的一种方法为优选，其中所述tcr和/或mhc分子未用可检测标志物进行标记或适当标记。各标志物为本领域已知，包括用放射性、萤光或化学基团(例如，染料)直接或间接标记。此外，可使用酶标志物或抗原标志物(用于以抗体检测)以及质量标志物。另一选项为编码标志物(例如，特定核酸)。在没有标记的情况下，可在复合体形成/结合后使用基于物理状态的变化而检测结合来确定结合状况，例如，质量、电荷或光学性质(例如，透过分析物结合情况判断生物层光学厚度，从而判断干涉模式或反射系数)的变化。检测结合的方法，特别是检测pmhc与tcr的“特异性”结合方法为本领域已知。在本发明中，根据本发明的方法为优选，其中，可测量所述tcr的kd值以及kon、koff值，优选为灵敏度kd为1x10-10m至1x10-3m，其中灵敏度可透过分析物浓度提示。一优选实施例为：使用从500nm开始的1∶2分析物稀释系列或使用从500nm开始的分析物稀释系列测量亲和力。一优选实施例为：肽配体/mhc分子复合体用于不同浓度的平行测定反应。根据本发明方法的再一重要方面，所述方法进一步包括测量t细胞激活的步骤，其包含tcr和与所述tcr结合的tcr结合肽配体/mhc分子复合体。透过结合检测此类t细胞激活的方法，特别是检测pmhc与tcr的“特异性”结合方法为本领域已知。本发明的一个实施例为：用肽装载靶细胞、jurkat效应细胞和六种不同浓度的bs-868z11-cd3进行了共孵育测定，来自位点扫描文库中肽配体所测得的亲和力与诱导比背景发光增加3倍所需的最低bstcr浓度之间的相关性作为截止值。本发明的再一重要方面为检测或产生tcr的特定氨基酸结合基序的方法，其包括进行本文所述的根据本发明的方法，其中，选择预选tcr以对其进行特定氨基酸结合基序的检测或产生。所述方法包括a)提供适当稳定的mhc分子，其中所述mhc分子在mhci的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和α2结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，并且在mhcii的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和β1结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，b)使所述适当稳定的mhc分子与其大量肽配体接触，以形成肽配体/mhc(pmhc)分子复合体，以及c)使用所述预选tcr筛选所述pmhc分子复合体的tcr结合。在额外步骤中，对检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列进行测定，并任选和优选进行比较，从而鉴定所述预选tcr的特定氨基酸结合基序。另一实施方案包括在鉴定后对特定氨基酸序列进行诱变，使所述突变肽与适当稳定的mhc分子接触，并用预选的tcr筛选所述pmhc分子复合体的tcr结合以获得所述预选tcr的氨基酸结合基序。肽诱变可容易地，例如，透过合成突变肽或化学修饰各肽结合物中的现有氨基酸进行。诱变还可涉及向肽添加标志物或其他基团，以鉴定诊断上有效的结合物。此方面涉及本文所述的根据本发明的方法，其中，重复所述方法步骤，其包括由鉴定的所述预选tcr的修饰氨基酸序列组成的肽库。此外，所述修饰可透过一种已知电脑演算法和/或程式引导，以基于氨基酸序列的修饰情况来计算改进的结合参数。本发明的一个实施例为：透过本文公开的生物层干涉测量法(bli)筛选pmhc复合体文库(包括所述方式产生的肽)对预选tcr的tcr结合，其中，检测到所述tcr的结合相互作用强于适合于kd1.0x10-5m方法的灵敏度阈值且测得的kd值范围为3.7x10-9m至7.2x10-6m，或者当弱于灵敏度阈值时检测不到所述tcr的结合相互作用。在所述实施方案中，本发明显示，因为含有适当稳定的mhc分子的pmhc复合体的产生可产生可预测量的pmhc，与现有方法相比提高了kd测量准确性，因此，相对于现有方法有特别改进(图5)。在另一实施方案中，大量肽配体主要由来自免疫肽组的已知肽配体组成(例如，透过质谱法确定)，其中，筛选了预选tcr的tcr结合以直接鉴定所述tcr的现有交叉反应性肽配体。根据本实施方案的方法为优选，其中，不同肽的数量包含平行测量的至少约1,500个不同mhc结合肽，优选为至少约5,000个不同mhc结合肽。本发明的再一重要方面为检测或确定tcr的交叉反应性的方法，其包括进行本文所述的检测或产生tcr的特定氨基酸结合基序的方法，以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。此方面检测单个tcr识别的肽的变体。本发明的再一重要方面为检测或确定tcr的交叉反应性的方法，其包括进行本文所述的根据本发明的筛选tcr结合肽配体/mhc分子复合体的tcr结合的方法(包括预选tcr)，以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。此方面也检测单个tcr识别的肽的变体。其一实施例为：基于氨基酸结合基序鉴定交叉反应性肽配体，所述基序为之前透过用根据本发明的诱变衍生pmhc复合体文库筛选预选tcr的tcr结合所确定，并在已知或假定的肽配体数据库中搜索匹配的肽配体。本发明的再一重要方面为检测或确定肽配体/mhc分子复合体的交叉反应性的方法，其包括进行本文所述的根据本发明的筛选tcr结合肽配体/mhc分子复合体的tcr结合的方法(包括预选pmhc)，以及鉴定检测到pmhc结合的那些tcr的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。此方面检测识别单个肽的tcr的变体。在这些方面，可以按如上所述使用检测pmhc与预选tcr结合的相同方法。但是，由于tcr结合不一定需要具有特异性，因此测量和评估结合的截止值和灵敏度不需要是最优的，而应根据相应情况选择最适合的，这对于技术人员是可以理解的。根据本发明方法的另一重要方面，所述方法可进一步包括测量t细胞激活的步骤，其包含tcr和与所述tcr结合的tcr结合肽配体/mhc分子复合体。透过结合检测此类t细胞激活的方法，特别是检测pmhc与tcr的“特异性”结合方法为本领域已知。本发明的一个实施例为：用肽装载靶细胞、jurkat效应细胞和六种不同浓度的bs-868z11-cd3进行了共孵育测定，来自位点扫描文库中肽配体所测得的亲和力与诱导比背景发光增加3倍所需的最低bstcr浓度之间的相关性作为截止值。因此，本发明的另一重要方面涉及一种包含适当稳定的mhc分子的药物组合物，其中，所述mhc分子在mhci的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和α2结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，和/或在mhci情况下，在所述稳定mhc分子α1结构域的两个氨基酸之间含至少一个人工引入的共价桥，和/或在mhcii的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和β1结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，其中所述稳定的mhc分子与珠、丝、纳米颗粒或其他合适载剂结合。在一优选的实施方案中，药物组合物包含根据本发明第二方面中所述的稳定mhc分子，如本发明第二方面所述。优选地，药物组合物中包含的稳定mhc分子不包含跨膜结构域。所述药物组合物还包含合适的缓冲剂和/或赋形剂。优选情况是，根据本发明的所述药物组合物可进一步包含共刺激分子(例如：抗cd28抗体或抗41bb抗体)的一种或多种的组合和/或这些共刺激分子的时间序列。因此，本发明的另一重要方面涉及根据本发明的药物组合物在本文中根据本发明的方法中的用途。在一实施方案中，药物组合物包含于一种疫苗。在另一实施方案中，药物组合物包含于一种疫苗，该疫苗用于制造药剂。优选地，疫苗用于预防癌症。更优选地，疫苗在给予有需要的受试者后引发或触发受试者的t细胞反应。优选地，疫苗药物组合物中包含的稳定mhc分子不包含跨膜结构域。因此，本发明的另一重要方面涉及透过用pmhc复合体刺激来改善t细胞受体个体化识别或t细胞激活和/或增殖性疾病(例如，癌症)的t细胞治疗剂从而为特定患者生产细胞药物产品的方法。这种刺激可基于装载肽的pmhc复合体，所述肽的鉴定方法为：获得/提供所述患者的癌组织和/或癌细胞样本、获得/提供所述患者的正常组织和/或细胞样本、使用或类似方法检测在所述样本中在mhc背景下提呈的肽、并测定至少一种所述肽的序列，任选地检测所测定所述肽的潜在基因表达、检测在所述样本中检测到的肽的mhc提呈水平/数量，任选地比较所述肿瘤和正常组织和/或细胞样本中检测到的肽的所述mhc提呈水平/数量、筛选优化tcr结合肽配体/mhc分子复合体(包含根据本发明的方法)。所述t细胞包括从所述患者中直接回收的t细胞，其可在所述刺激后作为细胞药物产品再次给药。所述刺激可包括使用预先产生的刺激框架，该刺激框架的产生是透过将适当稳定的mhc分子(优选为在临床等级条件(例如gmp)下产生)固定于载剂(例如，丝或珠)上，然后，所述载剂根据需要(例如直接在临床中心)装载肽。这些刺激框架还可包括与适当稳定的mhc分子一起固定的其他共刺激分子(例如，抗cd28抗体、抗41bb抗体)。在上述方法的一优选方面，所述肽(例如，某种癌症类型或其他种类增殖性疾病所特有的肽)透过先前在另一名或多名患者中的鉴定已为执行该程序的实体已知。因此，可替患有相同癌症类型的不同患者快速选择和生产所述肽，将所述肽装载于所述刺激框架上，并用于生产细胞药物产品。在上述方法的一优选方面，所述激活直接从所述患者回收的t细胞和/或t细胞治疗剂的过程还包括转导t细胞以表达肿瘤特异性外源性t细胞受体(tcr)和任选地适当地配制所述获得的t细胞治疗剂。术语“t细胞”是指本领域所定义的t淋巴细胞，且意图包括重组t细胞。本文所用的术语“t细胞受体”和“tcr”是指在t细胞表面上存在的分子，其负责识别与mhc分子结合的抗原，并且通常是指能够识别由mhc分子所提呈之肽的分子。所述分子为包括α和β链(或选择性地γ和δ链)的异二聚体或产生信号的tcr构建体。本发明的tcr为杂交tcr，其包括衍生自其他物种的序列。例如，由于在人t细胞中小鼠tcr比人tcr更有效地表达，因此tcr包括人可变区和鼠恒定区。此术语还包括可溶性tcr分子及其衍生物，只要它们包括结合所需的互补决定区(cdr)即可。wo03/100432、wo2005/076009和wo2011/128448等中描述了技术，其内容透过引用整体并入本文。在上述方法的一优选方面，所述开发针对增殖性疾病的改进个体化t细胞受体、t细胞和/或t细胞治疗剂进一步包括转导患者的自体(自身)t细胞以表达肿瘤特异性外源性t细胞受体(tcr)和任选地适当地配制所述获得的t细胞治疗剂。本发明人证实，一实施例中二硫化物修饰的hla-a*02：01分子可以容易地产生作为稳定且空的mhc单体，在重折叠后装载配体肽，并用于产生与使用野生型pmhc复合体收集的数据高度一致的亲和力数据。二硫键修饰的hla-a*02：01分子和双特异性tcr均可与基于bli的筛选联合使用以测量pmhc-bstcr结合亲和力，此平台的通量比目前在文献中用于这些相互作用的表面等离子共振测量高得多。二硫键修饰的hla-a*02：01分子是此平台的关键部分，提供可靠又高通量的pmhc生成。此平台也可用于分析其他若针对pmhc的生物制剂，如：单克隆抗体或双特异性抗体(例如，bite)。当本发明人用功能性双特异性t细胞参与剂进行pmhc-bstcr结合亲和力与细胞测定时，两种测定具有很好的相关性。就本发明人所知，这是pmhc-bstcr结合亲和力与体外活性之间就广泛亲和力范围内之关联的首次深入分析。与细胞筛选相比，亲和力筛选平台更易于使用并且执行速度明显更快，因此有资格作为早期筛选工具。由于二硫键修饰的hla-a*02：01分子具有可预测性提呈甚至低亲和力肽配体作为pmhc复合体的能力，因此，本发明人可在不必考虑外源肽装载方法中所发生变化的情况下精确测量pmhc-bstcr结合亲和力，因而不丢失可能具有价值的资讯。本发明人相信，所提出的亲和力分析平台的易用性将有助于从早期开始开发基于t细胞受体的安全、有效的双特异性分子。一实施例为：本发明人证明可以快速生成pmhc-bstcr结合亲和力数据集并从中外推出交叉反应性搜索基序。在本发明人的基于hla肽组学的平台引导下，搜索基序可用于鉴定可能具有交叉反应性的肽配体。在所提出的此策略实施过程中，本发明人能够鉴定由bstcr强烈识别并且能够诱导t细胞激活的大量肽，与原始靶标相比低至九个位置中之一个的序列一致性。这种令人兴奋的创新技术甚至可导致对整个发现的免疫肽组进行筛选：此类维度的pmhc文库目前仅透过使用随机突变单链肽mhc文库的酵母展示技术提供(32，33)。虽然这些技术可用于广泛的tcr分析，但与通常用于抗体开发的肽微阵列相比，它们在使用上更复杂且具有更难以预测的肽配体组成。由于其稳定性和不费力的肽装载过程，本发明二硫键修饰的hla-a*02：01分子可能是未来创立高度复杂pmhc微阵列的理想选择，例如，透过将空mhc的大规模包覆和现代多肽微阵列喷墨印表机的高通量相结合。主要组织相容性复合体(mhc)i类分子在细胞表面上提呈短肽配体以供细胞毒性cd8+t细胞询问。提呈肿瘤相关肽(tumap)的mhci类复合体是目前正在开发的癌症免疫治疗方法的关键靶标，对于疗效和安全性筛选非常重要。在没有肽配体的情况下，mhci类复合体不稳定并且快速衰变，使用于分析目的的可溶性单体的产生耗费大量人力。本发明人开发了二硫键稳定的hla-a*02：01分子，其在没有肽的情况下稳定，但可以在数分钟内与所选择的配体形成肽-mhc复合体。本发明人说明了工程化突变体和野生型变体在野生型或成熟型高亲和力tcr的结合亲和力方面的一致性。本发明人证实了其在双特异性tcr分子高通量亲和力筛选中作为分析物的可能性，并产生了全面的tcr结合基序，以鉴定靶外相互作用。本发明的另一方面涉及编码本发明第二方面的稳定mhc分子或其肽结合片段的核酸以及载体。本领域所熟知的是，mhci包含所有肽结合结构域(即，α1结构域和α2结构域)在一条多肽链上，而mhcii天然包含α1结构域和β1结构域在两条多肽链上。如前所述，透过将β1结构域与α1结构域融合，也可在单个肽上提供功能性mhcii。因此，编码本发明mhci和ii的核酸可编码一或两个多肽，或者两个多肽也可由两个单独的核酸编码。在本发明背景中，术语“核酸”系指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基或两者的单链或双链寡聚物或聚合物。核苷酸单体由核碱基、五碳糖(诸如，但不限于核糖或2’-去氧核糖)和一至三个磷酸基团组成。通常情况是，核酸透过各核苷酸单体之间的磷酸二酯键形成。在本发明背景中，术语核酸包括但不限于核糖核酸(rna)和去氧核糖核酸(dna)分子，但也包括包含其他连接的合成形式核酸(例如，如nielsen等人所描述的肽核酸(science254∶1497-1500，1991)。通常情况是，核酸为单链或双链分子，并由天然核苷酸组成。核酸单链的描述也定义了(至少部分地定义了)互补链的序列。核酸可以为单链，也可为双链，或者可包含双链和单链序列的部分。典型的双链核酸分子可具有3’或5’突出端，因此不需要或假设在其整个长度上完全为双链。核酸可透过生物学、生物化学或化学合成方法或本领域已知的任何方法获得，包括但不限于扩增方法和rna逆转录方法。术语核酸包括染色体或染色体片段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸露dna或rna聚合物、引物、探针、cdna、基因组dna、重组dna、crna、mrna、trna、微rna(mirna)或小干扰rna(sirna)。核酸可以为：例如，单链、双链或三链的，并且不限于任何特定长度。除非另有说明，否则除了明确指出的任何序列外，特定核酸序列包含或编码互补序列。本发明的另一方面为载体，其包含编码本发明第二方面的稳定mhc分子或其肽结合片段的核酸。此类载体可用于疫苗接种策略，其中需要在患者中表达疫苗。在此类情况下，载体可另外编码免疫反应(优选为t细胞反应)所需要的蛋白质或包含其片段的t细胞表位。以这种方式可以确定在包含载体的患者细胞中表达的mhc分子的肽结合袋负载有正确的肽。或者，mhc分子可以进行修饰以在融合蛋白中包含含有t细胞表位的肽。通常将肽藉由中介肽接头融合至mhc分子，以允许肽与mch分子的结合槽结合。在本发明背景中，术语“载体”系指编码目的蛋白质的多核苷酸或包含多肽和编码目的蛋白质的多核苷酸的混合物，其能够被引入细胞中或能够将蛋白质和/或其中包含的核酸引入细胞中。载体的实例包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。载体用于将目的基因产物(例如，外源或异源dna)引入宿主细胞。载体可能含有“复制子”多核苷酸序列，其有助于在宿主细胞中自主复制载体。外源dna定义为异源dna，其为宿主细胞中非天然存在的dna，例如，其复制载体分子、编码可选择的或可筛选的标志物或编码转基因。载体一旦进入宿主细胞，可以独立于宿主染色体dna或与宿主染色体dna同时复制，并且可以产生数个拷贝的载体及其插入的dna。此外，载体还可能含有必需的元件，其允许将插入的dna转录为mrna分子或以其他方式引起插入的dna复制为多拷贝的rna。载体可进一步包括调节目的基因表达的“表达控制序列”。表达控制序列通常为多肽或多核苷酸，诸如启动子、增强子、沉寂子、绝缘子或抑制子。在包含编码一种或多种目的基因产物的多种多核苷酸的载体中，所述表达可透过一种或多种表达控制序列一起或单独控制。更具体地，载体上包含的每种多核苷酸可透过单独的表达控制序列控制，或者载体上包含的所有多核苷酸可透过单一表达控制序列控制。单一载体上包含的由单一表达控制序列控制的多核苷酸可形成开放阅读框。一些表达载体额外含有与插入dna相邻的序列元件，其增加所表达mrna的半衰期和/或允许mrna转译为蛋白质分子。因此可以快速合成由插入dna编码的mrna和多肽的许多分子。此类载体可包含调节元件，诸如启动子、增强子、终止子等，以在受试者给药后引起或引导所述多肽的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和增强子实例包括sv40的早期启动子和增强子(mizukamit.etal.1987)、moloney小鼠白血病病毒的ltr启动子和增强子(kuwanayetal.1987)、免疫球蛋白h链的启动子(masonjoetal.1985)和增强子(gilliessdetal.1983)等。任何只要可以插入和表达编码人抗体c区的基因之用于动物细胞的表达载体皆可使用。合适的载体实例包括page107(miyajihetal.1990)、page103(mizukamitetal.1987)、phsg274(bradygetal.1984)、pkcr(o’hareketal.1981)、psg1βd2-4-(miyajihetal.1990)等。质粒的其他实例包括复制质粒(其包含复制起点)或整合质粒(例如puc、pcdna、pbr)。总之，本发明涉及以下项目。第1项。一种筛选tcr结合肽配体/mhc分子复合体的方法，其包括以下步骤：a)提供适当稳定的mhc分子，其中所述mhc分子在mhci的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和α2结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，并且在mhcii的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和β1结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，b)使所述适当稳定的mhc分子与其大量肽配体接触，以形成肽配体/mhc(pmhc)分子复合体，以及c)筛选所述pmhc分子复合体的tcr结合。第2项。根据第1项所述的方法，其中所述mhc分子为hla，或选自二聚体、三聚体和四聚体组成组的hla、mhci或mhcii的多聚体。第3项。根据第1或第2项所述的方法，其中氨基酸之间的所述至少一个人工引入的共价桥选自重组引入的二硫桥键、引入待交联的非天然氨基酸、引入光交联氨基酸和化学方式引入的交联。第4项。根据第1至第3项中任一项所述的方法，其中例如透过将mhci的第84位的酪氨酸和第139位的丙氨酸突变为半胱氨酸而在α-螺旋之间引入氨基酸之间的所述至少一个人工引入的共价桥。第5项。根据第1至第4项中任一项所述的方法，其中所述大量肽配体包含至少约1,500个不同的mhc结合肽，优选为至少约5,000个不同的mhc结合肽，更优选为至少约15,000个不同的mhc结合肽，最优选为含有至少约150,000个mhc结合肽的免疫肽组制剂。第6项。根据第1至第5项中任一项所述的方法，其中所述接触包括在约4℃至30℃(优选为约室温)下装载所述mhc结合肽。第7项。根据第1至第6项中任一项所述的方法，其中所述装载的hla/肽分子在约4℃下稳定时间超过约1天，优选为超过1周。第8项。根据第1至第7项中任一项所述的方法，其中与pmhc复合体结合的tcr的亲和力筛选灵敏度水平高于约kd1.0x10-9，优选为高于约kd1.0x10-6m，更优选为高于约kd1.0x10-3m。第9项。根据第1至第8项中任一项所述的方法，其中所述tcr选自天然tcr、可溶性tcr分子和tcr样分子，例如bstcr。第10项。根据第1至第9项中任一项所述的方法，其中tcr或mhc分子适当地固定于固体表面上，例如晶片、生物感测器、载玻片或珠上。第11项。根据第1至第10项中任一项所述的方法，其中所述tcr和/或mhc分子无标记/标志物。第12项。根据第1至第11项中任一项所述的方法，其中所述方法以高通量筛选形式进行。第13项。一种用于检测或产生tcr的特定氨基酸结合基序的方法，其包括进行根据第1至第12项中任一项所述的方法(包含预选tcr)以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述预选tcr的特定氨基酸结合基序。第14项。根据第13项所述的方法，其中所述肽配体/mhc分子复合体用于不同浓度的平行测定反应。第15项。根据第13或第14项所述的方法，其中，重复所述方法步骤，其包括由鉴定的所述预选tcr的修饰氨基酸结合基序组成的肽库。第16项。一种用于检测或确定tcr的交叉反应性的方法，其包括进行根据第15项所述的方法以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。第17项。一种用于检测或确定tcr的交叉反应性的方法，其包括进行根据第1至第12项中任一项所述的方法(包括预选tcr)以及确定和比较检测到tcr结合的所述肽配体/mhc分子复合体中那些肽配体的氨基酸序列的额外步骤，从而鉴定所述tcr的交叉反应性。第18项。根据第1至第17项中任一项所述的方法，其进一步包括测量t细胞激活的步骤，其包含tcr和与所述tcr结合的tcr结合肽配体/mhc分子复合体。第19项。一种用携带刺激框架的肽配体/mhc分子复合体激活和/或刺激和/或扩增细胞群(例如，特异性t细胞群)的方法，其中所述框架影响固定于载剂(例如，珠、丝、纳米颗粒或任何能够携带所述复合体的载剂)上的肽配体/mhc分子复合体，其中适当稳定的mhc复合体可固定于载剂上，并且在加入肽配体之前框架以此种状态储存较长时间，从而显著增加此类刺激框架在研究或临床实践中模拟抗原提呈细胞的实用性。第20项。一种包含适当稳定的mhc分子的药物组合物，其中，所述mhc分子在mhci的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和α2结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，并且在mhcii的情况下在所述稳定的mhc分子的α1结构域氨基酸和β1结构域氨基酸之间包含至少一个人工引入的共价桥，其中所述稳定的mhc分子与珠、丝、纳米颗粒或其他合适载剂结合。第21项。根据第20项所述的药物组合物，其进一步包含共刺激分子(例如：抗cd28抗体或抗41bb抗体)的一种或多种的组合和/或这些共刺激分子的时间序列。第22项。根据第20或第21项所述的药物组合物，其中所述稳定的mhc分子可在加入肽配体之前储存较长时间(例如，在室温或4℃下或-80℃以上储存)。第23项。根据第20至第22项中任一项所述的药物组合物在根据第1至第19项中任一项所述的方法中的用途。在实施例中将对本发明进一步进行说明，参照随附图表，但是无限制于此之意图。为了本发明之目的，所有引用的参考文献均以完整引用的形式并入本文。图列表图1显示了二硫键稳定的hla-a*02：01生产和用于亲和力测量的概述。(a)将重链和β2m的表达质粒转染至大肠杆菌且关注蛋白以包涵体表达。使用尺寸排阻法纯化hla单体。(b)空的二硫键修饰hla-a*02：01分子可透过在室温下孵育来装载肽配体。对于亲和力测量，将这些分子固定于功能化生物感测器上(例如，透过生物素链霉抗生物素蛋白相互作用)，并用于记录tcr或tcr样分子的结合和解离情况。图2显示了1g4tcr与不同mhc单体的结合和解离行为。原始数据用显示于图2(a)和2(b)，曲线拟合图显示于图2(c)和2(d)。所有测量均以1∶2分析物稀释系列进行，从24μm开始。(a)1g4tcr与固定的eso9vy84c/a139chla-a*02：01pmhc的结合曲线。(b)1g4tcr与固定的eso9vwt-a*02：01pmhc的结合曲线。(c)1g4tcr与固定的空y84c/a139chla-a*02∶01的结合曲线。(d)1g4tcr与固定的sl9y84c/a139chla-a*02：01pmhc的结合曲线。图3显示了sl9特异性bs-868z11-cd3bstcr与不同mhc单体和肽配体的亲和力。(a)bs-868z11-cd3与固定的sl9y84c/a139chla-a*02：01pmhc的结合曲线。原始数据显示于图3(a)和3(b)；曲线拟合图显示于图3(c)和3(d)。测量以1∶2分析物稀释系列进行，从500nm开始。(b)bs-868z11-cd3与固定的sl9wt-a*02：01pmhc的结合曲线。原始数据用黑色显示，曲线拟合图为红色。测量以1∶2分析物稀释系列进行，从500nm开始。(c)bs-868z11-cd3与固定的空y84c/a139chla-a*02：01的结合曲线。测量以1∶2分析物稀释系列进行，从500nm开始。(d)使用uv-交换产生的y84c/a139chla-a*02：01pmhc或wt-a*02：01pmhc复合体所测得的亲和力之间的相关性。对于使用两种方法产生并在连续实验期间测得的140种不同肽配体绘制了kd，曲线拟合良好。kd使用500nm和158nm分析物浓度拟合。r2是算得的相关系数，虚线表示最佳比率。图4显示了使用y84c/a139chla-a*02：01产生的突变氨基酸序列文库作为可溶性分析物和固定bstcr而产生的bs-868z11-cd3的结合基序。kd使用来自本发明人的至少一个和更多分析物浓度的曲线进行拟合，纳入的曲线至少有一个0.05nm的峰值信号。无可拟合曲线的位置指定kd为5x10-6m。使用分析物稀释系列测量，从500nm开始。(a)根据引入氨基酸和肽序列中交换位置的亲和力热图。白色方块表示野生型肽氨基酸。(b)结合基序视觉化为seq2logo图。个别字母的大小反向代表在此位置处对各个氨基酸测得的亲和力，使用倒数kd值除以108和pssm-logo演算法算得。(c)bs-868z11-cd3bstcr与装载alynvlakv(seqidn0：1)的y84c/a139chla-a*02：01pmhc的结合曲线。测量以分析物稀释系列进行，从500nm开始。图5显示了用肽装载靶细胞、jurkat效应细胞和六种不同浓度的bs-868z11-cd3共孵育测定的结果。(a)存在sl9野生型肽装载t2靶细胞的情况下，以不同浓度bs-868z11-cd3刺激的jurkat细胞高于背景的测得诱导倍数。(b)来自位点扫描文库中肽配体所测得的亲和力与诱导比背景发光增加3倍所需的最低bstcr浓度之间的相关性。肽根据野生型序列中交换位置被分为9个不同的组。(c)来自位点扫描文库中肽配体所测得的亲和力与其netmhc预测的pmhc结合等级之间的相关性。肽根据诱导比背景发光增加3倍所需的最低bstcr浓度被分为6个不同的组。(d)交叉反应性肽配体候选物所测得的亲和力与诱导比背景发光增加3倍所需的最低bstcr浓度之间的相关性。(e)存在alynvlakv(seqidno：1)肽装载t2靶细胞的情况下，以不同浓度bs-868z11-cd3刺激的jurkat细胞高于背景的测得诱导倍数。误差柱代表生物学三次重复。图6显示了y84c/a139chla-a*02：01或uv交换产生的wt-a*02：01pmhc复合体的比较，彼等作为对固定的bs-868z11-cd3之亲和力测量中的可溶性分析物。y84c/a139chla-a*02：01复合体(左)，wt-a*02：01复合体(右)。所有测量均使用1∶2分析物稀释系列进行，从500nm开始。图7显示与1g4复合的eso9vy84c/a139chla-a*02：01和eso9vwt-a*02：01的晶体结构。(a)wt和y84c/a139chla-a*02：01结构重叠，重点为肽和氨基酸侧链的方向。(b)f袋与α1和α2之间引入的二硫键的特写图片。(c)与肽和mhc骨架相互作用的1g4cdr环重叠。(d)两种晶体结构重叠的侧面视图。误差柱代表生物学三次重复。图8显示了使用y84c/a139chla-a*02：01产生的位置扫描文库作为可溶性分析物和固定bstcr而产生的bs-868z11-cd3的结合基序。测量使用四种可溶性分析物浓度进行。无可拟合曲线的位置指定kd为5x10-6m。可溶性分析物浓度范围由分析物稀释系列产生，以500nm开始。根据引入氨基酸和肽序列中交换位置的亲和力热图。图9显示了bstcrbs-868z11-cd3构建体的图解。868z11结构域基于slyntvatl反应性tcr868并在varela-rohena等人确定的cdr2β(yyeeee至yvrgee)和cdr3α区域(cavrtnsgyaln至cavrgahdyaln)中掺入增强亲和力的突变(8)。亲和力增强tcr的vβ和vα结构域透过单链接头(gsaddakkdaakkdgks)连接，并进一步用vα2区域中赋予表面稳定性的突变(f49s)进行修饰，以允许aggen等人所述的可溶性表达(22)。为了产生bs-868z11-cd3分子，此868z11sctv结构域透过含有两个半胱氨酸敲除物(c226s和c229s)的igg2衍生ch2铰链结构域(appvag)与人源化抗cd3抗体的f(ab’)重链部分融合，该两个半胱氨酸敲除物的掺入是为了防止在表达时形成f(ab’)2同型二聚体。图10显示了基于位置扫描文库选自slyntvatl的28种不同肽的uv交换效率和octet测量结果分析。(a)左轴：与25000ng/mluv敏感性pmhc单体进行uv交换后使用抗β2melisa法测定的pmhc浓度。虚线表示基于无肽uv交换的elisa/uv交换背景信号。误差柱代表技术三次重复。右轴：octetred384系统上可溶性pmhc分析物与固定bs-868z11-cd3的结合反应比。pmhc使用uv交换或透过y84c/a139chla-a*02：01肽负载制备。比率计算方法为：uv-a*02：01反应除以与类似负载抗f(ab)生物感测器结合60s后的y84c/a139chla-a*02：01反应。(b)含netmhc的四种肽的详细曲线拟合等级为15和更大。y84c/a139chla-a*02：01复合体(左)，wt-a*02：01复合体(右)。所有的测量均以1∶2分析物稀释系列进行，从500nm开始。图11显示了多种不同可溶性tcr和bstcrbs-868z11-cd3与未负载y84c/a139chla-a*02：01或负载不相关肽的y84c/a139chla-a*02：01结合情况。(a)三种不同hla-a*02：01限制性可溶性tcr以及bs-868z11-cd3与功能上空的y84c/a139chla-a*02：01结合情况。将y84c/a139chla-a*02：01固定至链霉抗生物素蛋白感测器上，各tcr以1mg/ml供应(可溶性tcr为20μm，bstcr为13.3μm)。(b)相同的tcr与负载不相关肽的y84c/a139chla-a*02：01结合情况。图12显示了在交换后和在4℃下储存2周后，y84c/a139chla-a*02：01slyntvatlpmhc与固定bs-868z11-cd3的octet亲和力测量。两次测量均使用1∶2分析物稀释系列(从277.8nm开始)进行。图13显示了各种hla等位基因和一个鼠等位基因的多序列比对。在序列比对中，突出显示引入稳定氨基酸取代的区域。此比对为技术人员提供了在每个给定hla等位基因中确定待取代的氨基酸以稳定mhc分子的基础。图14显示了sl9特异性bs-868z11-cd3bstcr对采用不同二硫化物修饰hla-a*02：01复合体产生的sl9pmhc的亲和力。结合曲线显示了bs-868z11-cd3对固定的sl9pmhc的结合和解离情况。测量以1∶2分析物稀释系列(从500nm开始)进行。bs-868z11-cd3bstcr对固定sl9wt-hla*02：01pmhc的结合曲线(左上图)。bs-868z11-cd3bstcr对固定sl9y84c/a139chla*02：01pmhc的结合曲线(右上图)。bs-868z11-cd3bstcr对固定sl9f22c/s71chla*02：01的结合曲线(左下图)。bs-868z11-cd3bstcr对固定sl9f22c/s71cw51c/g175chla-a*02：01pmhc的结合曲线(右下图)。图15显示了高亲和力tcr对不同pmhc复合体的kd值。在每种情况下，wt-a*02：01分子的kd均显示于x轴上，两个不同的二硫化物修饰hla-a*02：01mhc分子的kd显示于y轴上，每个点表示mhc分子中负载的一个不同肽。seqidno1至5和16至325显示了以下实施例中使用的肽序列。实施例1.肽合成使用标准fmoc化学和syroii肽合成仪在内部生成所有肽。肽随后使用hplc分析，平均纯度为74％。紫外光敏感肽含有一个具有2-硝基苯基氨基酸残基的光敏结构单元。二肽gm采购自bachem。使用前，肽在dmso(sigma，cat.nr.41640)、0.5％tfa(sigma，cat.nr.t6508)中溶解，浓度为2mg/ml至10mg/ml，取决于所需的用例。2.透过重折叠和纯化产生mhc复合体含有c末端bira信号序列的重组hla-a*02：01野生型(wt-a*02：01，seqidno：322)或二硫键修饰的hla-a*02：01重链和人β2m轻链在大肠杆菌中作为包涵体产生并如前所述纯化(2)。如前所述但稍加修改以进行hla-a*02：01复合体重折叠反应(sainietal2013)。简言之，wt-a*02：01或二硫键修饰的hla-a*02：01重链、β2m轻链和肽用重折叠缓冲液(100mmtris·clph8、0.5m精氨酸、2mmedta、0.5mm氧化谷胱甘肽、5mm还原型谷胱甘肽)稀释，并在4℃下搅拌孵育2至8天，然后浓缩。使用hiload26/600200pg柱(gehealthcare)，在系统(gehealthcare)上，透过尺寸排阻色谱(sec)在20mmtris-hcl、ph8/150mmnacl中纯化浓缩的蛋白质。峰组分直接浓缩为2000μg/ml，等分并在-80℃下冷冻或透过bira生物素-蛋白质连接酶(avidity)根据制造商的说明在4℃下生物素化过夜并进行第二次凝胶过滤，之后终浓度至2000μg/ml、等分并在-80℃下储存。为了产生hla-a*02：01野生型肽-mhc复合体，将9mer(全长)肽或紫外线光敏感的9mer肽(全长)添加至浓度为30μm的重折叠缓冲液中。为了产生空的y84c/a139chla-a*02：01(seqidno：323)复合体，将二肽gm添加至浓度为10mm的重折叠缓冲液中。为了产生f22c/s71chla-a*02：01(seqidno：324)复合体，未向重折叠缓冲液中加入肽。为了产生f22c/s71cw51c/g175chla-a*02：01(seqidno：325)复合体，未向重折叠缓冲液中加入肽。下面的表1显示了不同二硫化物修饰hla-a*02：01分子和wt-a*02：01分子的重折叠方法：表1：+：蛋白质可重折叠；-蛋白质不可重叠。3.使用紫外线介导的肽配体交换或空二硫键修饰的hla-a*02：01分子生成肽交换的hla-a*02：01pmhc复合体按如前所述进行紫外线光可切割肽的肽交换反应。简言之，将所需的九聚体肽与生物素化的uv光敏感pmhc复合体以100∶1的摩尔比混合，并在366nmuv光下照射至少30分钟(camag)。透过向所述单体溶液加入和混合至少100∶1摩尔比的所需肽并在室温下孵育5分钟来进行空二硫键修饰的hla-a*02：01复合体的肽装载反应。4.可溶性tcr的生产按如前所述生产可溶性tcr(20)。简言之，tcrα和tcrβ链构建体在大肠杆菌中单独作为包涵体表达并纯化。tcrα链透过用半胱氨酸取代苏氨酸在第48位置突变，tcrβ链透过用半胱氨酸取代丝氨酸在第57位置突变以形成链间二硫键。5.bstcr的设计和生产透过将sctv868z11连接至人源化抗cd3抗体的f(ab’)-结构域的c末端产生bs-868z11-cd3分子(22，23)。为此，sctv的vβ结构域与衍生自人igg2(appvag，seqidno：2)的上部ch2区域直接融合。铰链内的半胱氨酸敲除物c226s和c229s阻止f(ab)2分子形成。编码上述构建体或人源化抗cd3抗体轻链的hcmv驱动表达载体在expicho细胞(thermo)中被暂态共转染。12天后，透过串联色谱法处理上清液(蛋白质l，然后用制备型尺寸排阻法，gebiosciences)，并在pbs中配制高纯度单体bstcr。6.基于octetred的生物层干涉测量法动力学亲和力测量使用动力学或稳态结合分析法在octetred384系统(pallfortébio)上测量stcr或bstcr分子对不同pmhc复合体的亲和力。如果无另外说明，所有分析物或配体在动力学缓冲液(pbs，0.1％bsa，0.05％tween20)中稀释至最终浓度。在使用前，在动力学缓冲液中水合所有生物感测器至少10分钟。在384倾斜孔板(pallfortébio)中进行装载和测量，在3mm感测器偏移下至少为40μl。板温度设定为25℃，振荡器速度设定为1000rpm。为了允许步骤间校正，在同一孔中进行了结合前基线阶段和随后的解离阶段。使用动力学缓冲液作为解离缓冲液，如需要，添加适当浓度的dmso以匹配分析物组成。在pmhc固定化的情况下，使用浸渍和读取链霉抗生物素蛋白(sa；pallfortébiocat.nr.18-5021)生物感测器固定25μg/ml假定浓度的生物素化pmhc单体60秒，接着如无另外说明为60秒基线、60秒结合和60秒解离阶。在bstcr固定化的情况下，使用浸渍和读取抗人fab-ch1第2代(fab2g；pallfortébiocat.nr.18-5127)生物感测器固定100μg/ml浓度的bstcr分子60秒，接着如无另外说明为15秒基线、60秒结合和60秒解离阶段。透过将装载的生物感测器在10mm甘氨酸phi.5和动力学缓冲液中连续孵育各5秒共3次，把fab2g生物感测器再生最多4次。在首次配体固定之前，也以这种方式预处理fab2g。使用octetred软件“dataanalysisht”10.0.3.7版(pallfortébio)分析所有传感图。将数据对齐至基线步骤末端以使原始感测器数据在y轴处对齐，并使用步骤间校正将解离的开端与结合阶段的末端对齐。未应用savitzky-golay过滤。然后使用1∶1langmuir动力学结合模型拟合所得的传感图。7.细胞系表达tap缺陷型hla-a*02：01的细胞系t2购自atcc(crl-1992)，并在补充有10％热灭活fcs(lifetechnologies，cat.nr.10270106)和抗生素青霉素和链霉素(biozym，cat.nr.882082，各100μgml-1)的rpmi培养基1640glutamaxtm(thermofisher，cat.nr.61870010)中培养，如果需要，培养至第16代。gloresponsetmnfat-luc2jurkat细胞系购自promega(cat.nr.cs1764)，为第6代，并在补充有10％热灭活fcs(lifetechnologies，cat.nr.10270106)、1％丙酮酸钠(ccpro，cat.nr.z-20m)和抗生素潮霉素b(merckmillipore，cat.nr.400052，200μg/ml)、青霉素和链霉素(biozym，cat.nr.882082，各100μg/ml)的rpmi培养基1640glutamaxtm(thermofisher，cat.nr.61870010)中培养，如果需要，培养至第14代。8.t细胞激活测定使用gloresponsetmnfat-luc2jurkat细胞和肽装载t2靶细胞的t细胞激活测定根据制造商的说明进行。简言之，从连续细胞培养物中收获t2细胞，洗涤并以浓度3.3x106个细胞/ml重悬在t2培养基中，之后转移至96孔圆底板(corningcat.nr.3799)。添加溶解于dmso、0.5％tfa的肽使最终浓度为100nm，并将悬浮液在37℃、5％co2下孵育2至3个小时。在pbs中配制的bstcr在t2培养基中稀释至所需浓度，并将25μl稀释液各自分配至白色96孔平底板中(brand，cat.nr.781965)。从连续细胞培养物中收获gloresponsetmnfat-luc2jurkat细胞，洗涤并以浓度3.0x106个细胞/ml重悬在t2培养基中，之后将25μl细胞悬浮液分配至含有bstcr稀释液的白色96孔平底板中。在肽装载后，重悬t2细胞，并将25μl分配至含有bstcr稀释液和gloresponsetmnfat-luc2jurkat细胞的白色96孔平底板中，使最终效应子与靶标比率为1∶1(各75,000个细胞)。将完全组装的板在平板振荡器上在300rpm下混合5分钟，之后在37℃、5％co2下孵育18至20个小时。孵育期后，向各孔中加入75μl的bio-glotm萤光素酶试剂，将板在避光下在平板振荡器上以300rpm孵育数分钟，然后用synergy2平板读数器(biotek)以0.5秒积分时间读取发光数值。以相对光单位(rlu)测得的发光数值透过将测得的rlu除以对照孔的rlu而转换为各孔的诱导倍数。9.结晶和成像浓缩y84c/a139chla-a*02：01-sllmwitqv复合体和1g4tcr并以1∶1的比例混合，以达到用于结晶的7mg/ml浓度。坐滴蒸气扩散实验在含有0.1m乙酸铵、0.1mbis-tris(ph5.5)和17％聚乙二醇(peg)10,000的母液存在的情况下产生晶体。单晶被转移至含有0.1m乙酸铵、0.1mbis-tris(ph5.5)、20％(w/v)peg10,000和10％甘油的冷冻保护剂溶液中。在含有一个eiger16m检测器的德国电子同步加速器(deutscheelektronen-synchrotron)上以emblp14光束线在100k安装和低温冷却晶体。收集x射线数据集，解析度为(表2)。表2：数据收集和改进统计1g4/y84c/a139chla-a*02：01/sllmwitqv数据用xds处理并用aimless进行缩放(35，36)。分子置换使用molrep进行，首先以天然复合体的tcr部分为座标，然后以pmhc[蛋白质数据库(pdb)2bnr]为座标，并用refmac5改进结构(37，38)。改造的二硫键用coot手动建立(39)。结构改进至r因子为22.9％(rfree为27.3％)。使用molprobity验证几何形状，显示93.9％的残基位于ramachandran图的允许区域内[不允许的区域内有一个甘氨酸残基(gly143)](40)。10.潜在交叉反应性肽配体基于基序的鉴定使用ncbi人蛋白质数据库对搜索基序允许的与潜在组合之一匹配的九聚体肽配体进行搜索。此数据库涵盖了所有非冗余的genbankcds转译以及来自pdb、swissprot、pir和prf的记录，但不包括来自全基因组鸟枪专案的环境样本。此数据库直接从ncbi伺服器获得。11.seq2logo的生成视觉化结合基序的seq2log透过获取相应相互作用测得的kd值的倒数值并除以108来创建。这些值以位置特异性评分矩阵档的形式聚集并使用丹麦技术大学生物资讯学系的seq2logo线上资源上的pssm-logo类型进行处理(27)。12.透过萤光各向异性测得的肽结合情况肽结合用萤光各向异性测定法评估，使用300nm纯化重折叠y84c/a139chla-a*02：01。将100nm萤光标记的高亲和力肽nlvpkfitcvatv(genecast)加入到折叠y84c/a139chla-a*02：01中，用tecaninfinitem1000pro(tecan，crailsheim，德国)多模式板读数器测量各向异性而进行动力学测量(fitcλex＝494nm、λem＝517nm)。y84c/a139chla-a*02：01在重折叠后直接使用或在-80℃下在储存缓冲液(10％甘油，50mmtris-hcl，ph8.0)中保存指定的时间长度，然后进行测量。动力学测量在室温(22-24℃)下于50mmhepes缓冲液(ph7.5)中进行。数据使用graphpadprismv7绘制。13.抗β-2微球蛋白elisa将pbs中终浓度为2g/ml的链霉抗生物素蛋白(molecularprobes，cat.nr.s888)加入nuncmaxisorp板(thermofisher，cat.nr.439454)，将密封板在潮湿的环境中于室温下孵育过夜。次日，应用elx405洗板机(biotek)用洗涤缓冲液(pbs，0.05％tween-20)洗涤板4次。向每个孔中加入300μl封闭缓冲液(含有2％bsa的pbs)，将密封板在37℃下孵育1小时。弃置封闭缓冲液，接着加入100μl的1∶100各别uv交换pmhc制剂于封闭缓冲液中之稀释液。每个板上含有基于常规重折叠pmhc单体的500ng/ml至15.6ng/ml的标准系列。用300μl封闭缓冲液填充边缘孔以减少边缘效应，将密封板在37℃下孵育1小时。板再洗涤4次，然后向每个孔中加入终浓度为1μg/ml的100μl抗-β2微球蛋白hrp缀合二抗(acris，cat.nr.r1065hrp)。密封板在37℃下孵育1小时。用洗涤缓冲液再洗涤板4次，然后向每个孔中加入100μl室温tmb底物(sigma，cat.nr.t0440)。室温下孵育板5分钟，然后透过向每个孔中加入50μl的1nh2so4而终止。透过使用synergy2读板器读取450nm处的吸光度5秒来立即进行板分析。使用synergy2软件基于标准曲线拟合(log(y)＝a*log(x)+b)计算pmhc浓度。数据使用graphpadprismv7绘制。14.流式细胞术t2肽结合测定表达tap缺陷型hla-a*02：01的细胞系t2购自atcc(crl-1992)，并在补充有10％热灭活fcs(lifetechnologies，cat.nr.10270106)和抗生素青霉素和链霉素(biozym，cat.nr.882082，各100μg/ml)的rpmi培养基1640glutamaxtm(thermofisher，cat.nr.61870010)中培养，如果需要，培养至第16代。从连续细胞培养物中收获t2细胞，洗涤并在t2培养基中以浓度3.3x106个细胞/ml重悬，之后转移至96孔圆底板(corningcat.nr.3799)。添加溶解于dmso、0.5％tfa的肽使最终浓度为10μm，并将悬浮液在37℃、5％co2下孵育2个小时。用pfea(pbs、2％fcs、2mmedta、0.01％叠氮化钠)洗涤板两次，然后每孔加入50μl用pfea稀释1∶250至终浓度为0.8μg/ml的pe标记的抗人hla-a2(biolegend，cat.nr.343305)。在4℃下孵育板30分钟，然后用pfea洗涤两次。最后，将细胞重悬于固定溶液(pfea、1％甲醛)中并保持于4℃下，然后使用iquescreener(intellicyt)进行分析。基于fsc-a/ssc-a信号门控t2细胞，使用fsc-h/fsc-a双联体排除法除去双联体。pe通道正向门控座标基于未染色的对照物。数据使用graphpadprismv7绘制。15.序列比对多序列比对透过使用clustalomega多序列比对法(www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)(madeiraetal.“theembl-ebisearchandsequenceanalysistoolsapisin2019”，nucleicacidsresearch，47：w636-w641，2019，doi：10.1093/nar/gkz268)进行。16.统计分析使用第7版graphpadprism软件绘制所有数据。透过计算pearson相关系数计算x和y数据集之间的相关性，并使用第7版graphpadprism软件将其报告为r2。用于生物层干涉测量法结合动力学测量值的曲线拟合的r2和x2值使用octetred384系统软件第10.0.3.7版本dataanalysisht进行计算。17.二硫键稳定的空hla-a*02：01分子的设计和生产空的和肽装载的mhci类分子的分子动力学模拟表明，前者在容纳肽配体c末端的f袋中移动性增加(16)。在之前使用鼠mhci类分子h-2kb的研究中，透过将第84位的酪氨酸和第139位的丙氨酸突变为半胱氨酸而在f-袋中的相对残基之间引入二硫键能够稳定所述复合体。突变体可在没有全长肽的情况下重折叠，并且能够进行追溯性肽结合(17，18)。本发明人假设相同的概念可应用在人mhci类分子hla-a*02：01上。致使第84位酪氨酸和第139位丙氨酸突变为半胱氨酸的修饰引入hla-a*02：01重链表达质粒。重链在大肠杆菌中作为包涵体产生后，用类似产生的β2m一起孵育，但在重折叠缓冲液中不含肽。在尺寸排阻色谱(sec)法分析后，与用9mer肽重折叠的野生型对照物相比，未观察到hla-a*02：01结合的单体组分。在第二种方法中，二肽gm被添加至重折叠中：此二肽对mhci类复合体的亲和力非常低，可协助重折叠(19)。sec期间，所述二肽透过运行缓冲液的缓冲液交换而快速从结合袋中解离，从而产生纯化的空二硫化物稳定y84c/a139chla-a*02：01。空的野生型a*02：01复合体(wt-a*02：01)不能以相同的方式产生。wt-a*02：01复合体可以用二肽产生，但当试图透过缓冲液交换除去二肽时，产生变性。本发明人还引入了修饰，使第22位的苯丙氨酸和第71位的丝氨酸在hla-a*02：01重链表达质粒中突变为半胱氨酸。重链在大肠杆菌中作为包涵体产生后，用类似产生的β2m一起孵育，但在重折叠缓冲液中不含肽。sec产生纯化的空二硫键稳定f22c/s71chla-a*02：01复合体。本发明人还引入了修饰，使第22位的苯丙氨酸和第71位的丝氨酸以及第51位的色氨酸和第175位的甘氨酸在hla-a*02：01重链表达质粒中突变为半胱氨酸。重链在大肠杆菌中作为包涵体产生后，用类似产生的β2m一起孵育，但在重折叠缓冲液中不含肽。sec产生纯化的空二硫键稳定f22c/s71cw51c/g175chla-a*02：01复合体。透过缓冲液交换的热稳定性分析可显示纯化单体中不存在二肽gm：空y84c/a139chla-a*02：01分子的温度稳定性低于(即，熔化温度较低)仍与二肽gm复合的相同分子(41)。所得的分子在4℃下过夜生物素化，并透过第二次sec运行从过量的生物素分离，或在使用前直接储存于-80℃下。18.使用可溶性tcr和野生型或二硫化物修饰的mhc进行的肽装载和亲和力测量接下来，本发明人确定了空二硫键修饰的hla-a*02：01分子是否能够形成肽-mhc复合体和与tcr配体结合。使用重折叠tcr1g4作为可溶性分析物，透过生物层干涉测量法(bli)在octetred384上进行亲和力测量。此tcr识别源自癌症睾丸抗原ny-eso-1的hla-a*02：01特异性肽sllmwitqc(es09c，seqidno：3)或其合成变体sllmwitqv(eso9v，seqidno：4)(20，21)。生物素化y84c/a139chla-a*02：01在其空的状态下直接固定，或用肽es09v短暂孵育后固定在链霉抗生物素蛋白包覆的生物感测器上(图1b)。肽孵育5分钟(组装后启动亲和力测量所需的最短时间)或更长时间之间未检测到任何差异。进一步分析表明，当使用高浓度肽时，确实在一至两分钟内达到完全交换。在多个1g4浓度下测量动力学，并且用eso9v直接重折叠的野生型hla-a*02：01作为对照。1g4tcr与y84c/a139chla-a*02：019v或wt-a*02：01eso9v的结合在传感图和曲线拟合产生的kd方面非常相似(图2a和2b)。在高浓度1g4下，可检测到空固定单体的弱结合信号(但无解离)(图2c)。透过随后添加1g4无法识别的肽如：slyntvatl(图2d，seqidno：5)可以阻止这种结合。空y84c/a139chla-a*02：01获得的弱信号可透过tcr与空结合袋的非特异性相互作用来解释，这是tcr在体内通常不会遇到的一种状态。具有不同特异性的其他a*02：01限制性可溶性tcr表现相似，表明其不与不相关负载的y84c/a139chla-a*02：01pmhc结合但与功能性空分子结合，尽管反应相对较低(图11)。19.二硫键修饰的hla-a*02：01和wt-a*02：01对亲和力成熟型tcr的亲和力测量值之间的相关性本发明人已确立了y84c/a139chla-a*02：01分子作为未修饰tcr的wt-a*02：01配体等效物的可用性，希望将此分析扩展至突变的高亲和力tcr和更多数量的肽配体。本发明人使用了成熟单链tcr(sctv)868z11，这是tcr的一种亲和力成熟变体，其可识别hivp17gag衍生的hla-a*02∶01限制性肽slyntvatl(sl9，seqidno：5)(8，22)。本发明人透过在链霉抗生物素蛋白生物感测器上固定空的或sl9肽负载二硫化物修饰的hla-a*02：01分子进行亲和力测量，并测量了可溶性bs-868z11-cd3(是与人源化抗cd3抗体融合后表达的一种868z11sctv的bstcr变体)(图9)(23)。使用y84c/a139chla-a*02∶01、f22c/s71chla-a*02：01或f22c/s71cw51c/g175chla-a*02：01之sl9二硫化物修饰hla-a*02：01pmhc复合体的结合亲和力类似于透过进行uv光介导肽配体交换而产生的sl9wt-a*02：01pmhc(25)，分别为2.35nm和3.24nm(图3a，亦见图14)。对于此bstcr，空mhc分子的结合不可测量(图3c)，在13.3μm的高摩尔浓度下不相关负载y84c/a139chla-a*02：01复合体的结合不可测量。接下来，本发明人基于sl9肽序列分析了bs-868z11-cd3位点扫描文库的结合亲和力。此文库的创建方法为：将野生型sl9肽一个位置上的氨基酸与剩余的18个蛋白质氨基酸进行交换，同时维持所有其他位置，当在九聚体的所有位置执行时产生162个不同的肽(半胱氨酸由于其二聚化倾向而被排除)(24)。本发明人如之前一样透过添加至y84c/a139chla-a*02：01分子或透过进行uv-光介导的肽配体交换而产生pmhc复合体，所述技术用于产生pmhc复合体(25)。各自的pmhc复合体固定于链霉抗生物素蛋白上，并在两种不同的bs-868z11-cd3浓度下测量动力学。如预期的一样，使用交替肽配体产生了广泛的不同kd，范围为在所选择设置的灵敏度极限内不可检测至与未修饰sl9肽的相互作用相当或什至更强。为了直接比较，选择在两个分析物浓度下具有可评估信号和曲线拟合的r2值至少为0.9的所有测量的pmhc复合体，代表信号在选定kd灵敏度范围内。当对彼此作图时，所得的140个肽配体的kd值在整个亲和力范围内非常相似，相关系数值高支持了这一发现(图3d)。超过90％的pmhc对的差异在2倍范围内，而差异最大为6.82倍。在变化高于2倍的组中，可观察到y84c/a139chla-a*02：01分子测量值的解离常数较大的趋势。对于来自位置扫描文库的140种不同肽配体，由所报告rmax值表达的每个生物感测器上固定的功能性pmhc量在野生型和二硫化物稳定pmhc均相当(相关系数r2＝0.9459)。图15显示了高亲和力tcr对不同pmhc复合体的kd值。在每种情况下，wt-a*02：01分子或y84c/a139chla-a*02：01分子的kd显示于x轴上，两个不同的二硫化物修饰hla-a*02：01mhc分子的kd显示于y轴上，每个点表示mhc分子中负载的一个不同肽。图15中的每个方块表示以下肽：a：hiv-005wt(slyntvatl，seqidno：5)在左上图中，wt-a*02：01pmhc复合体的每个上述肽的kd相对于二硫化物修饰f22c/s71chla-a*02：01pmhc复合体的kd进行作图。对于每种在研肽，二硫化物修饰f22c/s71chla-a*02：01pmhc复合体显示与wt-a*02：01pmhc复合体的kd值几乎相同。在左下图中，wt-a*02：01pmhc复合体的每个上述肽的kd相对于二硫化物修饰f22c/s71cw51c/g175chla-a*02：01pmhc复合体的kd进行作图，并且显示与每种在研肽的wt-a*02：01pmhc复合体的kd值也几乎相同。在右上图中，y84c/a139chla-a*02：01pmhc复合体的每个上述肽的kd相对于二硫化物修饰f22c/s71chla-a*02：01pmhc复合体的kd进行作图。在右下图中，y84c/a139chla-a*02：01pmhc复合体的每个上述肽的kd相对于二硫化物修饰f22c/s71cw51c/g175chla-a*02：01pmhc复合体的kd进行作图。对于每种在研肽，f22c/s71c和f22c/s71cw51c/g175c突变体的二硫化物修饰pmhc复合体与y84c/a139chla-a*02：01pmhc的kd值几乎相同。因此，可以得出结论：负载不同肽并形成pmhc复合体的二硫化物修饰hla-a*02：01分子与wthla-a*02：01pmhc复合体可相比地透过各自亲和力成熟tcr识别。因此，负载肽的二硫化物修饰hla-a*02：01分子(pmhc复合体)的功能不受hla-a*02：01分子中所引入之稳定氨基酸突变的影响。图15中显示的结果使技术人员相信：负载肽配体并形成二硫化物修饰pmhc复合体的根据本发明的二硫化物修饰hla-a*02：01分子在与其各自tcr结合时可引发t细胞反应。20.用于结合基序生成的高通量动力学筛选快速灵活地生成pmhc有助于收集多种不同pmhc的结合亲和力大数据集。此类数据集的一个实例是筛选位置扫描文库以产生pmhc-bstcr结合基序，其可以作为bstcr安全性筛选方法中的一个组成部分。为了进行此类测量，理想的情况是，所述pmhc应用作可溶性分析物，因为这可提供多种优势。首先，重复固定具有已知活性的相同配体(例如，bstcr)可更好地解读拟合结果，尤其是所报告的rmax值。其次，由于存在能够可逆地固定双特异性tcr构建体的多种可再生生物感测器，因此，使用pmhc复合体作为可溶性分析物来替代固定对于快速且具有成本效益的高通量筛选为优选。这些生物感测器通常包覆有抗体，可用于动力学测量至少20次而不会降低读数品质。第三，当bstcr或抗体具有多个pmhc结合部分时，固定bstcr是可用于测量单价亲和力的唯一方向，因为若是固定pmhc，则仅可测量亲合力。虽然uv介导的肽配体交换可产生大量不同的pmhc复合体，但是交换效率根据肽及其与相应mhci类等位基因结合的亲和力而变化，这导致样本的pmhc浓度不同(图10)。这种不确定性对于用作可溶性分析物的pmhc的亲和力测量是一个问题，因为需要精确知道浓度才能确定准确的亲和力。由于二硫键稳定的y84c/a139chla-a*02：01突变体在没有任何肽的情况下是稳定的，因此，此限制不适用。如果以足够高的浓度加入肽以使空的mhc复合体饱和，则知道pmhc的有效浓度，这可显著提高测量的准确性并避免假阴性结果。这种行为的实例可在位置扫描库中可检测到这种行为的实例，与使用y84c/a139chla-a*02：01肽负载相比，当使用uv交换制剂时，这可导致拟合数据差和亲和力计算错误(图5、6、10)(26)。准确测量bstcr对此类肽的亲和力对于产生结合基序可能很重要，因为当与其他位置的取代组合时，这些取代可导致相关的mhc结合物。因此，应在全面的结合基序中正确反映bstcr对氨基酸的耐受性。透过固定bs-868z11-cd3bstcr，本发明人能够在无人值守的测量时间的4小时内以降低20倍的价格标签分析每种肽配体在四种不同可溶性pmhc浓度下的位点扫描文库，范围为500至15.8nm。达到至少0.05nm信号水平的所有曲线均纳入拟合中，从而产生全面的tcr结合基序(图4a、8，表3)。表3：bs-868z11-cd3对sv9肽slyntvatl(seqidno：5)和来自位置扫描文库的肽(seqidno∶16-177)的结合亲和力。表中包括使用fortébiodataanalysisht10.0.3.7软件按1∶1langmuir结合模型透过曲线拟合确定的kd、kon和koff值。根据模型报告了各自的误差以及拟合的准确性。报告为“无拟合”的肽在任何浓度下均无至少达到0.05nm峰值信号的可评估曲线。表4：根据使用位置扫描文库测得的亲和力的bs-868z11-cd3交叉反应性肽配体搜索基序。相应亲和力至50nm以上的所有氨基酸。可溶性y84c/a139chla-a*02：01pmhc制剂可在4℃下储存至少2周而不会降低品质并可用于多次分析(图12；第1天：kd＝1.35e-09m，r2＝0.9992；第14天：kd＝1.08e-09m，r2＝0.9991)。868z11tcr显示预期的识别模式：第3至第7位置氨基酸的变化对bstcr结合亲和力的影响最大。有趣的是，与野生型肽的相互作用相比，仅有一个氨基酸变化导致bs-868z11-cd3的结合亲和力增加，这表明tcr在其亲和力成熟状态下对靶标具有明显的亲和力。当将结合基序视觉化为seq2logo图(图4b)时，也可以图形方式说明这种行为(27)。21.与bs-868z11-cd3交叉反应的肽配体的鉴定本发明人欲进一步探索他们是否能够使用产生的结合基序来鉴定来自人基因组的交叉反应性肽配体。本发明人透过引入50nm的代表性kd阈值根据亲和数据集创建了肽配体搜索基序：从所述基序中排除所有增加bs-868z11-cd3kd高于此阈值的单个氨基酸取代(图4)。根据此基序，本发明人在ncbi人非冗余蛋白质序列数据库中进行了搜索，以寻找与基序允许的组合相匹配的九聚体序列。所述搜索在人基因组内鉴定了超过400个命中，与野生型序列slyntvatl具有1至6个相同位置的序列同一性。选择140个肽、取样代表较大组中的序列同一性分布、合成并用于亲和力测量(表5；seqidnos：178-317)。本发明人能够检测到，这些肽中有91个具有单位数μmkd或更高的结合亲和力。表5：bs-868z11-cd3对基于bs-868z11-cd3结合基序确定的选定肽配体的结合亲和力。报告根据ncbi数据库的肽序列和相关基因，并按照kds降幂排列肽。表中包括使用fortébiodataanalysisht10.0.3.7软件按1∶1langmuir结合模型透过曲线拟合确定的kd、kon和koff值。根据模型报告了各自的误差以及拟合的准确性。报告为“无拟合”的肽在任何浓度下均无至少达到0.05nm峰值信号的可评估曲线。其中之一为alynvlakv(seqidn0：1)，值得特别注意。将其选择为理论肽，但根据免疫肽组数据库另外在组织样本和细胞系中发现。此数据库合并了基于lc-ms分析的定量hla肽组学以及健康组织和肿瘤组织rnaseq提供的定量转录组学数据，以鉴定仅在肿瘤组织上或主要在肿瘤组织上提呈的肽(28，29)。alynvlakv是来自中间丝家族孤稀1或2(iff01/2)蛋白的抗原，在多种健康组织和肿瘤组织(从头颈部、脾脏或肾脏至非小细胞肺癌或肾细胞癌)样本中检测到。所测得的pmhc-bstcr结合亲和力为65.9nm的kd(图4c)。本发明人能够鉴定第二种lc-ms检测的肽ktfnlipav(seqidno：226)，在三种肿瘤组织样本上检测到的kd较低，为413nm。22.bstcr亲和力与t细胞激活的相关性可使用此高通量筛选平台测量pmhc-bstcr结合亲和力，但应与体外活性一致，这是因为功能性t细胞参与bstcr甚至更有用。通常来说，靶细胞和效应细胞的体外共孵育结果与适当的读数相结合可用于表征这些构建体。gloresponsetmnfat-luc2jurkat效应细胞(一种表达由nfat反应元件驱动的萤光素酶报告子基因的细胞系)以及肽装载t2靶细胞(一种tap缺陷型a*02：01细胞系，其透过外源性肽装载可恢复pmhc提呈)在存在bs-868z11-cd3的情况下孵育，以证实在此背景下动力学筛选的意义。将t2细胞分别装载浓度100nm的来自位点扫描文库的各别肽，随后用jurkat细胞和不同的bstcr浓度共孵育18小时，然后进行读数。如所预期的一样，本发明人遇到了广泛的结果，范围从在任何bstcr浓度下无检测到t细胞激活到从低浓度开始出现例如对野生型肽的强烈反应(图5a)。由于对于选定bstcr浓度范围内的许多相互作用无法测定ec50值，因此，本发明人透过t细胞激活的启动对个别肽进行分类，定义为能够诱导上述信号增加3倍的最低bstcr浓度。将起始值对分别测得的kd作图(图5b)。总体来说，本发明人检测到测定的kd值和t细胞激活之间存在良好的相关性，其中一组明显离群值具有强pmhc-bstcr结合亲和力，但是t细胞激活起始延迟或完全无激活。本发明人能够鉴定这些肽与其netmhc预测的对mhc的结合强度之间存在直接关联(图5c)(26)。这提供了潜在的解释，因为不同肽结合亲和力可在外源负载后在靶细胞上形成不同提呈水平的各pmhc。这些水平接着可能影响pmhc-bstcr复合体的数量，及最终jurkat效应子(t细胞)的激活。为了证实假设，本发明人使用抗hla-a2抗体进行了流式细胞术t2肽结合测定，对于较低结合亲和力的肽，在肽负载后，可检测出hla-a2表面水平升高较少，尤其是netmhc等级为2及以上，这支持了最初的假设。netmhc等级0.05和2之间的肽配体之pmhc-bstcr结合亲和力与t细胞激活起始具有很好的相关性，而高于此阈值时，t细胞激活随着netmhc等级进一步增加而降低，且与pmhc-bstcr结合亲和力多半无关。本发明人还对透过结合基序搜索选择的140个肽配体进行了t细胞激活测定，其中24个能够在至少一个提供的bstcr浓度下诱导3倍背景值的t细胞激活(图5d)。测得的kd与t细胞激活起始具有相关性，类似于透过位点扫描文库获得的结果。先前强调的iffo1抗原alynvlakv(seqidno：1)在报告子测定中也具有反应性(图5e)。发明人的结果显示pmhc-bstcr结合亲和力是与抗cd3t细胞衔接器(anti-cd3tcellengager)耦合的sctv868z11体外功能的良好指标。这强调了pmhc-bstcr结合动力学筛选平台的价值，因为它可使得在这些分子的开发早期快速而又充分地表征bstcr。23.1g4y84c/a139chla-a*02：01：01eso9vtcr-pmhc的晶体结构为了进一步证实1g4tcr识别eso9vy84c/a139chla-a*02：01与eso9vwt-a*02：01为没有区别的，将tcr和eso9v重折叠的二硫化物稳定mhc进行共结晶(如之前野生型eso9vhla-a*02：01分子所报告的一样)并透过x射线晶体学进行分析(表2)(21)。晶体结构的比较显示两种复合体的结构高度重叠。hla-a*02：01分子的骨架几乎完美地排列，其均方根偏差(rmsd)值为用cα(t细胞受体α链恒定部分；图7a)算得。这对于两种结合肽均是如此，包括其侧链，用所有原子算得的rmsd值为1.27a，即便与二硫键很近时也如此(图7b)。对于与1g4tcr的相互作用，可得出类似结论。wt-a*02：011g4与y84c/a139chla-a*02：01164晶体结构比较时，与肽和mhc骨架相互作用的互补决定区(cdr)环区确实显示介面有轻微偏差，对接角发生4.13°的较小变化。重复进行结晶时，这种偏移仍在同一复合体的预期偏差范围内(图7，c和d)。总之，确定的结合亲和力和晶体结构展现了y84c/a139chla-a*02：01pmhc复合体与野生型复合体相比就tcr结合而言具有肽接受性和类似性质。1g4y84c/a139chla-a*02：01eso9v复合体的晶体结构以登录号6q3s保存于pdb中。24.讨论本文中，本发明人提出了二硫化物稳定的和功能上空的hla-a*02：01分子，其可在不使用通常需要高亲和力肽(例如，二肽gm)的情况下进行重折叠和纯化。在一步负载程序法中加入肽后，所得单体可形成pmhc。虽然二硫键增强了mhc分子的稳定性，但与野生型相比，引入不会抑制或显著改变tcr与二硫化物修饰hla*02：01pmhc复合体的结合。此技术是一种很好工具的代表，可快速生成适合亲和力测量的大型pmhc文库。二硫化物修饰hla*02：01产生的pmhc复合体文库与基于生物层干涉测定法的分析结合可形成能够进行高通量pmhc-bstcr结合动力学筛选的平台。此设置也可用于分析靶向作用于pmhc复合体的其他生物制剂，如：单克隆抗体或双特异性抗体(诸如，双特异性t细胞衔接器)。在此平台的一种应用中，本发明人能够快速收集hiv特异性bstcrbs-868z11-cd3的pmhc-bstcr结合亲和力数据集。与所提呈的t细胞衔接器耦合并且在细胞报告测定中进行测试时，bstcr对各pmhc的结合亲和力提示体外活性，因而使这些数据集可用于bstcr表征。在广泛的pmhc-bstcr亲和力范围内分析结合亲和力与bstcr介导细胞激活之间的关系有困难，因此，可作为有限的工具以可行地收集此类数据集。所收集的结合基序显示出与野生型tcr868的结合基序的相似性。868一sv9晶体结构的分析以及cole等人(34)的伴随丙氨酸扫描显示，cdr3α区与slyntvatl的氨基酸4n和5t之间存在明显相互作用。即使cdr3α的重要部分在868z11构建体中发生突变，这种行为似乎仍被保留。透过使用结合基序和模型搜索策略，本发明人能够鉴定来自人蛋白质组的多个肽，其表现出与bstcr之间的高亲和力相互作用并可能在提呈于靶细胞上时诱导bstcr介导的jurkat效应子激活。请注意，源自单个氨基酸取代文库的tcr结合基序可能仍不能反映特定tcr(stcr)可识别的所有可能的肽，这是因为多个氨基酸的同时交换可能与单独交换具有不同的作用。替代方法包括，例如，透过高度多样性肽库(各肽在除了一个以外的所有位置随机化)负载的靶细胞筛选更复杂的文库，或筛选针对在酵母表面上提呈为pmhc复合体的随机肽文库(10，32，33)。需要进一步进行研究，直接比较这些方法，以更深入了解各自的优势和劣势。最终，对临床候选物的安全筛查应始终由多种方法组成，例如，透过将结合基序引导的分析与大系列健康组织衍生细胞系的细胞筛选相结合，从而使风险降到最低。本文提出的结果强调了此方法与pmhc-bstcr结合动力学筛选平台结合能够鉴定潜在的相关脱靶相互作用。由于可快速分析复杂pmhc文库，因此，可用于开发过程早期，以选择有希望的候选物，从而使已确立的方法更完善。此平台还可促进对晚期候选物的更大和更全面的筛选，可能针对覆盖已知免疫肽组的质谱数据驱动的组织特异性pmhc文库。由于二硫化物修饰hla*02：01分子稳定和肽负载程序容易进行，因此，可能实现更高通量的平台。由于这些特性，因此，非常适用于透过例如将二硫化物修饰hla*02：01分子的量产涂层与现代高通量肽微阵列喷墨印表机相结合，以创建具有数千种不同pmhc复合体的高复杂性pmhc微阵列。引用的参考文献1.rammensee，h.g.，falk，k.&o.peptidesnaturallypresentedbymhcclassimolecules.annu.rev.immunol.11，213-44(1993).2.garboczi，d.n.etal.hla-a2-peptidecomplexes：refoldingandcrystallizationofmoleculesexpressedinescherichiacoliandcomplexedwithsingleantigenicpeptides.proc.natl.acad.sci.u.s.a.89，3429-3433(1992).3.altman，j.d.etal.phenotypicanalysisofantigen-specifictlymphocytes.science(80-.).274，94-96(1996).4.hadrup，s.r.etal.high-throughputt-cellepitopediscoverythroughmhcpeptideexchange.methodsmol.biol.524，383-405(2009).5.garcia，k.c.etal.alphabetatcellreceptorinteractionswithsyngeneicandallogeneicligands：affinitymeasurementsandcrystallization.proc.natl.acad.sci.u.s.a.94，13838-43(1997).6.stone，j.d.&kranz，d.m.roleoftcellreceptoraffinityintheefficacyandspecificityofadoptivetcelltherapies.front.immunol.4，1-16(2013).7.robbins，p.f.etal.singleanddualaminoacidsubstitutionsintcrcdrscanenhanceantigen-specifictcellfunctions.j.immunol.180，6116-6131(2008).8.varela-rohena，a.etal.controlofhiv-1immuneescapebycd8tcellsexpressingenhancedt-cellreceptor.nat.med.14，1390-1395(2008).9.oates，j.，hassan，n.j.&jakobsen，b.k.immtacsfortargetedcancertherapy：why，what，how，andwhich.mol.immunol.67，67-74(2015).10.wooldridge，l.etal.asingleautoimmunetcellreceptorrecognizesmorethanamilliondifferentpeptides.j.biol.chem.287，1168-1177(2012).11.cameron，b.j.etal.identificationofatitin-derivedhla-a1-presentedpeptideasacross-reactivetargetforengineeredmagea3-directedtcells.sci.transl.med.5，197ra103(2013).12.linette，g.p.etal.cardiovasculartoxicityandtitincross-reactivityofaffinity-enhancedtcellsinmyelomaandmelanoma.blood122，863-871(2013).13.raman，m.c.c.etal.directmolecularmimicryenablesoff-targetcardiovasculartoxicitybyanenhancedaffinitytcrdesignedforcancerimmunotherapy.sci.rep.6，18851(2016).14.bijen，h.m.etal.preclinicalstrategiestoidentifyoff-targettoxicityofhigh-affinitytcrs.mol.ther.(2018).doi：10.1016/j.ymthe.2018.02.01715.shao，w.etal.thesystemhcatlasproject.nucleicacidsres.46，d1237-d1247(2018).16.zacharias，m.&springer，s.conformationalflexibilityofthemhcclassiα1-a2domaininpeptideboundandfreestates：amoleculardynamicssimulationstudy.biophys.j.87，2203-2214(2004).17.hein，z.etal.peptide-independentstabilizationofmhcclassimoleculesbreachescellularqualitycontrol.j.cellsci.127，2885-97(2014).18.saini，s.k.etal.notallemptymhcclassimoleculesaremoltenglobules：tryptophanfluorescencerevealsatwo-stepmechanismofthermaldenaturation.mol.immunol.54，386-396(2013).19.saini，s.n.etal.dipeptidespromotefoldingandpeptidebindingofmhcclassimolecules.proc.natl.acad.sci.110，15383-15388(2013).20.boulter，j.m.etal.stable，solublet-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.proteineng.16，707-711(2003).21.chen，j.-l.eta1.structuralandkineticbasisforheightenedimmunogenicityoftcellvaccines.j.exp.med.201，1243-55(2005).22.aggen，d.h.etal.identificationandengineeringofhumanvariableregionsthatallowexpressionofstablesingle-chaintcellreceptors.proteineng.des.sel..24，361-372(2011).23.zhu，z.&carter，p.identificationofheavychainresiduesinahumanizedanti-cd3antibodyimportantforefficientantigenbindingandtcellactivation.j.immunol.155，1903-10(1995).24.burrows，s.r.，rodda，s.j.，suhrbier，a.，geysen，h.m.&moss，d.j.thespecificityofrecognitionofacytotoxictlymphocyteepitope.eur.j.immunol.22，191-195(1992).25.rodenko，b.etal.generationofpeptide-mhcclassicomplexesthroughuv-mediatedligandexchange.nat.protoc.1，1120-1132(2006).26.andreatta，m.&nielsen，m.gappedsequencealignmentusingartificialneuralnetworks：applicationtothemhcclassisystem.bioinformatics32，511-517(2016).27.thomsen，m.c.f.&nielsen，m.seq2logo：amethodforconstructionandvisualizationofaminoacidbindingmotifsandsequenceprofilesincludingsequenceweighting，pseudocountsandtwo-sidedrepresentationofaminoacidenrichmentanddepletion.nucleicacidsres.40，w281-7(2012).28.weinschenk，t.etal.integratedfunctionalgenomicsapproachforthedesignofpatient-individualantitumorvaccines.clin.cancerres.62，5818-5827(2002).29.fritsche，j.etal.translatingimmunopeptidomicstoimmunotherapy-decision-makingforpatientandpersonalizedtargetselection.proteomics18，1700284(2018).30.elliott，t.，willis，a.，cerundolo，v.&townsend，a.processingofmajorhistocompatibilityclassi-restrictedantigensintheendoplasmicreticulum.j.exp.med.181，1481-1491(1995).31.bossi，g.etal.examiningthepresentationoftumor-associatedantigensonpeptide-pulsedt2cells.oncoimmunology2，e26840(2013).32.birnbaum，m.e.etal.deconstructingthepeptide-mhcspecificityoftcellrecognition.cell157，1073-1087(2014).33.gee，m.h.etal.antigenidentificationfororphantcellreceptorsexpressedontumor-infiltratinglymphocytes.cell172，549-563.e16(2018).34cole，d.k.etal.dualmolecularmechanismsgovernescapeatimmunodominanthlaa2-restrictedhivepitope.front.immunol.8，1503(2017).35.kabsch，w.xds.actacrystallogr.dbiol.crystalogr.66，125-132(2010).36.evans，p.scalingandassessmentofdataquality.actacrystallogr.sect.dbiol.crystallogr.62，72-82(2006).37.vagin，a.etal.molecularreplacementwithmolrep.actacrystollogr.sect.dbiol.crystallogr.66，22-25(2010).38.kovalevskiy，o.etal.overviewofrefinementprocedureswithinrefmac5：utilizingdatafromdifferentsources.actacrystallogr.sect.dstruct.biol.74，215-227(2018).39.emsley，p.etal.featuresanddevelopmentofcoot.actacrystallogr.sect.dbiol.crystallogr.66，486-501(2010).40.chen，v.b.etal.molprobity：all-atomstructurevalidationformacromolecularcrystallography.actacrystallogr.sect.dbiol.crystallogr.66，12-21(2010).41.s.k.saini，t.tamhane，r.anjanappa，a.saikia，s.ramskov，m.donia，i.m.svane，s.n.jakobsen，m.garcia-alai，m.zacharias，r.meijers，s.springer，s.r.hadrup，emptypeptide-receptivemhcclassimoleculesforefficientdetectionofantigen-specifictcells.sci.immunol.4，37eaau9039，07-19(2019).序列名单<110>伊玛提克斯生物技术有限公司<120>tcr配体的高通量肽-mhc亲和力筛选方法<130>1017-15pct<150>us62/731,337<151>2018-09-14<150>de102018122546.6<151>2018-09-14<150>us62/873,102<151>2019-07-11<160>325<170>patentinversion3.5<210>1<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>1alaleutyrasnvalleualalysval15<210>2<211>6<212>prt<213>homosapiens<400>2alaproprovalalagly15<210>3<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>3serleuleumettrpilethrglncys15<210>4<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>4serleuleumettrpilethrglnval15<210>5<211>9<212>prt<213>homosapiens<400>5ser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