控制杂草甜菜和其它杂草的方法与流程

文档序号：26003761发布日期：2021-07-23 21:21阅读：222来源：国知局

发明领域

本发明涉及在甜菜(betavulgaris)生长地区控制杂草甜菜如一年生甜菜或抽苔甜菜(bolters)的方法。

发明背景

杂草甜菜是野草形式的野生甜菜，其最初是由糖用甜菜作物与野生海甜菜之间的杂交而产生，由于栽培甜菜和野生群之间不存在杂交屏障，可以发生作物/野生交配。与表现为两年生的栽培糖用甜菜相反，杂草甜菜基本上是一年生的，并且趋于在第一年就已经抽苔和开花。由于一年生等位基因的显性，一年生杂草与两年生糖用甜菜之间的种间杂交导致一年生杂种。抽苔的杂草甜菜能够结出大量种子。单株抽苔甜菜可以产生多达两万粒种子。杂草甜菜产生的多数种子再次发芽成为抽苔甜菜。此外，抽苔甜菜在其田间土壤中建立了种子库，这些种子库可以存活多年。

在许多国家，杂草甜菜是糖用甜菜作物中存在的日益严重的问题。例如在英国，目前约80％的糖用甜菜田地被杂草甜菜种子侵染。由于田中杂草甜菜的密度增加，根和糖产量逐渐降低。无迹象表明存在杂草甜菜的阈值密度，低于该阈值密度则没有产量损失，对于每棵杂草甜菜植物/m²，所述产量损失平均为11.7％。这对应于根作物中每1％抽苔杂草甜菜导致平均0.6％的糖产量损失，直至100％，这与报道的根作物中的抽苔甜菜造成的损失相似。

可以使用选择性除草剂来实现对其它作物的控制，但在甜菜中，杂草甜菜(其中许多是一年生习性)不易控制，且经常与作物竞争。目前，控制杂草甜菜成本高且困难。杂草管理必须包括减少田间杂草甜菜数量和种子库(土壤中非发芽种子的群体)中种子数量两者的策略。由于杂草甜菜与糖用甜菜是同一物种，它们的幼苗和莲座(rosettes)看起来相同，直到它们抽苔。任何可安全用于糖用甜菜的除草剂均不对其杂草亲属种产生影响。目前最有效但极耗时且成本高的用于将杂草甜菜控制和减少至可接受水平的方法是等待杂草抽苔，然后通过人工除草逐株杀灭。

因此，迫切需要提供改善的用于在作物中控制杂草甜菜或抽苔甜菜的方法。本发明的目的是解决此问题。

发明概述

发明人开发了用于在甜菜、特别是糖用甜菜的生长区域中控制抽苔甜菜(或杂草甜菜)并且由此增加这些区域的产量的方法。一个基本要素是提供新的草甘膦抗性甜菜植物、特别是糖用甜菜。此种除草剂抗性性状不依赖于如wo2004/074492a1中公开的对如甜菜中的基因组转基因修饰，而是依赖于内源性epsp合酶基因中的单一点突变，如通过使用诱变剂创建的。此类突变甜菜植物不被视为遗传修饰生物体(gmo)。因此，在公共领域中的接受度高，并且关于此类植物的商业化的法律限制是最小的。

此外，在某些实施方式中，创造性的方法还利用了最近进入市场的另一除草剂抗性糖用甜菜(wo2012/049268a1)。这些糖用甜菜植物携带内源乙酰乳酸基因中的点突变，其赋予了对被称为als抑制剂的另一除草剂的抗性。

本发明特别地由所附权利要求限定，其以引用的方式明确并入本文。

一方面，本发明涉及用于控制甜菜生长区域中抽苔甜菜及其它不需要的植被的方法，包括种植糖用甜菜植物或生长糖用甜菜种子，其包含编码修饰的epsp合酶的修饰的内源性等位基因，并向所述生长的植物施用草甘膦除草剂。

更特别地，所述方法包括以下步骤：a)种植糖用甜菜植物或播种糖用甜菜种子，其包含编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶的内源性等位基因，b)将草甘膦除草剂施用于生长中的植物，以及c)任选地，在生长季节期间重复步骤b)。

在另一方面，本发明涉及在糖用甜菜生长区域生产糖用甜菜的方法，包括以下步骤：a)实施上述方法的步骤，以及b)收获糖用甜菜。

另一方面，本发明涉及提供草甘膦抗性糖用甜菜植物的方法，包括以下步骤：a)用至少0.5％的ems或至少0.3％的enu诱变糖用甜菜细胞或组织，b)从诱变的细胞或组织中产生苗(steck)(m0)，c)重植苗以产生种子群体(m1)，d)从m1种子生长出的植物中产生种子(m2)，e)播种m2种子并将至少600g/ha草甘膦活性成分施用于生长中的植物，f)任选地，将存活的植物重植在盆中，并将至少600g/ha的草甘膦活性成分施用于生长中的植物，以及g)选择无除草剂损害的存活的植物。

另一方面，本发明涉及糖用甜菜植物或植物部分，其包含编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶的内源性等位基因。

另一方面，本发明涉及生产糖的方法，包括：a)提供如上所述的根据本发明的甜菜植物的根，b)从所述甜菜根中提取糖。

另一方面，本发明涉及如上所述的根据本发明的糖用甜菜植物的植物部分在糖生产、厌氧消化或发酵的方法中的用途。

另一方面，本发明涉及如上所述的本发明的糖用甜菜植物的植物部分在糖、生物气体或生物燃料生产的方法中的用途。

另一方面，本发明涉及方法，包括在糖用甜菜植物或植物部分中鉴别编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶的内源性等位基因。

发明详述

在描述本发明的系统和方法之前，应理解本发明不限于所描述的特定系统和方法或其组合，因为此类系统和方法及其组合当然可变化。还应理解，本文使用的术语不旨在限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

如本文所用，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个(a/an)”、和“所述”包括单数和复数指代物两者。

本文所用的术语“包含(comprising/comprises/comprisedof)”与“包括(including/includes)”或“含有(containing/contains)”同义，并且是包括或开放式的且不排除额外的未列举的成员、元件或方法步骤。将理解的是，如本文所用的术语“包含(comprising/comprises/comprisedof)”包括术语“由……组成(consistingof/consists/consistsof)”以及术语“基本上由……组成(consistingessentiallyof/consistsessentially/consistsessentiallyof)”。

由端点列举的数值范围包括归入相应范围内的所有数字和分数以及所列举的端点。

当提及可测量值如参数、量、时间持续等时，本文所用的术语“约”或“大约”意味着涵盖从指定值+/-20％或更小、优选+/-10％或更小、更优选+/-5％或更小及更优选+/-1％或更小的变化，只要此类变化适合于在公开的发明中进行。应理解，修饰语“约”或“大约”提及的值本身也被具体及优选地公开。

尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(如一组成员中的一个或多个或至少一个成员)本身是明确的，但通过进一步举例说明，该术语尤其涵盖对任一所述成员，或任何两个或多个所述成员，例如任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等所述成员以及直至所有所述成员的提及。

本说明书中引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。特别地，本文特别提及的所有参考文献的教导也以引用的方式并入本文。

除非另有定义，用于公开本发明的所有术语，包括技术和科学术语，均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指导，包含术语定义以更好地理解本发明的教导。

阐述重组dna技术的一般原理的标准参考著作包括molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,vol.1-3,ed.sambrooketal.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；currentprotocolsinmolecularbiology,ed.ausubeletal.,greenepublishingandwiley-interscience,newyork,1992(withperiodicupdates)(“ausubeletal.1992”)；theseriesmethodsinenzymology(academicpress,inc.)；innisetal.,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress:sandiego,1990；pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hamesandg.r.tayloreds.(1995)；harlowandlane,eds.(1988)antibodies,alaboratorymanual；andanimalcellculture(r.i.freshney,ed.(1987)。微生物学的一般原理在例如davis,b.d.etal.,microbiology,3rdedition,harper&row,publishers,philadelphia,pa.(1980)中阐述。

在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确相反地指出，如此定义的每个方面可与任何其它方面组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可与指示为优选或有利的任何其它特征组合。

在整个说明书中，提及“一个实施方式”或“实施方式”意味着与所述实施方式相关描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，在整个本说明书中各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定(而是可以)全部指同一实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，特定的特征、结构或特性可以以任何合适方式组合，这对于本领域技术人员而言根据本公开将是显而易见的。此外，如本领域技术人员将理解的，尽管本文描述的一些实施方式包括其它实施方式中包括的一些(而非其它)特征，意味着不同实施方式的特征的组合在本发明的范围内，并且形成不同的实施方式。例如，在所附权利要求中，任何要求保护的实施方式可以以任何组合使用。

应理解，在不偏离本发明的范围的情况下，可利用其它实施方式，并且可进行结构或逻辑上的改变。因此，以下详细描述不应被视为限制性意义，并且本发明的范围由所附权利要求限定。

本发明的优选陈述(特征)和实施方式在下文中设定。除非明确相反地指出，如此定义的本发明的每个陈述和实施方式可与任何其它陈述和/或实施方式组合。特别地，指示为优选或有利的任何特征可与指示为优选或有利的任何其它特征组合。至此，本发明特别地由以下编号的方面和实施方式1-48的一个或多个中的任一个或任何组合以及任何其它陈述和/或实施方式限定。

1.用于控制糖用甜菜生长区域中抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜或用于增加甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中甜菜产量的方法，包括以下步骤：a)种植甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，或播种甜菜种子、特别是糖用甜菜种子，其包含编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶的内源性等位基因，b)向生长中的植物施用草甘膦除草剂，优选以足以抑制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜生长的剂量施用，更优选以足以杀灭抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的剂量施用，以及c)任选地，在生长季节期间重复步骤b)。

2.草甘膦除草剂在甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中控制不需要的植物、特别是杂草甜菜、一年生甜菜、抽苔甜菜中的用途，其中甜菜植物、特别是糖用甜菜植物包含编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶的内源性等位基因。

3.陈述1或2的方法或用途，其中草甘膦除草剂选自草甘膦或其衍生物，优选其中所述衍生物是盐、酯、酰胺或烷基酰胺；优选其中所述盐是碱金属盐，如(一、二或三)钠盐或(一、二或三)钾盐，铵盐，二铵盐如二甲基铵，烷基胺盐如c1-c16烷基胺盐，如二甲胺、乙胺、乙二胺、六亚甲基二胺、正丙胺和异丙胺盐，烷基铵盐如c1-c16烷基铵盐，如二甲基铵和异丙基铵盐，如单异丙基铵盐(ipa)，链烷醇胺盐如c1-c16链烷醇胺盐，如(一、二或三)乙醇胺盐，如单乙醇铵盐(mea)，烷基锍盐如三甲基锍盐(tms)，氧化硫盐，以及它们的混合物或组合。

4.陈述1-3中任一项的方法或用途，其中所有内源性等位基因编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶。

5.陈述1-4中任一项的方法或用途，其中内源性等位基因编码在第179位具有选自丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和亮氨酸的氨基酸的epsp合酶，优选氨基酸是丝氨酸。

6.陈述1-5中任一项的方法或用途，其中在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶包含选自以下的氨基酸序列：i)seqidno:3的序列，ii)在第179位具有非丝氨酸和脯氨酸的氨基酸的i)的序列，或iii)与i)或ii)的序列优选在序列的全长上具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％的相同性的序列，并且优选具有epsp合酶活性。

7.陈述1-6中任一项的方法或用途，其中内源性等位基因编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶，所述内源性等位基因包含选自以下的核苷酸序列：i)seqidno:1的序列，ii)具有seqidno:2的编码序列的序列，iii)具有对应于seqidno:3的第179位氨基酸或对应于seqidno:3的第179位氨基酸的密码子的核苷酸，并且在所述第179位编码非丝氨酸和脯氨酸的氨基酸的i)或ii)的序列，iv)与i)、ii)或iii)的序列优选在序列的全长上具有至少90％相同性的序列，优选具有至少95％、更优选至少98％相同性如具有至少99％相同性，并且优选具有epsp合酶活性，和/或在严格的条件下与i)、ii)或iii)的序列的反向互补序列杂交；或v)编码根据陈述6的epsp合酶的核苷酸序列。

8.陈述1-7中任一项的方法或用途，其中内源性等位基因或所有内源性等位基因编码的epsp合酶在第175位额外具有非苏氨酸的氨基酸，优选所述氨基酸是异亮氨酸。

9.陈述8的方法或用途，其中在第175位额外具有非苏氨酸的氨基酸的epsp合酶包含选自以下的氨基酸序列：

i)seqidno:6的序列，或

ii)在第175位具有非异亮氨酸和苏氨酸的氨基酸的i)的序列，或

iii)与i)或ii)的序列优选在序列的全长上具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％相同性的序列，并且优选具有epsp合酶活性。

10.陈述8或9的方法或用途，其中内源性等位基因编码在第175位额外具有非苏氨酸的氨基酸的epsp合酶，所述内源性等位基因包含选自以下的核苷酸序列：i)seqidno:4的序列，ii)具有seqidno:5的编码序列的序列，iii)具有对应于seqidno:6的第175位氨基酸或对应于seqidno:6的第175位氨基酸的密码子的核苷酸，并且在所述第175位编码非异亮氨酸和苏氨酸的氨基酸的i)或ii)的序列，iv)与i)、ii)或iii)的序列优选在序列的全长上具有至少90％相同性的序列，优选具有至少95％、更优选至少98％相同性如具有至少99％相同性，并且优选具有epsp合酶活性，和/或在严格条件下与i)、ii)或iii)的序列的反向互补序列杂交；或v)编码根据陈述9的epsp合酶的核苷酸序列。

11.陈述1-10中任一项的方法或用途，其中(在方法的步骤b中)，将至少300g/ha的活性成分草甘膦施用于生长中的植物，优选施用至少600g/ha活性成分草甘膦，更优选至少1200g/ha活性成分草甘膦，优选其中所述活性成分是草甘膦酸当量。

12.陈述1-11中的任一项的方法，其中步骤b)在抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的花的授粉之前，优选开花前阶段或最晚在开花时进行。

13.陈述1-12中任一项的方法或用途，其中甜菜植物或甜菜种子进一步包含编码乙酰乳酸合酶(als)的内源性等位基因，所述als在第569位具有非色氨酸的氨基酸，优选所述氨基酸选自丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或精氨酸，优选所述氨基酸是亮氨酸。

14.陈述13的方法或用途，其中内源性等位基因编码的乙酰乳酸合酶在第188位额外具有非脯氨酸的氨基酸，优选所述氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，更优选所述氨基酸是丝氨酸。

15.陈述13-14中任一项的方法，其进一步包括：a)在先前或随后的生长季节中，种植甜菜植物或播种甜菜种子，其包含如陈述13-14中任一项定义的编码乙酰乳酸合酶的内源基因；b)将als抑制剂施用于生长中的植物，以及c)任选在另一生长季节期间重复步骤b)。

16.用于控制在甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜或用于增加甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中甜菜产量的方法，包括以下步骤：a)种植甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，或播种甜菜种子、特别是糖用甜菜种子，其包含如陈述1-12任一项定义的编码epsp合酶的内源性等位基因以及编码在第569位具有非色氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶的内源性等位基因，b)将als抑制剂施用于生长中的植物，优选以足以抑制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜生长的剂量施用，更优选以足以杀灭抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的剂量施用，以及c)任选地，在生长季节期间重复步骤b)。

17.控制甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中抽苔甜菜、杂草甜菜、或一年生甜菜的方法，或增加甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中甜菜产量的方法，所述方法包括如下步骤：种植甜菜植物、特别是糖用甜菜植物或播种甜菜种子，尤其是甜菜种子，其包含编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶蛋白的内源基因和在第569位编码具有非色氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶的内源基因，b)将选自i)草甘膦或ii)als抑制剂除草剂的第一除草剂施用于生长中的植物，优选以足以抑制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜生长的剂量施用，更优选以足以杀灭抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的剂量施用，c)将与步骤中施用的除草剂不同的选自i)草甘膦或ii)als抑制剂除草剂的第二除草剂施用于生长中的植物，优选以足以抑制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜生长的剂量施用，更优选以足以杀灭抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的剂量施用，及d)任选在生长季节期间重复步骤b)和/或c)。

18.陈述13或14中任一项的用途，其与als抑制剂，优选选自以下的als抑制剂组合：磺酰脲，磺酰基氨基羰基三唑啉酮，三唑并嘧啶，磺酰苯胺，咪唑啉酮，嘧啶基氧基苯甲酸，嘧啶基硫代苯甲酸。

19.陈述18的用途，其中各除草剂的施用(i)共同或同时进行，或(ii)在不同时间和/或以多个部分进行(顺序施用)，在发芽前及随后在发芽后施用，或在发芽后早期施用随后在发芽后中期或晚期施用。

20.陈述13-19任一项的方法或用途，其中所有内源性等位基因编码在第569位具有非色氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶。

21.陈述13-20任一项的方法或用途，其中内源性等位基因编码在第569位具有选自丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或精氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶，优选所述氨基酸是亮氨酸。

22.陈述13-21任一项的方法或用途，其中在第569位具有非色氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶包含选自以下的氨基酸序列：i)seqidno:9的序列，ii)在第569位具有不同于色氨酸和亮氨酸的氨基酸的i)的序列，或iii)与seqidno:9优选在序列的全长上具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％相同性的的序列，优选具有乙酰乳酸合酶活性。

23.陈述13-22任一项的方法或用途，其中编码乙酰乳酸合酶的内源性等位基因具有选自以下的核苷酸序列：i)seqidno:7的序列，ii)具有seqidno:8的编码序列的序列，iii)具有对应于seqidno:9的第569位氨基酸或对应于seqidno:9的第569位氨基酸的密码子的核苷酸，并且在所述第569位编码不同于色氨酸和亮氨酸的氨基酸的i)或ii)的序列，iv)与i)或ii)的序列优选在序列全长上具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％相同性的序列，优选具有乙酰乳酸合酶活性，和/或在严格条件下与i)、ii)或iii)的序列的反向互补序列杂交；或v)编码根据陈述22的乙酰乳酸合酶的核苷酸序列。

24.陈述13-23任一项的方法或用途，其中内源性等位基因或所有内源性等位基因编码的乙酰乳酸合酶在第188位额外具有非脯氨酸的氨基酸，优选所述氨基酸选自丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，更优选所述氨基酸是丝氨酸。

25.陈述24的方法或用途，其中在第188位额外具有非脯氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶包含选自以下的氨基酸序列：i)seqidno:12的序列；ii)在第188位具有非丝氨酸和脯氨酸的氨基酸的i)的序列，或iii)与seqidno:12的序列优选在序列的全长上具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％相同性的序列，优选具有乙酰乳酸合酶活性。

26.陈述24或25的方法或用途，其中内源性等位基因编码的在第188位额外具有非脯氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶包含选自以下的核苷酸序列：i)seqidno:10的序列，ii)具有seqidno:11的编码序列的序列，iii)具有对应于seqidno:12的第188位氨基酸或对应于seqidno:12的第188位氨基酸的密码子的核苷酸，并且在所述第188位编码非丝氨酸和脯氨酸的氨基酸的i)或ii)的序列，iv)与i)、ii)或iii)的序列优选在序列的全长上具有至少90％相同性的序列，优选具有至少95％、更优选至少98％相同性如具有至少99％相同性，优选具有乙酰乳酸合酶活性，和/或在严格条件下与i)、ii)或iii)的序列的反向互补序列杂交；或v)编码根据陈述25的乙酰乳酸合酶的核苷酸序列。

27.陈述13-26任一项的方法或用途，其中(在方法的步骤b)中)将至少300g/ha活性成分草甘膦施用于生长中的植物，优选施用至少600g/ha活性成分草甘膦，更优选至少1200g/ha，优选其中所述活性成分是草甘膦酸当量；和/或将als抑制剂以最小剂量施用生长中的植物，该剂量相当于35g/ha甲氨酰磺隆和7g/ha碘甲磺隆-甲基钠的混合物。

28.陈述13-27任一项的方法，其中草甘膦除草剂和/或als抑制剂在抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的花的授粉前，优选开花前阶段或最晚在开花时施用。

29.控制甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的方法，或增加甜菜生长区域、特别是糖用甜菜生长区域中甜菜产量的方法，包括i)在生长季节中实施根据陈述1-12任一项的方法，及ii)在另一生长季节中实施以下步骤：a)种植甜菜植物，其包含编码陈述13-26任一项定义的乙酰乳酸合酶的内源基因；b)将als抑制剂施用于生长中的植物，以及c)任选在另一生长季节期间重复步骤b)。

30.陈述29的方法，其中ii)的另一生长季节是在i)的生长季节之前和/或之后。

31.陈述29或30的方法，其中在步骤ii)的b)中，将als抑制剂以最小剂量施用于生长中的植物，所述剂量相当于35g/ha甲酰胺磺隆和7g/ha碘甲磺隆-甲基钠的混合物。

32.陈述29-31任一项的方法，其中步骤ii)的b)在所述抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的花授粉前、优选开花前阶段或最晚在开花时进行。

33.在甜菜、特别是糖用甜菜生长区域中生产甜菜根、特别是糖用甜菜的方法，包括以下步骤：a)实施陈述1-32任一项的方法，以及b)优选在生长季节结束时收获甜菜根、特别是糖用甜菜。

34.提供草甘膦抗性的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物的方法，包括以下步骤：a)用至少0.5％的ems或至少0.3％的enu诱变甜菜、特别是糖用甜菜细胞或组织，b)从诱变的细胞或组织中产生苗(m0)，c)再种植苗以产生种子的群体(m1)，d)从m1种子生长出的植物中产生种子(m2)，e)播种m2种子并将至少600g/ha草甘膦活性成分施用于生长中的植物，优选其中所述活性成分是草甘膦酸当量，f)任选地，将存活的植物再种植在盆中，并将至少600g/ha的草甘膦活性成分施用于生长中的植物，优选其中所述活性成分是草甘膦酸当量；以及g)选择无除草剂损害或除草剂损害最小的存活的植物。

35.陈述34的方法，进一步包括以下步骤：h)任选地对g)的植物的内源性epsp合酶等位基因进行测序，或对g)的植物使用标记s1txepss02，以及i)选择包含内源性等位基因的糖用甜菜植物，所述等位基因编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶。

36.通过陈述34或35的方法获得的草甘膦抗性的甜菜植物，特别是糖用甜菜植物或植物的一部分；或其后代或种子。

37.陈述36的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，其中植物并非仅通过基本生物学手段获得。

38.甜菜植物、特别是糖用甜菜植物或其植物部分或种子，包含编码在第179位具有非脯氨酸的氨基酸的epsp合酶的内源性等位基因。

39.陈述36-38任一项的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，其中所有内源性等位基因编码的epsp合酶在第179位有非脯氨酸的氨基酸。

40.陈述36-39任一项的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，其中编码epsp合酶的内源性等位基因如陈述5-10任一项所定义。

41.陈述36-40任一项的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，其进一步包含编码在第569位具有非色氨酸的氨基酸的乙酰乳酸合酶的内源性等位基因。

42.陈述41的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，其中所有内源性等位基因编码的乙酰乳酸合酶在第569位具有非色氨酸的氨基酸。

43.陈述41-42任一项的甜菜植物、特别是糖用甜菜植物，其中编码乙酰乳酸合酶的内源性等位基因如陈述13-14或21-26任一项所定义。

44.陈述36-43任一项的甜菜植物，如糖用甜菜植物或植物部分，其中所述植物部分为甜菜根、种子、细胞或组织。

45.生产糖的方法，包括：a)提供陈述36-44任一项的糖用甜菜植物的根，b)从所述甜菜根中提取糖。

46.陈述36-44任一项的糖用甜菜植物的植物部分在糖生产、厌氧消化或发酵的方法中的用途。

47.陈述36-44任一项的糖用甜菜植物的植物部分在糖、生物气体或生物燃料生产的方法中的用途。

48.方法，包括在甜菜植物、特别是糖用甜菜植物或植物部分中鉴定编码epsp合酶的内源性等位基因，所述epsp合酶在第179位具有非脯氨酸的氨基酸和/或在第175位具有非苏氨酸的氨基酸。

特别地，甜菜种的植物是亚种betavulgarissubsp.vulgaris的植物。例如，这些亚种中计入的是：betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(狭义的糖用甜菜)，betavulgarisssp.vulgarisvar.vulgaris(食用甜菜)，betavulgarisssp.vulgarisvar.conditiva(甜菜根/红甜菜)，betavulgarisssp.vulgarisvar.crassa/alba(饲料甜菜)。在优选的实施方式中，甜菜在本文指betavulgarissubsp.vulgaris，更优选betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(即糖用甜菜)。

栽培的糖用甜菜是两年生植物，其在第一年形成贮藏根和莲座叶。在一段时间的低温后开始茎干(shoot)伸长(抽苔)及花形成，而许多该属的b.vulgarisssp.maritima的野生甜菜由于在b基因座存在抽苔基因b而表现出一年生习性。bolting基因(b基因)是决定糖用甜菜的一年生习性的原因。甜菜属物种的一年生习性被认为是单基因和显性性状。携带显性b等位基因的植物能以与春化无关的方式从幼苗期转变为繁殖阶段，这与携带b等位基因的两年生植物相反，后者必须进行春化才能发生抽苔和随后开花。基因座b的显性等位基因在野生甜菜中富集，并且在长时间不需要寒冷(对于携带隐性等位基因的两年生品种通常必需)的情况下即可引起抽苔。如本文所用，“b基因”是指决定甜菜如糖用甜菜中一年生习性(早抽苔)的基因。携带显性等位基因b的植物能够以不依赖于春化的方式从幼苗期转变至繁殖期，即茎干伸长随后开花，而无需提前暴露于寒冷温度下。

在某些实施方式中，如本文所述的用于控制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的方法涉及在甜菜生长区域，优选betavulgarissubsp.vulgaris生长区域，特别是betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima生长区域中控制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的方法。在某些实施方式中，如本文所述的用于控制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的方法涉及在两年生甜菜生长区域，优选两年生betavulgarissubsp.vulgaris生长区域、特别是两年生betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima生长区域中控制抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的方法，。

在某些实施方式中，本文所述的用途涉及在甜菜生长区域、优选betavulgarissubsp.vulgaris生长区域、特别是betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima生长区域中的用途。在某些实施方式中，本文所述的用途涉及在两年生甜菜生长区域、优选两年生betavulgarissubsp.vulgaris生长区域、特别是两年生betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima生长区域中的用途。

“两年生(biennial/biannual)”的甜菜是指需要两年以完成其生物学生命周期的甜菜植物。“一年生”甜菜是指在一年内发芽、开花和死亡的甜菜植物。“一年生甜菜”是指在杂合或纯合状态下在b基因座含有显性等位基因b的甜菜植物。“两年生甜菜“是指在纯合状态下在b基因座含有隐性等位基因b的甜菜植物。

“抽苔”是指从植物莲座期至花序或繁殖生长期的转变，特别是茎干形成。抽苔(茎伸长)是从营养生长转变为繁殖生长的清晰可见的第一步。抽苔的特征可以在于在生长的第一年出现(不需要的)嫰枝，这不利于收获和加工，也降低作物产量。事实上，甜菜植物的抽苔和开花是不期望的，因为在例如糖用甜菜的情况下使用的不是种子或果实，而是植物的地下部分贮藏根，并且根中贮藏的能量在植物抽苔和开花期间会被消耗。

如本文所用，术语“抽苔甜菜“是指在生长季节期间、特别是种植或播种甜菜植物的同一年，优选地收获或需要收获甜菜之前的时间抽苔的甜菜植物。在某些实施方式中，抽苔甜菜是一年生甜菜植物。在某些实施方式中，抽苔甜菜是杂草甜菜。在某些实施方式中，抽苔甜菜是海甜菜(即betavulgarissubsp.maritima)。在某些实施方式中，抽苔甜菜不是betavulgarissubsp.vulgaris。在某些实施方式中，抽苔甜菜不是betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima。在某些实施方式中，抽苔甜菜包含显性抽苔基因(b基因)。如本文所用，术语“杂草甜菜”是指与甜菜生长区域中的预期栽培的甜菜植物相反的不需要的甜菜植物。典型杂草甜菜是野生甜菜。杂草甜菜优选一年生甜菜，任选地，是betavulgarissubsp.maritima。

如本文所用，在控制抽苔甜菜或不需要的植物或植被等的背景中，术语“控制”包括抑制或防止抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜或不需要的植物的生长，或抑制杂草甜菜或一年生甜菜抽苔，或至少抑制杂草甜菜或一年生甜菜的种子产生。“控制”还可包括优选在抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的抽苔发生前或至少在种子生产前杀灭抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜。“控制”还可包括优选在抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的抽苔发生之前或至少在种子生产之前降低甜菜生长区域中抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜或不需要的植物的量。在某些实施方式中，控制抽苔甜菜或不需要的植物等是指将抽苔甜菜或不需要的植物等的量减少至少50％，或将抽苔甜菜或不需要的植物等的生物量减少至少50％，如减少优选至少60％、更优选至少70％、例如至少80％或至少90％。

如本文所用，“不需要的植物”或“不需要的植被”应理解为意味着在不需要其的区域生长的所有植物。例如，此类植物可以是有害植物(例如单子叶或双子叶杂草或不需要的作物植物)。

如本文所用，“甜菜生长区域”是指目的在于收获，如甜菜根收获或种子收获而栽培(即有意种植或播种)甜菜植物的农业区域。

在某些方面，如本文所述的根据本发明的方法和用途可用于增加甜菜植物或植物部分(即与例如杂草甜菜相反的栽培的甜菜植物)的产量。产量的增加可以是例如(栽培的)甜菜量的增加或(栽培的)甜菜的生物量的增加，如收获的或可收获的植物部分如甜菜根的生物量的量的增加。例如，在糖用甜菜的情况下，产量的增加也可以是总体上糖的量或含量的增加(例如每公顷糖产量的增加)。

如本文所用，术语“生长季节”通常是指种植或播种甜菜植物或种子与收获甜菜，特别是甜菜根之间的时间段。通常，北半球的生长季节是从三月/四月到九月/十月/十一月。然而，技术人员将理解，取决于例如气候或天气条件或地质条件或地理位置，生长季节可更长或更短。还将进一步理解生长季节可改变，例如在冬季甜菜或春季甜菜的生产中。

如本文所用，除非另有明确说明，术语“植物”意指处于任何发育阶段的植物。

本发明的甜菜植物优选是正倍体或异倍体。正倍体植物优选可以是单倍体、二倍体、四倍体、六倍体、八倍体、十倍体或十二倍体，而异倍体植物优选可以是三倍体或五倍体。在某些实施方式中，本发明的甜菜植物是二倍体。

根据本发明的术语“植物”包括整个植物或此类整个植物的部分。整个植物优选是种子植物或作物。“植物的部分”是例如茎干营养器官/结构，例如叶、茎和块茎；根、花和花器官/结构，例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠；种子，包括胚芽、胚乳和种皮；果实和成熟子房；植物组织，例如维管组织、基本组织等；以及细胞，例如保卫细胞、卵细胞、花粉、毛状体等；以及它们的后代。植物的部分可附着于整个完整植物或与其分离。此类植物部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞，并且优选种子。“植物细胞”是植物的结构和生理学单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可处于分离的单个细胞或培养的细胞的形式，或作为较高组织化单元(例如植物组织、植物器官或整个植物)的部分。“植物细胞培养物”意味着植物单位，例如原生质体、细胞培养物、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠，胚囊、受精卵和处于不同发育阶段的胚的培养物。“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、受精卵、种子、插条、细胞或组织培养物，或植物的任何其它部分或产物。这也包括愈伤组织以及提取物(例如从主根/根甜菜中提取)或样品。“植物器官”是植物的独特且明显可见的结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花芽或胚。如本文所用，“植物组织”意味着组构成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。此术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组构成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。此术语与以上列举的或这个定义另外涵盖的任何特定类型植物组织结合或不结合的使用不旨在排除任何其它类型的植物组织。在某些优选的实施方式中，本文所指的植物部分或植物器官是根甜菜(或甜菜根)或种子。术语“根甜菜”(或甜菜根)是指主根或下胚轴或已转化为肉质贮藏器官的甜菜。

因此，关于内源性epsp合酶基因(和/或关于als基因)，本发明的甜菜植物优选是非转基因的。当然，本发明不排除可以通过基因工程、通过诱变或通过常规方法如杂交将其它外源基因转移至植物中。所述基因可以是赋予除草剂耐受性的基因，优选赋予与草甘膦或als抑制剂除草剂耐受性不同的除草剂耐受性，改善产量的基因，改善对生物体(真菌、细菌或病毒)的抗性的基因，改善对非生物胁迫如干旱、霜冻、高温等的耐受性的基因，和/或涉及含量或成分修饰的基因。

术语“转基因”在本文中意味着通过导入非内源性核酸序列的基因修饰。通常，将物种特异性核酸序列以某形式、排列或数量导入细胞中所述核酸序列不天然存在的位置。尽管根据本发明的甜菜植物相对于突变epsp合酶(和/或突变als)优选是非转基因的，但应理解此类甜菜植物对于其它性状可以是转基因的。

草甘膦是独特的除草剂，因为其是已知唯一的抑制芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成的除草剂。不能合成这三种氨基酸的植物是不能存活的。导致芳香族氨基酸的生物合成途径的受影响的酶是5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)，其催化莽草酸-3-磷酸(s3p)和磷酸烯醇式丙酮酸(pep)反应形成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(epsp)。草甘膦与pep具有结构相似性，与epsps结合并以竞争性方式抑制该酶的反应。草甘膦是已知唯一作用于epsps的除草剂(schonbrunne,eschenburgs,shuttleworthwa,schlossjv,amrheinn,evansjn,kabschw:interactionoftheherbicideglyphosatewithitstargetenzyme5-enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthaseinatomicdetail.procnatlacadsciusa2001,98(4):1376-1380.；pollegionil,schonbrunne,siehld:molecularbasisofglyphosateresistance-differentapproachesthroughproteinengineering.febsj2011,278(16):2753-2766.)。抑制芳香族氨基酸的合成引起植物生长或多或少立即停止，并最终在施用后数天内杀灭植物。因此，草甘膦通常是非选择性除草剂，并且将严重伤害或杀灭其接触的任何活植物组织。但，其可以选择性地用于草甘膦抗性的农作物，包括糖用甜菜、玉米、大豆、棉花和油菜籽。

在某些实施方式中，野生型甜菜epsp合酶具有如ncbi参考序列xp_010692222.1(seqidno:20)中提供的氨基酸序列。在某些实施方式中，野生型或天然甜菜epsp合酶具有与ncbi参考序列xp_010692222.1优选在全长上具有优选至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％的序列相同性的氨基酸序列，并且优选具有epsp合酶活性，条件是第179位的氨基酸残基是脯氨酸，并且任选第175位的氨基酸残基是苏氨酸。

在某些实施方式中，野生型甜菜epsp合酶基因具有编码如ncbi参考序列xp_010692222.1中提供的氨基酸序列的序列。在某些实施方式中，野生型或天然甜菜epsp合酶基因具有编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列与ncbi参考序列xp_010692222.1优选在全长上具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％的序列相同性，并且优选具有epsp合酶活性，条件是第179位的氨基酸残基是脯氨酸，并且任选第175位的氨基酸残基是苏氨酸。

优选地，如本文所用，其中氨基酸残基位置是针对epsp合酶提及的，编号对应于参考序列xp_010692222.1中的氨基酸位置。seqidno:3对应于具有p179s突变的xp_010692222.1的序列。seqidno:6对应于具有p179s突变和t175i突变的xp_010692222.1的序列。

如本文所用，术语“epsp合酶活性”是指epsp合酶的酶活性。在某些优选的实施方式中如上所述的变体epsp合酶的背景中，术语“具有epsp合酶活性”是指与野生型或天然epsp合酶相比酶活性不受影响或基本上不受影响的epsp合酶。在某些实施方式中，酶活性是野生型epsp合酶活性的至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，最优选至少90％，如至少95％。酶活性可以通过本领域已知的手段测量。

抗草甘磷作物携带编码草甘膦不敏感形式的epsps的基因，其获得自土壤杆菌属(agrobacteriumsp.)菌株cp4(funket,hanh,healy-friedml,fischerm,schonbrunne:molecularbasisfortheherbicideresistanceofroundupreadycrops.procnatlacadsciusa2006,103(35):13010-13015.；padgettesr,kolaczkh,delannayx,redb,lavalleebj,tiniuscn,rhodeswk,oteroyi,barrygf,eichholtzdaetal:development,identification,andcharacterizationofaglyphosate-tolerantsoybeanline.cropsci1995,35(5):1451-1461.)。土壤杆菌属cp4菌株分离自草甘膦生产设施的废料(waste-fed)柱，产生草甘膦抗性的动力学有效的epsp合酶，其适用于生产转基因的草甘膦耐受的作物。自此描述了其它ii类epsp合酶，通常来自革兰氏阳性细菌，包括病原体如肺炎链球菌(streptococcuspneumonia)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)。感兴趣的是，活性位点中的单个残基(ala-100，基于大肠杆菌(e.coli)蛋白质编号)使得cp4epsp合酶对草甘膦不敏感，而在已知的天然植物和细菌酶中的此位置发现了高度保守的甘氨酸残基。

如本文所用，术语“草甘膦除草剂”是指包含草甘膦或草甘膦衍生物的组合物，包括可转化为活性草甘膦的化合物。草甘膦也被称为n-膦酰基甲基甘氨酸，并且其酸形式具有以下结构：

由于其酸形式的草甘膦相对不溶于水(在25℃下为1.16wt％)，通常将其配制成水溶性盐。通常将其配制成一元盐、二元盐或三元盐。草甘膦的多种盐、草甘膦盐的制备方法、草甘膦或其盐的配制剂以及草甘膦或其盐用于杀灭和控制杂草和其它植物的方法在美国专利no.4,507,250、美国专利no.4,481,026、美国专利no.4,405,531、美国专利no.4,315,765、美国专利no.4,140,513、美国专利no.3,977,860、美国专利no.3,853,530和美国专利no.3,799,758中公开。

典型的草甘膦盐包括例如单(异丙基铵)(ipa)盐，钾盐，钠盐，单乙醇铵(mea)盐，三甲基锍(tms)盐，铵盐，二铵盐，正丙胺盐、乙胺盐、乙二胺盐和己撑二胺盐。最广泛使用的草甘膦盐是ipa盐。具有草甘膦的ipa盐作为有效成分的monsanto公司的商业除草剂包括和除草剂。这些除草剂是水性溶液浓缩制剂，并且通常在施用到植物叶子之前由使用者在水中稀释。如本发明中所用，商业配制的tms盐用于例如zeneca(syngenta)的除草剂中，配制的钾盐用于例如powermax中，并且配制的铵盐用于例如中(www.roundup.it/roundup_max.php)。草甘膦盐通常与表面活性剂共同配制，以使除草效力最大化。例如见wo96/032839。

在某些实施方式中，本文所用的草甘膦除草剂包含草甘膦或其衍生物，其中所述衍生物选自盐、酯、酰胺或烷基酰胺。在某些实施方式中，草甘膦盐是碱金属盐，如(单、二或三)钠盐或(单、二或三)钾盐。在某些实施方式中，草甘膦盐是铵盐或二铵盐，如二甲基铵；烷基胺盐，如c1-c16烷基胺盐，如二甲胺、乙胺、乙二胺、己撑二胺、正丙胺和异丙胺盐；烷基铵盐，如c1-c16烷基铵盐，如二甲基铵盐和异丙基铵盐，如单异丙基铵盐(ipa)；链烷醇胺盐，如c1-c16链烷醇胺盐，如(一、二或三)乙醇胺盐，如单乙醇铵盐(mea)。在某些实施方式中，草甘膦盐是烷基锍盐，如三甲基锍盐(tms)，氧化锍盐。在某些实施方式中，草甘膦除草剂包括草甘膦或其任何衍生物、特别是如上所述的盐的混合物或组合。

在某些方面，草甘膦除草剂以足以控制(例如抑制生长)抽苔甜菜、杂草甜菜或一年生甜菜的剂量施用于本文所述的本发明的方法和用途中。在某些实施方式中，此剂量是至少300g/ha(草甘膦等价物)，例如至少600g/ha，优选至少900g/ha的剂量，更优选至少1000g/ha的剂量，甚至更优选至少1100g/ha的剂量，最优选至少1200g/ha的剂量或1200g/ha的剂量。此剂量优选是指单次施用剂量。将理解在生长季节期间可能需要多于一次施用，如两次施用或三次施用。此类后续施用的剂量可与第一次施用的剂量相同或不同。

如本文所用，术语“草甘膦酸当量”是指草甘膦除草剂制剂理论上可以转化回相应的酸或母体酸的部分，或草甘膦酸从已配制为衍生物(如酯、盐、胺等)的草甘膦除草剂中的理论产量。草甘膦酸当量可以通过草甘膦母体酸的分子质量(去质子化状态下的分子质量为168)与配制的草甘膦产物(通常是衍生物，如盐)的分子质量之比计算。例如，草甘膦异丙胺的分子量为228，其分数为168/228＝0.7368草甘膦母体酸(去质子化)。草甘膦异丙胺的浓度或量乘以分数0.7368得出草甘膦酸当量的浓度或量。因此，例如5kg草甘膦异丙胺的草甘膦酸当量为3.684kg。

在某些方面，本发明涉及耐受草甘膦(和任选的als抑制剂)，特别是剂量足够高以实现最佳除草活性的草甘膦的甜菜植物。在某些实施方式中，本文所述甜菜植物耐受至少300g/ha剂量，如至少600g/ha、优选至少900g/ha剂量、更优选至少1000g/ha剂量、甚至更优选至少1100g/ha剂量、最优选至少1200g/h的剂量或1200g/ha剂量的草甘膦(例如草甘膦酸当量)。在某些实施方式中，如本文所述的甜菜植物耐受相当于35g/ha甲酰胺磺隆和7g/ha碘磺隆-甲基钠草甘膦的混合物的als抑制剂剂量。优选地，所述剂量是单次施用剂量。应理解，如果在生长季节需要多次施用，根据本发明的甜菜植物优选耐受所述多次施用。优选地，根据本发明的耐受草甘膦(和任选的als抑制剂)的甜菜植物在其它重要的农艺特性如生长、产量、品质、病原体抗性、生理功能等方面无弊端。

草甘膦(或als抑制剂)耐受例如可以通过基于从0(死植物)至9(完全不受影响的植物)的级别对植物活力和植物萎黄病进行目测损害评级而确定，如在施用草甘膦后2周对各植物进行评级。0-3的级别是易感植物的特征。3-7的级别表示低至中等的耐受水平，8或9的级别表示良好的耐受水平。特别地，级别具有以下含义：9，与未处理的对照植物相同的未受影响的植物；8，仅叶尖上很小的坏死，受影响和发黄的叶面积少于5％；7，叶尖很小的坏死，叶开始卷曲；低于5％的叶面积受影响并发黄；6、5、4，坏死和叶片卷曲增加；叶变得比正常叶小；3、2，无或非常有限的叶生长；所有叶卷曲并且受到坏死影响；1，植物无生长；植物的至多5％保持绿色；0，植物死亡。在某些优选的实施方式中，根据本发明的甜菜植物具有至少3，优选至少7、更优选至少8、甚至更优选为9的级别。

在某些实施方式中，与本文别处所述的相应野生型甜菜植物或抽苔甜菜、杂草甜菜、一年生甜菜相比，根据本发明的甜菜植物对草甘膦(或草甘膦除草剂)及任选als抑制剂除草剂较不敏感。在某些实施方式中，根据本发明的甜菜的敏感性低至少10倍，如敏感性低100倍，更优选500倍，甚至更优选1000倍，最优选低2000倍。当在本文中使用时，低敏感性可被视为“更可耐受”或“更有抗性”，反之亦然。类似地，“更可耐受”或“更有抗性”可被视为“低敏感”，反之亦然。

在某些实施方式中，根据本发明的甜菜植物具有epsp合酶，其酶活性不受或基本上不受草甘膦的影响。在某些实施方式中，根据本发明的甜菜植物具有epsp合酶，其酶活性在存在草甘膦的条件下与不存在草甘膦的条件下相比减少最多50％，优选减少最多40％，更优选减少最多30％，甚至更优选减少最多20％，最优选减少最多10％，例如减少最多5％。酶活性可以通过本领域已知的手段测量。酶活性优选在草甘膦(或草甘膦除草剂)存在的情况下以相关的适用除草剂量确定，如对应于田间施用至少300g/ha如至少600g/ha的剂量，优选至少900g/ha的剂量，更优选至少1000g/ha的剂量，甚至更优选至少1100g/ha的剂量，最优选至少1200g/ha的剂量或1200g/ha的剂量。

如本文所用，als(乙酰乳酸合酶；也称作ahas(乙酰羟酸合酶)；ec2.2.1.6；先前的ec4.1.3.18))参与两个丙酮酸分子转化为乙酰乳酸分子和二氧化碳。反应使用硫胺素焦磷酸以连接两个丙酮酸分子。此反应的所得产物乙酰乳酸最终变成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(singh(1999)"biosynthesisofvaline,leucineandisoleucine",inplantaminoacids,singh,b.k.,ed.,marceldekkerinc.newyork,newyork,pp.227-247)。als的抑制剂中断植物中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。结果是各个氨基酸库立即耗尽，引起蛋白质生物合成的停止，导致植物生长的中止，并最终使植物死亡或至少被破坏。

在某些实施方式中，野生型甜菜als具有如ncbi参考序列xp_010695365.1(seqidno:21)提供的氨基酸序列。在某些实施方式中，野生型或天然甜菜als具有与ncbi参考序列xp_010695365.1的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％的序列相同性的氨基酸序列，并且优选具有als活性，条件是第569位的氨基酸残基是色氨酸，任选第188位的氨基酸残基是脯氨酸。

在某些实施方式中，野生型甜菜als基因具有编码如ncbi参考序列xp_010695365.1.提供的氨基酸序列的序列。在某些实施方式中，野生型或天然甜菜als基因具有编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列优选在全长上与ncbi参考序列xp_010695365.1的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％如至少99％的序列相同性，并且优选具有epsp合酶活性，条件是第569位的氨基酸残基是色氨酸，并且任选第188位的氨基酸残基是脯氨酸。

优选地，如本文所用，其中氨基酸残基位置是针对als提及的，编号对应于参考序列xp_010695365.1中的氨基酸位置。seqidno:9对应于具有w569l突变的xp_010695365.1的序列。seqidno:12对应于具有w569l突变和p188s突变的xp_010695365.1的序列。

可以在本发明的某些实施方式中使用的属于als抑制剂类别的除草化合物包括(a)磺酰脲类除草剂(beyere.metal.(1988),sulfonylureasinherbicides:chemistry,degradation,andmodeofaction；marceldekker,newyork,1988,117-189)，(b)磺酰氨基羰基三唑啉酮除草剂(pontzen,r.,pflanz.-nachrichtenbayer,2002,55,37-52)，(c)咪唑啉酮除草剂(shaner,d.l.,etal.,plantphysiol.,1984,76,545-546；shaner,d.l.,ando'connor,s.l.(eds.)theimidazolinoneherbicides,crcpress,bocarato,fl,1991),(d)三唑并嘧啶除草剂(kleschick,w.a.etal.,agric.foodchem,1992,40,1083-1085)，以及(e)嘧啶基(硫代)苯甲酸盐/酯除草剂(shimizu,t.j.,pestic.sci.,1997,22,245-256；shimizu,t.etal.,acetolactatesyntehaseinhibitorsinherbicideclassesindevelopment,boger,p.,wakabayashi.k.,hirai,k.,(eds.),springerverlag,berlin,2002,1-41)。

在某些实施方式中，als抑制剂选自磺酰脲，磺酰基氨基羰基三唑啉酮，三唑并嘧啶，磺酰苯胺，咪唑啉酮，嘧啶基氧基苯甲酸，嘧啶基硫代苯甲酸。可在本发明的某些方面中使用的其它als抑制剂在例如wo2014/090760、wo2012/049268、wo2012/049266、ep2627183和wo2014/091021中描述，每个以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方式中，als抑制剂选自wo/2012049266的权利要求2-4中列出的als抑制剂，均以引用的方式明确地并入本文。

在某些实施方式中，赋予对als抑制剂的抗性的合适的突变als如ep2931902和wo2012/049268中所述，其以引用的方式整体并入本文。在某些实施方式中，非草甘膦或非als抑制剂除草剂可与草甘膦和/或als抑制剂除草剂组合使用。在某些实施方式中，各除草剂的施用(i)共同或同时进行，或(ii)在不同时间和/或以多个部分进行(顺序施用)，在出苗前施用随后在出苗后施用，或在出苗后早期施用随后在出苗后中期或后期施用。在某些实施方式中，除草剂选自杀草敏(chloridazon)，烯草酮(clethodim)，炔草酯(clodinafop)，炔草酯-炔丙基，二氯吡啶酸(clopyralid)，塞草酮(cycloxydim)，甜菜安(desmedipham)，二甲吩草胺(dimethenamid)，二甲吩草胺-p，乙呋草黄(ethofumesate)，恶唑禾草灵(fenoxaprop)，恶唑禾草灵-p，恶唑禾草灵-乙基，恶唑禾草灵-p-乙基，吡氟禾草灵(fluazifop)，吡氟禾草灵-p，吡氟禾草灵-丁基，吡氟禾草灵-p-丁基，草丁膦(glufosinate)，草丁膦铵，草丁膦-p，草丁膦-p-铵，草丁膦-p-钠，吡氟氯禾灵(haloxyfop)，吡氟氯禾灵-p，吡氟氯禾灵-乙氧基乙基，吡氟氯禾灵-p-乙氧基乙基，吡氟氯禾灵-甲基，吡氟氯禾灵-p-甲基，还草定(lenacil)，苯嗪草酮(metamitron)，甜菜宁(phenmedipham)，甜菜宁-乙基，喔草酯(propaquizafop)，氯甲喹啉酸(quinmerac)，喹禾灵(quizalofop)，喹禾灵-乙基，喹禾灵-p，喹禾灵-p-乙基，喹禾糠酯(quizalofop-p-tefuryl)，烯禾啶(sethoxydim)。

在某些方面，本发明涉及本发明的甜菜植物的细胞液泡，以及储存在其中的内含物质。此外，本发明还涉及提取自细胞、优选本发明甜菜植物细胞，并且优选以下作物之一的细胞的细胞提取物：糖用甜菜，食用甜菜或甜菜根。不能从所述细胞提取物中再生植物。本发明同样涵盖植物基因组，其包含根据本发明的核酸。不能从所述植物基因组中再生植物。因此，相对于不是根据本发明的细胞但属于相同物种或作物的细胞，来自所述细胞提取物的糖浓度可增加。这尤其在施用草甘膦除草剂的条件下适用。本发明还涵盖细胞提取物在用于生产糖(蔗糖)或生产汁，优选甜菜根汁中的用途。

本发明的另一方面是包含本发明的甜菜植物的种子的原种。可对原种和种子进行技术处理。因此，本发明还包括经技术处理的原种和经技术处理的种子。经技术处理的原种的多种实施方式在以下详细解释，其中术语原种也包括种子：经技术处理的原种也以抛光形式存在。种子的最外层由此被除去，从而种子呈更圆形的形式。这在播种时是有帮助的，其中最佳均匀形状导致播种机均匀分配原种颗粒。经技术处理的原种进一步涵盖丸型原种。原种由此包埋在粒化物质中，其保护其中所含的原种并且导致更大的质量，由此粒化原种显示对风吹(winddrift)的更强的抵抗能力并因此更不易被风吹走，同时在播种期间更精确定位。在本发明的优选实施方式中，指定销售的批次或单位的所有粒化原种颗粒具有基本相同的形状和相同的质量。直径和质量的5％偏差是可能的。然而，偏差优选不超过1％。作为主要组分之一，粒化物质可含有例如矿物化合物，如粘土、膨润土、高岭土、腐殖质和/或泥炭。可以加入粘合材料如聚酰胺。额外可能的组分在us4,067,141中引用。另外，粒化物质可含有额外的在实践中积极影响栽培的化学制剂。这些制剂此处可以是计为施肥制剂的物质。这些制剂包括富含一或多种下列元素的化合物：氮、磷和钾(常量营养元素)。因此，施肥成分可含有例如硝态氮、铵态氮、硝酸镁、硝酸铵钙、磷酸一铵，磷酸一钾和硝酸钾。此外，丸型块可含有杀真菌剂、杀虫剂和/或拒食剂。杀真菌剂可以是福美双(thiram)和/或恶霉灵(hymexazol)和/或其它杀真菌剂。杀虫剂可以是来自新烟碱组的物质。来自新烟碱组的物质优选是吡虫啉(atc代码：qp53ax17)和/或噻虫胺(cas编号210880-92-5)。此外，杀虫剂也可以是氟氟氰菊酯(cas编号68359-37-5)，高效氟氟氰菊酯或七氟菊酯(tefluthrin)。值得一提的是，肥料或粒化物质中包含的化合物被植物吸收，并表现出系统作用，从而为整个植物提供了适当的保护。因此，从包含一种或多种农药的丸型种子中产生的植物与天然存在的植物不同，并且在生物胁迫条件下表现出更好的性能。在此背景中，本发明还涵盖了根据本发明的粒化物质和种子的混合物。此外，本发明还涵盖了用于生产根据本发明的粒化种子的方法，包括以下步骤：a)提供本发明的甜菜植物的种子，b)将甜菜植物种子包埋在粒化物质中，以及c)使粒化物质干燥，其中种子可以是任选地经预备或预发芽的种子，或可在步骤b)期间对种子进行预备。

粒化的原种是经拌种(dressed)的原种的具体实施方式。在此背景下，经技术处理的原种还涵盖经拌种的原种。然而，本发明不限于粒化的原种，而是可与任何形式的经拌种的原种一起施用。因此，本发明还涉及经拌种的原种，包括粒化的原种，但不限于此。因此也涵盖干式拌种、湿式拌种和悬浮拌种。拌种因此还可含有至少一种染料(着色)，由此可将经拌种的原种与未经拌种的原种快速区分开，并且此外在播种之后确保在环境中的良好可见性。拌种还可含有描述为球状物质背景的农药。因此，本发明因此包括此类经拌种的原种，其中拌种含有至少一种拒食剂如杀虫剂和/或至少一种杀真菌剂。可选地，可应用所谓的电子拌种(通过施加电能进行拌种)。然而，严格来讲电子拌种不是拌种。

经技术处理的原种的额外形式是结壳的原种。在此背景中也论及已知为包衣以及经包衣处理的原种。与粒化原种的不同在于种子颗粒保持其原始形状，其中此方法特别经济。该方法例如在ep0334258a1中描述。经技术处理的原种的额外形式是发芽或经预备的原种。发芽的原种是通过预发芽进行预处理，而预备的原种是通过预备(“发芽”)进行预处理。预发芽和经预备的原种的优势在于较短的出苗时间。同时，播种后出苗的时间点更明显同步。这样使得在栽培期间、尤其是收获期间能够进行更好的农业技术加工，并且额外增加了产量。在预发芽时，原种发芽直至胚根离开原种外壳，继而该过程停止。在预备时，该过程在胚根离开原种外壳前停止。与预发芽的原种相比，已进行了预备处理的原种对重干燥的压力不敏感，并且在此类重干燥后，与预发芽的原种相比具有更长的储存期，为此通常不建议重新干燥。在此背景下，经技术预处理的原种还包括经预备和重新干燥的原种。在us4,905,411a中阐述了预发芽的过程。预备的多种实施方式在ep0686340a1中阐述。除此之外，还可以在一个过程中同时丸化和预备原种。此方法在ep2002702b1中描述。另外粒化的经预备的原种也涵盖在本发明中。

除此之外，本发明还涵盖混合物，其含有根据本发明的原种或根据本发明的种子以及如上定义的拌种物质。因此，拌种物质优选以如上定义的粒化物质呈现。

在根据本发明的原种的储存中，优选选择不负面影响原种的稳定性或存储期的存储条件。在此，湿度的波动尤其可能具有不利的影响。本发明的部分是将原种经同时防水和透气地存储在袋或容器中的方法。此类袋子或容器可被设计为纸箱或包装。此类纸箱或包装可任选地具有内部防潮层。如果纸箱或包装设计为双层，其稳定性会提高。包含根据本发明的原种或根据本发明的经技术处理的原种的容器、袋、纸箱或包装同样是本发明的部分。同样，本发明的部分是将根据本发明的原种或根据本发明的经过技术处理的原种存储在此类袋、容器、包装或纸箱中。

当在本文中使用时，术语“序列”涉及核苷酸序列、多核苷酸、核酸序列、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，取决于使用术语“序列时的背景。术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，并且指核苷酸即任何长度的聚合非支链形式的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者组合。如本领域技术人员易于理解的，核酸序列包括有义和反义链两者的dna、cdna、基因组dna、rna，合成形式和混合的聚合物，或可含有非天然或衍生的核苷酸碱基。

“分离的核酸”应理解为从其天然或原始环境分离的核酸。该术语还包括合成的人造核酸。

当在本文中使用时，术语“多肽”或“蛋白质”(两个术语在本文可互换使用)意味着涵盖给定长度的氨基酸链的肽、蛋白质或多肽，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。然而，本发明还涵盖此类蛋白质/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键被功能类似物，以及除20个基因编码的氨基酸外的氨基酸，如硒代半胱氨酸置换。肽、寡肽和蛋白质可称为多肽。术语多肽还涉及且不排除多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此类修饰在基础教材和更详细的专著以及研究文献中已经充分描述。

氨基酸取代涵盖氨基酸改变，其中氨基酸被不同的天然氨基酸残基置换。此类取代可被分类为“保守”，其中野生型蛋白质中含有的氨基酸残基由具有相似特征的另一天然存在的氨基酸置换，例如或本发明所涵盖的取代也可以是“非保守取代”，其中野生型蛋白质中存在的氨基酸残基由不同性质的氨基酸，如来自不同基团的天然存在的氨基酸(例如用丙氨酸取代带电荷或疏水性氨基酸)取代。如本文所用，“相似氨基酸”是指具有相似氨基酸侧链的氨基酸，即具有极性、非极性或实际上中性侧链的氨基酸。如本文所用，“非相似氨基酸”是指具有不同氨基酸侧链的氨基酸，例如具有极性侧链的氨基酸与具有非极性侧链的氨基酸是非相似的。极性侧链通常倾向于存在于蛋白质表面，在此其可以与细胞中发现的水性环境相互作用(“亲水性”氨基酸)。另一方面，“非极性”氨基酸倾向于驻留在蛋白质的中心，在此其可以与相似的非极性相邻氨基酸相互作用(“疏水性”氨基酸)。具有极性侧链的氨基酸的实例是精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，组氨酸，赖氨酸，丝氨酸和苏氨酸(除半胱氨酸是疏水性外均是亲水性氨基酸)。具有非极性侧链的氨基酸的实例是丙氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸和色氨酸(除甘氨酸是中性外均是疏水性氨基酸)。

当在本文中使用时，术语“基因”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语包括双链和单链dna和rna。其还包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、一个或多个天然存在的核苷酸由类似物取代。优选地，基因包含编码本文定义的多肽的编码序列。“编码序列”是当置于或处于适当的调控序列控制下被转录成mrna和/或翻译成多肽的核苷酸序列。编码序列的边界由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mrna、cdna、重组核酸序列或基因组dna，而内含子在某些情况下也可存在。

如本文所用，术语“内源”是指存在于其天然基因组位置的基因或等位基因。术语“内源”可以与“天然”互换使用。然而这并不排除与野生型等位基因存在一或多个核酸差异。在特定的实施方式中，与野生型等位基因的差异可以限于小于9个核苷酸、优选小于6个、更特别优选小于3个核苷酸差异。更特别地，与野生型序列的差异可以仅在一个核苷酸上。优选地，内源性等位基因编码与野生型蛋白质具有小于9个氨基酸、优选小于6个、更特别优选小于3个、甚至更优选仅一个氨基酸差异的修饰的蛋白质。

如本文所用，术语“纯合子”是指在一或多个或所有基因座上具有相同等位基因的单个细胞或植物。当提及特定基因座或基因使用该术语时，其至少意味着基因座或基因具有相同的等位基因。如本文所用，术语“纯合的”是指当相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传条件。如本文所用，术语“杂合子”是指在一或多个或所有基因座上具有不同等位基因的单个细胞或植物。当提及特定基因座或基因使用该术语时，其至少意味着基因座或基因具有不同的等位基因。如本文所用，术语“杂合的”意味着当不同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座时存在的遗传条件。

如本文所用，“等位基因”是指与基因的不同形式或任何种类的可鉴别的遗传元件相关的多种遗传单位的替代形式，其在遗传上是可替代的，因为其位于同源染色体的相同基因座上。在二倍体细胞或生物中，给定基因(或标记)的两个等位基因通常占据一对同源染色体上的相应基因座。

“标记”是标记与性状基因座(影响性状的基因座)之间的遗传或物理图谱(上找到位置的手段)，或连锁。可经由检测多态性等位基因及其遗传作图，或通过被物理作图的序列的扩增、杂交或序列匹配获知所述标记检测的位置。标记可以是dna标记(检测dna多态性)，蛋白质(检测编码的多肽的变异)或简单遗传的表型(如“蜡质”表型)。可以从基因组核苷酸序列或从表达的核苷酸序列(例如从剪接的rna或cdna中)产生dna标记。根据dna标记技术，标记可由位于基因座侧翼的互补引物和/或与基因座的多态性等位基因杂交的互补探针组成。术语标记基因座是标记检测到的基因座(基因、序列或核苷酸)。“标记”或“分子标记”或“标记基因座”也可用于表示足够独特以表征基因组上特定基因座的核酸或氨基酸序列。任何可检测的多态性状可以用作标记，只要其是差异遗传并且表现出与感兴趣的表型性状的连锁不平衡即可。

检测群体成员之间的遗传多态性的标记是本领域熟知的。标记可以通过其检测到的多态性的类型以及用于检测多态性的标记技术来定义。标记类型包括但不限于例如限制性片段长度多态性(rflp)的检测，同工酶标记的检测，随机扩增的多态dna(rapd)，扩增片段长度多态性(aflps)，简单序列重复(ssr)的检测，植物基因组的扩增的可变序列的检测，自维持的序列复制或单核苷酸多态性(snp)的检测。可以例如通过dna测序，基于pcr的序列特异性扩增方法检测snp，通过等位基因特异性杂交(ash)、动态等位基因特异性杂交(dash)、分子信标、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶测定、flap内切核酸酶、5'内切核酸酶、引物延伸、单链构象多态性(sscp)或温度梯度凝胶电泳(tgge)检测多核苷酸多态性。dna测序如焦磷酸测序技术具有能够检测构成单倍型的一系列连锁snp等位基因的优势。单倍型往往比snps具有更多信息(检测到更高水平的多态性)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指在群体中的标记基因座处发现的多个多态核苷酸序列之一。关于snp标记，等位基因是指在个体植物中在snp基因座处存在的特定核苷酸碱基。

如本文所用，术语“序列相同性”是指任何给定的核酸序列与靶核酸序列之间的相同性程度。序列相同性百分比是通过确定比对的核酸序列中匹配的位置数，将匹配的位置数除以比对的核苷酸总数，再乘以100而计算。匹配位置是指在比对的核酸序列中相同位置处出现相同核苷酸的位置。还可以确定任何氨基酸序列的百分比序列相同性。为确定百分比序列相同性，使用含有blastn和blastp的单机版blastz的blast2sequences(bl2seq)程序将靶核酸或氨基酸序列与鉴定的核酸或氨基酸序列进行比较。可以从fish&richardson的网站(www.fr.com/blast)或美国政府的国家生物技术信息中心网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得单机版blastz。可以在blastz随附的自述文件中找到解释如何使用bl2seq程序的说明。bi2seq使用blastn或blastp算法在两个序列之间进行比较。

blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列，将选项设置如下：-i设置为含有待比较的第一核酸序列的文件(例如c:\seql.txt)；-j设置为含要比较的第二核酸序列的文件(例如c:\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何期望的文件名(例如c:\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；并且其它所有选项保留其默认设置。以下命令将生成输出文件，其含有两个序列之间的比较：c:\b12seq-ic:\seql.txt-jc:\seq2.txt-pblastn-oc:\output.txt-q-1-r2.。如果靶序列与鉴定的序列的任何部分共享同源性，指定的输出文件将这些同源性区域呈现为比对序列。如果靶序列与鉴定的序列的任何部分不共享同源性，指定的输出文件不呈现比对序列。一旦进行比对，通过对与来自鉴定的序列的序列(其从任何匹配位置开始并在任何其它匹配位置结束)比对的靶序列的连续核苷酸的数目进行计数来确定长度。匹配的位置是在靶序列和鉴定的序列中均存在相同核苷酸的任何位置。由于缺口不是核苷酸，不对靶序列中出现的缺口进行计数。同样，由于对靶序列核苷酸而不是来自鉴定的序列的核苷酸进行了计数，不对鉴定的序列中出现的缺口进行计数。特定长度上的百分比相同性是通过对该长度上匹配位置的数目进行计数并将该数目除以长度，然后将结果值乘以100来确定的。例如，如果(i)将500个碱基的核酸靶序列与目标核酸序列进行比较，(ii)bl2seq程序呈现了来自与目标序列区域比对的靶序列的200个碱基，其中该200个碱基区域的第一个和最后一个碱基匹配，以及(iii)在这200个比对的碱基中的匹配数为180，则500个碱基的核酸靶序列含有长度为200及在该长度上的序列相同性为90％(即180/200×100＝90)。应理解，与鉴定的序列比对的单个核酸靶序列内的不同区域可以各自具有其自身百分比相同性。应注意百分比相同性值四舍五入至最接近的十分之一。例如，将78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入为78.1，而将78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入为78.2。还应注意长度值始终为整数。

“分离的核酸序列”或“分离的dna”是指不再存在于其分离的天然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞或植物核或质体基因组中的核酸序列。当本文提及“序列”时，应理解具有此类序列的分子是指例如核酸分子。“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化细胞”是指由于至少一个核酸分子被导入所述细胞中而产生的新的个体细胞(或生物体)。宿主细胞优选是植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可含有作为染色体外(游离型)复制分子的核酸，或包含整合进宿主细胞的核或质体基因组中的核酸，或作为导入的染色体，例如微染色体。

当提及与参比序列具有“实质的序列相同性”或与参比序列具有至少80％，例如至少85％、90％、95％、98％或99％核酸序列相同性的核酸序列(例如dna或基因组dna)时，在一个实施方式中所述核苷酸序列被认为与给定核苷酸序列基本相同，并且可以使用严格的杂交条件来鉴定。在另一实施方式中，核酸序列与给定核苷酸序列相比包含一个或多个突变，但仍可以使用严格的杂交条件来鉴定。“严格的杂交条件”可用于鉴定与给定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件取决于序列，并且在不同情况下有所不同。通常，选择的严格条件在定义的离子强度和ph下比特定序列的热熔点(tm)低约5℃。tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在定义的离子强度和ph下)。通常，选择的严格条件是其中盐浓度在ph7下为约0.02摩尔，并且温度至少为60℃。降低盐浓度和/或提高温度会增加严格性。rna-dna杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的northern印迹)是例如包括在0.2xssc中在63℃下洗涤20分钟至少一次，或等同条件。rna-dna杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的southern印迹)是例如包括在0.2xssc中在至少50℃、通常是大约55℃下洗涤20分钟至少一次(通常2次)或等同条件。也见sambrooketal.(1989)和sambrookandrussell(2001)所述。

术语“杂交”意味着其中单链核酸分子自身附着于互补核酸链，即与此碱基配对一致的过程。杂交的标准程序描述于例如sambrooketal.(molecularcloning.alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,3rdedition2001)。优选地，这将被理解为意味着至少50％、更优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％、更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸链的碱基与互补核酸链形成碱基对。此类结合的可能性取决于杂交条件的严格性。术语“严格性”是指杂交条件。高严格性是碱基配对较难，低严格性是在便于碱基配对时。杂交条件的严格性取决于例如盐浓度或离子强度和温度。通常，可以通过提高温度和/或降低盐度来提高严格性。“严格的杂交条件”定义为其中主要仅在同源核酸分子之间发生杂交的条件。术语“杂交条件”不仅涉及在核酸在主要条件下的实际结合，也涉及在随后的洗涤步骤的最普通条件下的结合。严格杂交条件是例如主要仅具有至少70％、优选至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％序列相同性的核酸分子杂交的条件。不太严格的杂交条件包括：在37℃下于4×ssc中杂交，然后在室温下于1×ssc中重复洗涤。严格的杂交条件包括：在65℃下于4×ssc中杂交，然后在65℃下于0.1×ssc中重复洗涤，共大约1小时。

一方面，本发明还涉及提供草甘膦抗性或耐受的甜菜植物的方法。此类方法可涉及诱变。在某些实施方式中，epsp合酶基因的核酸修饰是通过随机诱变实现的。细胞或生物体可暴露于诱变剂如uv辐射或诱变化学品(例如甲磺酸乙酯(ems))，然后选择具有期望的特性的突变体。例如，可以通过tilling(靶向诱导的基因组中的局部损伤)来鉴定突变体。该方法将诱变如使用化学诱变剂如甲磺酸乙酯(ems)的诱变与识别靶基因中的单个碱基突变/点突变的敏感dna筛选技术结合。tilling方法依赖于dna异源双链体的形成，dna异源双链体是通过pcr扩增多个等位基因，然后加热并缓慢冷却而形成的。在两条dna链的错配处形成“气泡”，然后由单链核酸酶切割。然后将产物如通过hplc按大小分离。也参见mccallumetal.“targetedscreeningforinducedmutations”；natbiotechnol.2000apr；18(4):455-7和mccallumetal.“targetinginducedlocallesionsingenomes(tilling)forplantfunctionalgenomics”；plantphysiol.2000jun；123(2):439-42。在某些实施方式中，突变的epsp合酶可以通过靶向诱变(如本领域已知的基因编辑技术，包括crispr/cas(例如crispr/cas9或crisprcpf1)、锌指核酸酶、大范围核酸酶或talen基因编辑技术)获得。

一方面，本发明涉及如本文所述检测或鉴定根据本发明的epsp(或als)突变的方法。可以采用任何检测手段，如本文别处所述，包括例如测序、基于杂交的方法(例如(动态)等位基因特异性杂交，分子信标，snp微阵列)、基于酶的方法(例如pcr、kasp(竞争性等位基因特异性pcr)、rflp、alfp、rapd、flap内切核酸酶、引物延伸、5'核酸酶、寡核苷酸连接测定)、基于dna物理性质的扩增后方法(如单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳)、变性高效液相色谱法、整个扩增子的高分辨率融合、dna错配结合蛋白的使用、snplex、surveyor核酸酶测定)等。

在某些实施方式中，检测通过kasp进行。在某些实施方式中，kasp标记是s1txepss02(seqidno:17-19)。优选地，此种kasp标记物可用于检测引起bvepsps中p179s氨基酸改变的甜菜的内源性epsps基因中的单核苷酸点突变。

如本文所用，“发酵”是指使用微生物将有机分子转化为另一分子的过程。例如，“发酵”可以指将来自植物材料如本发明的植物材料的糖或其它分子有氧转化以产生醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡萄糖酸)；酮(例如丙酮)、氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如h2和co2)、抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、b12、β-胡萝卜素)和/或激素。发酵包括消费性酒精工业(例如啤酒和葡萄酒)中使用的发酵。发酵还包括厌氧发酵，例如用于生产生物燃料。发酵可以通过适合用于期望的发酵步骤的任何生物体(包括但不限于细菌、真菌、古生菌和原生生物)来完成。合适的发酵生物包括可以将单糖、二糖和三糖、特别是葡萄糖和麦芽糖或任何其它生物质衍生的分子直接或间接转化为期望的发酵产物(例如乙醇、丁醇等)的生物。合适的发酵生物还包括可以将非糖分子转化为期望的发酵产物的生物体。此类生物体和发酵方法是本领域技术人员已知的。

如本文所用，术语“生物燃料”是指衍生自生物质的燃料，所述生物质即活的或最近活的生物有机体，如植物或动物废物。生物燃料包括但不限于生物柴油，生物氢，生物气体，生物质衍生的二甲基呋喃(dmf)等。特别地，术语“生物燃料”可以用于指植物来源的醇，例如乙醇、甲醇、丙醇或丁醇，如期望可在使用前将其变性。术语“生物燃料”也可以用来指包括植物来源的燃料的燃料混合物，例如乙醇/汽油混合物(即乙醇汽油)。乙醇汽油可以包含任何期望的百分比的植物来源的乙醇(即约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％植物来源的乙醇)。例如，一种可用的基于生物燃料的混合物是e85，其包含85％的乙醇和15％的汽油。生物燃料可以是通过对植物材料进行有氧或厌氧发酵产生的任何生物燃料。通过有氧发酵获得的生物燃料的一个非限制性实例是生物乙醇。可通过厌氧发酵获得的生物燃料包括但不限于生物气体和/或生物柴油。有氧和/或厌氧发酵的方法是本领域技术人员已知的。本发明进一步涵盖选自通过用于生产一种或多种生物燃料的方法或本发明方法生产的乙醇、生物气体和/或生物柴油的生物燃料。

本发明包括其它工业应用，如在本发明的甜菜植物中生产抗体或生物塑料。此外，本发明的甜菜植物或其部分也可以不经进一步处理而用作例如牛饲料。

术语“糖”是指可发酵的单糖、二糖和三糖，特别是单糖和二糖。因此，在本发明中糖包括但不限于蔗糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖，优选蔗糖。

以下非限制性实施例进一步支持本发明的各方面和实施方式。

实施例

用0.5％ems和0.3％和0.5％enu分别诱变6kg甜菜优良品系t807(3bt1760，m0群体)的种子，然后进行钻孔(drilled)以产生苗(steck)。将苗重新种植以产生种子，占5.8ha的面积。m1群体规模为ems75,000株种子生产植物以及enu诱变的种子19,000株植物。已获得以下m2种子量(给定值的纯化种子)：0.5％ems240kg(标识a和b)，0.3％enu548kg(标识c和d)以及0.5％enu256kg(标识e和f)。

在大约15ha跨度的田间播种176kg标识a和b以及75kg标识c、d、e和f种子。播种大约1个月后，整个田间喷洒0.88l/ha的max(680g/kg草甘膦酸当量)。大约6周后，在田间收集存活于草甘膦处理的植物，将其移植到盆中并在温室中进一步栽培。在约2个月后，用600g/ha草甘膦酸当量处理存活的植物。172株植物以非常健康的阶段存活于处理，没有任何除草剂损害的迹象。

为鉴定观察到的除草剂抗性背后的原因性突变，进行了测序分析。尤其是，在所有存活的172株植物中，将甜菜中的epsp合酶基因的外显子2进行pcr扩增(引物bvepsps_ex_2_for，5′-ggaaatttccatcctaacgag-3’(seqidno：13)，和bvepsps_ex_2_rev，5’-gcaagaggaaacaagtctcca-3’(seqidno：14))及sanger测序(引物bvepsps_ex2_seqf，5’-catcctaacgagaattatgc-3’(seqidno：15)，和bvepsps_ex2_seqr，5’-gtctccacacaaaataaaag-3’(seqidno：16))。标识符为6ms1008-109的甜菜植物携带c-t突变，引起bvepsps中p179s氨基酸变化。此种人工snp已使用计算机模拟开发的kasp标记s1txepss02(seqidno：17-19)通过kasp标记测定单独确认：

seqidno：17kasp-markers1txepss02-primer_allel_c

gaaggtgaccaagttcatgctcagcaactgcagctgtcaatgg

seqidno：18kasp-markers1txepss02-primer_allel_t

gaaggtcggagtcaacggattaacagcaactgcagctgtcaatga

seqidno：19kasp-markers1txepss02-primer_common

ctttttcttggaaatgcaggaacagcaat

seqidno：1提供了突变epsp合酶基因的基因组dna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起p179s氨基酸改变的突变。seqidno：2提供了突变epsp合酶基因的cdna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起p179s氨基酸改变的突变。seqidno：3提供了突变epsp合酶基因的蛋白质序列，其携带根据本发明某些实施方式的p179s突变。seqidno：4提供了突变epsp合酶基因的基因组dna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起p179s氨基酸改变的突变和引起t175i氨基酸改变的突变。seqidno：5提供了突变epsp合酶基因的cdna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起p179s氨基酸改变的突变和引起t175i氨基酸改变的突变。seqidno：6提供了突变epsp合酶基因的蛋白质序列，其携带根据本发明某些实施方式的p179s突变和t175i突变。

seqidno：1基因组dnaepspsp179s

seqidno:2cdnaepspsp179s

seqidno:3蛋白质epspsp179s

seqidno:4基因组dnaepspst175ip179s

seqidno:5cdnaepspst175ip179s

seqidno:6蛋白质epspst175ip179s

seqidno:7提供了突变als基因的基因组dna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起w569l氨基酸改变的突变。seqidno:8提供了突变als基因的cdna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起w569l氨基酸改变的突变。seqidno:9提供了突变als基因的蛋白质序列，其携带根据本发明某些实施方式的w569l突变。seqidno:10提供了突变als基因的基因组dna核苷酸序列，其携带导致根据本发明某些实施方式的引起w569l氨基酸改变的突变和引起p188s氨基酸改变的突变。seqidno:11提供了突变als基因的cdna核苷酸序列，其携带根据本发明某些实施方式的引起w569l氨基酸改变的突变和引起p188s氨基酸改变的突变。seqidno:12提供了突变als基因的蛋白质序列，其携带根据本发明某些实施方式的w569l突变和p188s突变。

seqidno:7基因组dnaalsw569l

seqidno:8cdnaalsw569l

seqidno:9蛋白质alsw569l

seqidno:10基因组dnaalsp188sw569l

seqidno:11cdnaalsp188sw569l

seqidno:12蛋白质alsp188sw569l

根据筛选和选择方法，存在非常强的迹象表明bvepsps中的杂合p179s突变赋予了对600g/ha草甘膦酸当量的完全抗性，大约为50％的标准田间处理水平。将杂合突变体回交并自交，并收获种子。进行了草甘膦抗性水平的首次滴定，以表征选择的突变体。p179s突变在杂合和纯合状态赋予草甘膦抗性。

序列表

<110>科沃施种子欧洲股份两合公司

<120>控制杂草甜菜和其它杂草的方法

<130>kws0288pct1

<150>ep18196607.8

<151>2018-09-25

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tagttgatatcttgatgattaactccttttgaagtttgactacacaccaaccccaaacac1080

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aggctgttaatattcttttattttgtgtggagacttgtttcctcttgctacaattgcaaa3180

gggggctgggattgattaacaatgcagaactcaaacactatctttggtatcaccgtctgg3240

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tgggacttgggagtatagcctcaatgttatagaagattgtgctatactactgtaaaatta3360

acttttggttggaaccagatatagttaataaagtatttttttatctggtgaggggtgctt3420

ctaggtcctgaaaagttccaccatagaaaaaaattgaatttcattgtgaaaagctaaggt3480

gaattcattaaattcaatacatgttgttgattgcttgaactagaatacttcagatatcag3540

ttaattgaatttatttcttttggagaacatgcatgaagagcttttaactcgcctctacta3600

tcctgctcttaattatttttataaatagatttagcaattgggaatatcctgtaatttgct3660

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