病毒载体的自动化生产的制作方法

本公开提供了一种在全封闭式细胞工程系统内利用工程化的生产病毒载体的细胞系生产病毒载体的自动化方法。可以生产的示例性病毒载体包含慢病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。

背景技术：

病毒载体作为基础研究工具和用于基因治疗都至关重要。例如，安全性和长期表达能力使腺相关病毒(aav)成为用于人类基因疗法的优秀病毒载体。类似地，慢病毒载体是基因和细胞疗法领域最常用的递送方法之一。然而，生产大多数病毒载体的传统手段昂贵、耗时且繁琐。此外，依赖于桥接平台(如aav)或多重瞬时转染(如慢病毒)的方法的载体产率可能太低或需要太多的质粒dna而对于大多数治疗应用而言不可行。另外，对于小规模病毒载体生产，可能不需要或不期望大的分批过程。

病毒载体生产自动化的益处包含与使用自动化相关联的劳动时间节省以及改进的产品一致性、减少的室分类、减少的洁净室占地面积、降低的培训复杂性以及改进的扩大和跟踪物流。此外，可以使用软件通过使用自动生成的电子批记录提供所有处理设备、试剂、操纵子标识、过程中传感器数据等的历史记录来简化记录过程。

其中工程化哺乳动物细胞最佳地生产病毒载体的自动化的、自含式系统将革新基因疗法领域。迫切需要将允许对大规模或小规模批量生产进行病毒生产控制、提供可再现且稳定的结果、同时限制污染并降低成本的技术。

技术实现要素：

在一些实施例中，本文提供的是一种用于腺相关病毒(aav)病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将工程化哺乳动物aav病毒生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统中，所述工程化哺乳动物aav病毒生产细胞包含整合到其基因组中的以下各项：腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的e2a基因和e4orf6基因；aav基因，所述aav基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的rep基因和cap基因；在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码rna；以及所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件；用对所关注基因进行编码的载体转导所述哺乳动物aav病毒生产细胞以生产经转导的病毒生产细胞；用所述阻遏子元件的结合配偶体处理所述哺乳动物aav病毒生产细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；扩增所述经转导的病毒生产细胞并且在所述经转导的病毒生产细胞内生产所述aav病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

本文还提供了一种用于腺相关病毒(aav)病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：用以下转导稳定表达一种或多种对tetr和/或tetr-krab进行编码的核酸的哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对包括在第一可去阻遏启动子的控制下的e2a基因、e4orf基因和病毒相关非编码rna的腺病毒辅助基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对包括在第二可去阻遏启动子的控制下的rep基因和cap基因的aav基因进行编码；以及任选地第三核酸，所述第三核酸对在第三可去阻遏启动子的控制下的所关注基因进行编码；用所述tetr的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；扩增经转导的细胞并且在所述经转导的细胞内生产所述aav病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

在另外的实施例中，本文提供的是一种用于慢病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统中，所述工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞包含整合到其基因组中的以下各项：在第一启动子的控制下的慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)基因；在第二启动子的控制下的慢病毒包膜基因；以及在第三启动子的控制下的慢病毒组特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因两者，其中核酸序列通过由转座子特异性反向末端重复序列(itr)的重组产生的序列侧接在5'端和3'端两者上。用对所关注基因进行编码的载体转导所述哺乳动物慢病毒载体生产细胞以生产经转导的病毒生产细胞；活化所述第一启动子、所述第二启动子和所述第三启动子；扩增所述经转导的病毒生产细胞并且在所述经转导的病毒生产细胞内生产所述慢病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中在封闭且自动化过程中执行(a)到(e)。

在另外的实施例中，本文提供的是一种用于慢病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将哺乳动物细胞引入到全封闭式细胞工程系统中；用以下转导哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对在第一启动子的控制下的慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)基因和在第二启动子的控制下的包膜糖蛋白基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对在第三启动子的控制下的所关注基因进行编码；以及第三核酸，所述第三核酸对在第四启动子的控制下的慢病毒组特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因两者进行编码，扩增经转导的细胞并且在所述经转导的细胞内生产所述慢病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

附图说明

图1示出了可用于生产如本文实施例中所描述的病毒载体的封闭且自动化系统。

图2示出了可用于生产如本文实施例中所描述的病毒载体的含有示例性封闭且自动化系统的实验室空间。

图3示出了病毒载体生产过程的流程图，所述病毒载体生产过程可以在如本文实施例中所描述的封闭且自动化系统中进行。

具体实施方式

在权利要求书和/或说明书中，当结合术语“包含(comprising)”使用时，词语“一个(a)”或“一种(an)”的使用可以指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(oneormore)”、“至少一个/至少一种(atleastone)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(oneormorethanone)”一致。

贯穿本申请，术语“约”用于指示值包含用于测定值的方法/装置的固有的误差变化。通常，根据情况，所述术语意在涵盖约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％可变性。

权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。

如本说明书和一项或多项权利要求中所使用的，词语“包括(comprising)”(以及包括的任何形式，如“包括(comprise和comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have和has)”)、“包含(including)”(以及包含的任何形式，如“包含(includes和include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains和contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。可设想到，本说明书中讨论的任何实施例可以相对于本发明的任何方法、系统、宿主细胞、表达载体和/或组合物来实施。此外，本发明的组合物、系统、细胞和/或核酸可以用于实现如本文所描述的方法中的任何方法。

在实施例中，本文提供的是一种用于病毒载体的自动化生产的方法。本文所描述的自动化方法适当地在全封闭式细胞工程系统中进行。

如本文所描述的，“全封闭式细胞工程系统”是指封闭系统，所述封闭系统适当地包含多个室，并且其中本文所描述的各种方法的步骤中的每个步骤在细胞工程系统的所述多个室中的相同或不同室中执行。适当地，在开始所述方法之前，各种细胞、载体和细胞培养基中的每一个都包含在所述多个室中的不同室中。细胞工程系统适当地包含一个或多个维持在用于生长细胞的温度(例如，在约37℃)下的室，并且所述多个室中的至少一个室维持在冷藏温度(例如，在约4℃-8℃)下。“全封闭式”适当地是指多个室互连，包含通过各种管道或其它流体连接的通路和连接，以维持全封闭式系统的清洁和适当的无菌。

如本文所描述的，在实施例中，所提供的方法利用cocoon平台(傲克生物技术公司(octanebiotech)(金斯顿，安大略省))，所述平台将多个单元操作集成在单个统包平台中。为了提供高效且有效的自动化转译，所描述的方法利用结合多个单元操作的应用特定/赞助商特定一次性盒的概念，所有这些都集中在病毒载体产品的核心要求上。公开的美国专利申请第2019-0169572号中描述了示例性全封闭式细胞工程系统，所述美国专利的公开内容以全文引用的方式并入本文中。图1示出了可用于本文所描述的方法中的示例性全封闭式细胞工程。图2示出了可用于以高吞吐量布置生产如本文实施例中所描述的病毒载体的含有示例性封闭且自动化系统的实验室空间。在实施例中，封闭且自动化系统中的每一个都可以生产单独的且独特的病毒载体。

在实施例中，本文所描述的方法在全封闭式细胞工程系统的盒中进行，所述全封闭式细胞工程系统可以包含：用于储存细胞培养基的低温室；用于执行涉及生产病毒载体的过程的高温室，其中高温室与低温室通过热屏障隔开，所述高温室包含细胞培养室；以及连接到所述细胞培养室的一个或多个流体通路，其中流体通路提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物向细胞培养室的分配，而不干扰细胞培养室内的细胞。

图3示出了可以在如本文实施例中所描述的封闭且自动化系统中执行的病毒载体生产过程的流程图，展示了可以在封闭且自动化系统的筒内进行的各种步骤。

在实施例中，用于自动化生产的方法适当地包含将工程化病毒生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统。

如本文所提及的，所述方法中利用的“工程化病毒生产细胞”是适当地包含一种或多种对允许生产病毒载体的辅助基因或表达系统进行编码的核酸分子的细胞。

如本文所提及的，词语“引入”可以意指将工程化病毒生产细胞添加到多个室之一，或者可以指示在开始所述方法之前在盒内存在工程化病毒生产细胞。

在实施例中，本文所描述的方法被配置成执行若干轮工程化病毒生产细胞的饲喂、洗涤和监测中的一个或多个。可以以任何顺序执行这些各种活动，并且可以单独执行或与其它活动组合执行。在实施例中，细胞的浓缩包括离心、沉降后去除上清液或过滤。适当地，优化过程进一步包含适当地在自调整过程中调整离心或过滤的参数。

本文所描述的方法适当地进一步包含用对所关注基因进行编码的载体转导工程化病毒生产细胞以生产经转导的病毒生产细胞。

如本文所提及的，“转导(transduction)”或“转导(transducing)”意指将包含载体的外源核酸分子引入到细胞中。“经转导的(transduced)”细胞包括细胞内部的外源核酸分子并且诱导细胞中的表型变化。经转导的核酸分子可以整合到宿主细胞的基因组dna中和/或可以由细胞在染色体外暂时或长时间维持。表达外源核酸分子或片段的宿主细胞或生物体被称为“重组”、“经转导”、“经转染”或“转基因”生物体。许多转导和转染技术通常是本领域已知的。参见例如graham等人,《病毒学(virology)》,52:456(1973)；sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》,冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress),纽约(1989)；davis等人,《分子生物学基础方法(basicmethodsinmolecularbiology)》,爱思唯尔(elsevier)(1986)；以chu等人,《基因(gene)》,13:197(1981)。转导可以包含使用转染系统，如基于脂质体、基于脂质或基于聚合物的系统，并且也可以包含使用机械转染，如基因枪、电穿孔等。

如本文所使用的，“载体”或“表达载体”是复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，本文所描述的核酸分子可以与所述复制子连接以引起细胞中的附着核酸分子复制和/或表达。“载体”包含游离型载体(例如，质粒)和非游离型载体。术语“载体”包含用于在体外、体内或离体将核酸分子引入到细胞中的病毒手段和非病毒手段两者。术语载体可以包含合成载体。可以通过众所周知的方法将载体引入到期望的宿主细胞中，所述众所周知的方法包含但不限于转染、转导、细胞融合和脂质转染。载体可以包括各种调控元件，包含启动子。

如通过本文所描述的方法生产的“病毒载体”是指可以用于在体外、体内或离体将核酸分子引入到细胞中的产物病毒，适当地用于治疗目的或工业目的。可以采集或分离通过本文所描述的各种方法生产的病毒载体并且储存直到最终期望的应用为止。

“基因”是指对多肽进行编码并且包含cdna和基因组dna核酸分子的核苷酸的组装。“基因”还指可以充当编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列的核酸片段。在一些实施例中，基因与多个拷贝整合。在一些实施例中，基因以预定义的拷贝数整合。

如本文所提及的，术语“所关注基因”或“goi”用于描述异源基因。如本文所提及的，术语“异源基因”或“hg”在涉及如编码序列或控制序列等核酸序列时，表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关联的核酸序列，例如基因。在一些实施例中，异源基因是构建体，其中编码序列本身不是在自然界中发现的(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源dna。

适当地，所述所关注基因是在治疗上所关注的基因。如本文所使用的，“在治疗上所关注的基因”是指任何功能相关的核苷酸序列。因此，本公开的在治疗上所关注的基因可以包括对靶细胞基因组有缺陷或缺失的蛋白质进行编码或对具有期望的生物学或治疗效果(例如，抗病毒功能)的非天然蛋白质进行编码或者序列可以对应于具有反义或核酶功能的分子的任何期望的基因。合适的在治疗上所关注的基因的代表性(非限制性)实例包含用于治疗以下的在治疗上所关注的基因：炎性疾病、自身免疫性疾病、慢性疾病和传染性疾病，包含如aids、癌症、神经系统疾病、心血管疾病、高胆固醇血症等病症；各种血液病症，包含各种贫血、地中海贫血和血友病；遗传缺陷，如囊性纤维化、高雪氏病(gaucher'sdisease)、腺苷脱氨酶(ada)缺乏症、肺气肿等。本领域已经描述了可用于癌症和病毒性疾病的反义疗法的若干种反义寡核苷酸(例如，与mrna的翻译起始位点(aug密码子)周围的序列互补的短寡核苷酸)并且其也是合适的在治疗上所关注的基因的实例。

在示例性实施例中，本文所描述的方法以及因此在治疗上所关注的基因可用于生产用于极罕见疾病应用的病毒载体。此类疾病可能不需要大量病毒载体(因为可能是单个或几个患者、或数十名患者或数百名患者进行治疗)，但无菌性、可再现性和过程控制在此类应用中极为关键。本文所描述的利用封闭式自动化系统的方法允许对生产进行期望水平的控制。

在实例中，所述方法进一步包括扩增所述经转导的病毒生产细胞并且在所述经转导的病毒生产细胞内生产所述病毒载体。如本文所描述的，扩增所述经转导的病毒生产细胞的方法适当地包含饲喂、洗涤和监测中的至少一种或多种。“扩增”经转导的病毒生产细胞是指允许细胞生长直到达到预定义的期望培养物大小的各种方法。预定义的培养物大小可以包含允许生产合适的或期望数量的病毒载体的足够数量的细胞。在一些实施例中，病毒生产细胞的数量为约10⁵个细胞、约10⁶个细胞、约10⁷个细胞、约10⁸个细胞、约10⁹个细胞或约10¹⁰个细胞。

本文所描述的生产方法适当地进一步包含分离在经转导的病毒生产细胞中生产的病毒载体。分离或以其它方式采集病毒载体的方法包含收集经转导和经扩增的病毒生产细胞，并且可以包含溶解或以其它方式破坏细胞膜以及收集病毒载体。

病毒载体的分离还可以包含另外的步骤，如离心或过滤病毒生产细胞、洗涤细胞或过滤所分离的病毒载体。分离适当地包含可以依赖于过滤、离心、凝胶纯化技术、梯度分离技术等的各种分离技术。可以通过洗涤或通过将载体与表面(例如，纤维连接蛋白或纤连蛋白涂覆的表面)结合并且然后将细胞转移到不同的室中来去除病毒载体。

如本文所描述的，自动化生产方法的要素在封闭且自动化过程中适当地执行。术语“封闭”过程适当地是指使用不允许与外部环境相互作用(除非期望)的筒或其它包含的系统并且适当地是无菌过程。“自动化”过程或过程的“自动化”是指通过外部控制(包含微处理器)来控制细胞工程系统的一个或多个过程以基于定义的或预设置的一组情况或期望的特性来监测和改变参数。

在实施例中，封闭且自动化过程是自调整过程，即不需要来自外部(人)使用者的输入并且能够通过各种计算机程序和条件来确定对细胞培养物的所需修改或确定其它用于优化自动化过程的特性的过程。在实施例中，封闭且自动化过程包含用温度传感器、ph传感器、葡萄糖传感器、乳糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和光密度传感器中的一个或多个进行监测。如本文所描述的，在全封闭式细胞工程系统中使用这些不同传感器发生在系统内的不同时间和位置，并且共同工作以提供优化。例如，封闭且自动化过程可以基于监测来调整(例如，升高或降低)生产病毒的细胞培养物的温度、ph水平、葡萄糖水平、乳糖水平、氧水平、二氧化碳水平和光密度中的一个或多个。

自动化过程还可以基于起始细胞群的独特特性，包含例如总细胞数、细胞来源、细胞密度、细胞年龄等。可以在开始自动化方法之前将这些起始细胞群特性输入到计算机控制系统中，然后系统将进行各种初始修改以优化方法，例如乳糖、氧和二氧化碳浓度、流速、温育时间、ph等。可替代地，细胞过程的监测使得能够自动化表征来自起始群的细胞培养序列的进展，以使得能够根据具体情况调整条件以优化最终细胞培养性质。

在另外的实施例中，细胞工程系统使营养物、废物、释放的细胞因子和/或溶解的气体在各种方法过程期间再循环。这种再循环有助于生产期望的病毒载体。用于优化病毒载体生产的其它机制包含修改和控制提供给细胞的培养基的流速。随着细胞开始生长，所提供培养基的循环速率增加，这改善了气体交换并且允许氧和二氧化碳进入或离开细胞培养物，取决于细胞的条件和当时的要求。

在实施例中，在自动化方法中利用的工程化病毒生产细胞是哺乳动物细胞。如本文所使用的，术语“哺乳动物细胞”包含来自哺乳动物目的任何成员的细胞，例如人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞、仓鼠细胞等。在一些实施例中，细胞是小鼠细胞、人细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、chok1细胞、cho-dxb11细胞、cho-dg44细胞、chok1sv细胞(包含所有变体(例如，英国斯劳龙沙公司(lonza))、chok1svgs-ko(谷氨酰胺合成酶敲除)细胞(包含所有变体(例如，xceed^tm，英国斯劳龙沙公司)。示例性人细胞包含人胚胎肾(hek)细胞，如hek293、hek293t、hela细胞或ht1080细胞。

哺乳动物细胞包含哺乳动物细胞培养物，所述哺乳动物细胞培养物可以是贴壁培养物或悬浮培养物。贴壁培养物是指在基质表面(例如，塑料表面、平板、培养皿或其它合适的细胞培养生长平台)上生长并且可以是锚定依赖性的细胞。悬浮培养物是指可以维持在例如培养烧瓶或大的悬浮桶中的细胞，这允许用于气体和营养物交换的较大表面积。悬浮细胞培养物通常利用搅拌或搅动机构来提供适当的混合。用于维持悬浮液中的细胞的培养基和条件通常是本领域已知的。示例性悬浮细胞培养物包含人hek293克隆细胞。

在实施例中，本文中提供的病毒载体的生产方法生产腺相关病毒(aav)载体。

如本文所使用的，术语“腺相关病毒(aav)载体”是指含有细小病毒科(parvoviridae)和依赖细小病毒属(dependoparvovirus)的单链dna的小型、复制缺陷型、无包膜病毒。迄今为止，已鉴定出超过10种腺相关病毒血清型，其中血清型aav2是最佳表征的。aav血清型的其它非限制性实例为anc80、aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11。除了这些血清型之外，还开发了aav假型。aav假型含有第一血清型的衣壳和第二血清型的基因组(例如，假型aav2/5将对应于具有血清型aav2的基因组和aav5的衣壳的aav)。

如本文所提及的，术语“腺病毒”是指具有含有腺病毒科(adenoviridae)的双链dna的二十面体核衣壳的无包膜病毒。已从人类中分离出超过50种腺病毒亚型，并且已从其它哺乳动物和鸟类中分离出许多另外的亚型。参见例如ishibashi等人,“动物腺病毒(adenovirusesofanimals)”,《腺病毒(theadenoviruses)》,ginsberg编辑,纽约州纽约市普莱南出版社(plenumpress,newyork,n.y.),第497-562页(1984)；strauss,“人类腺病毒感染(adenovirusinfectionsinhumans)”,《腺病毒》,ginsberg编辑,纽约州纽约市普莱南出版社(plenumpress,newyork,n.y.),第451-596页(1984)。这些亚型属于腺病毒科，腺病毒科目前分为两个属，即哺乳动物腺病毒属(mastadenovirus)和禽腺病毒属(aviadenovirus)。所有腺病毒在形态上和结构上都类似。然而，在人类中，腺病毒示出不同的免疫性质，并且因此分为血清型。已经广泛地研究了腺病毒的两种人类血清型，即av2和av5，并且已经提供了关于腺病毒的大部分一般信息。

在实施例中，本文中提供的病毒载体的生产方法生产慢病毒载体。

如本文所提及的，术语“慢病毒载体”是指具有小球形状、含有属于逆转录病毒科(retroviridae)的两个单链rna分子的包膜病毒。慢病毒含有gag、pol和env基因，并且通过具有两个调控基因tat和rev进一步区别于其它逆转录病毒家族成员。慢病毒载体作为分子生物学中的有用工具在培养细胞和动物组织中诱导所关注基因的表达是本领域中广泛已知的。

在实施例中，本文中提供的病毒载体的生产方法生产逆转录病毒载体。

如本文所提及的，术语“逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个或多个成员，所述一个或多个成员是具有小球形状、含有两个单链rna分子的包膜病毒。逆转录病毒将其rna分子转化为dna，然后将所述dna整合到受感染细胞的宿主基因组中。基于逆转录病毒的载体在用于癌症治疗的基因疗法领域是众所周知的，其中免疫细胞被重新编程以靶向和破坏癌细胞。

在实施例中，本文中提供的病毒载体的生产方法生产杆状病毒载体。

如本文所提及的，术语“杆状病毒”是指杆状病毒科(baculoviridae)的一个或多个成员，所述一个或多个成员是含有环状dsdna的棒状病毒并且已知主要在昆虫幼虫内感染和复制。杆状病毒表达载体系统是公认的，并且对于在真核细胞中生产蛋白质非常有用(summers等人,2006)。

在另外的实施例中，所述方法适当地利用昆虫细胞作为病毒生产细胞。如本文所提及的，“昆虫细胞”适当地指源自昆虫的细胞，如但不限于用于蛋白质的表达和制造和/或杆状病毒载体生产的鳞翅目(lepidopteran)成员。

在实施例中，所述方法适当地利用sf9细胞。如本文所提及的，“sf9细胞”是源自草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)的蛹卵巢组织的昆虫细胞系，所述昆虫细胞系通常用于蛋白质的表达和制造和/或杆状病毒载体生产。

在实施例中，通过本文所描述的方法生产的病毒载体的量为至少约10¹⁰个病毒载体。例如，通过本文所描述的方法生产的病毒载体的量为至少约10¹⁰个病毒载体、或至少约10¹¹个病毒载体、或至少约10¹²个病毒载体、或至少约10¹³个病毒载体、或至少约10¹⁴个病毒载体、或约10¹⁰-10¹⁴个病毒载体、或约10¹⁰-10¹³个病毒载体、或约10¹⁰-10¹²个病毒载体、或约10¹⁰个、约10¹¹个、约10¹²个或约10¹³个病毒载体。

在实施例中，本文所描述的方法用于生产腺相关病毒(aav)病毒载体。此类过程适当地包括将工程化哺乳动物aav病毒生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统中。aav病毒生产细胞适当地包含整合到其基因组中的腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的e2a基因和e4orf6基因。

在于2018年12月21日提交的美国临时申请62/783,589和于2019年6月25日提交的美国临时申请62/866,092以及于2019年12月18日提交的美国非临时专利申请第16/719,251号中详细描述了在用于生产aav病毒载体的方法中适当地利用的示例性工程化哺乳动物aav病毒生产细胞，所述文献中的每一个的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

如本文所描述的，适当地在所述方法中利用的哺乳动物aav病毒生产细胞包含对病毒辅助基因进行编码的核酸分子。病毒辅助基因包含各种腺病毒病毒基因、疱疹病毒基因和博卡病毒基因(参见例如guido等人,“人类博卡病毒：当前知识和未来挑战(humanbocavirus:currentknowledgeandfuturechallenges)”,《世界胃肠病学杂志(worldj.gateroenterol)》22:8684-8697，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中)。在示例性实施例中，病毒辅助基因是腺病毒辅助基因。如本文所提及的，术语“腺病毒辅助基因”或“av辅助基因”是指由一种或多种源自一种或多种腺病毒亚型或血清型的核酸序列构成的基因，所述一种或多种核酸序列有助于腺相关病毒复制和包装。在一些实施例中，腺病毒辅助基因是e1a、e1b、e2a、e4(包含e4orf6)、va或其组合或任何其它腺病毒辅助基因。在示例性实施例中，腺病毒辅助基因包括e2a基因和e4orf6基因两者。适当地，e2a基因与e4orf6基因之间包含内部核糖体进入位点(ires)元件。ires元件在单个表达盒中的e2a基因之后启动e4orf6基因的转译，从而为构建体提供稳定性。

适当地，用于控制用于生产aav病毒载体的各种基因的转录的启动子是可去阻遏启动子。如本文所使用的，“可去阻遏启动子”是指包含功能启动子和能够结合阻遏子元件以引起功能启动子阻遏的另外的元件或序列的结构。“阻遏”是指启动子对下游编码或非编码基因序列转录启动的减少或抑制。

在另外的实施例中，aav病毒载体的自动化生产方法包括含有aav基因的工程化哺乳动物病毒生产细胞，所述aav基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的rep基因和cap基因。

如本文所提及的，术语“rep”基因是指本领域公认的对病毒的复制蛋白进行编码的aav基因组区，所述复制蛋白是复制病毒基因组共同所需的，或其功能同源物，如也已知介导aav-2dna复制的人类疱疹病毒6(hhv-6)rep基因。因此，rep编码区可以包含针对aavrep78和rep68(“rep的长形式”)以及rep52和rep40(“rep的短形式”)或其功能同源物进行编码的基因。如本文所使用的，rep编码区可以源自任何病毒血清型，如本文所描述的aav血清型。当在合适的靶细胞中表达时，只要存在的rep基因提供足够的整合功能，所述区就不需要包含所有野生型基因，但可以改变(例如，通过核苷酸的插入、缺失或取代)。参见例如muzyczka,n.,《微生物学与免疫学当前话题(currenttopicsinmicrobiol.andimmunol.)》158:97-129(1992)；以及kotin,r.m.,《人类基因疗法(humangenetherapy)》5:793-801(1994)。

如本文所提及的，术语“cap”基因是指本领域公认的对病毒的衣壳蛋白进行编码的aav基因组区。这些衣壳蛋白的说明性(非限制性)实例是aav衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。本公开中使用的cap基因可以来自任何aav血清型或aav血清型的组合。

在另外的实施例中，aav病毒生产细胞可以含有在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码rna。

在另外的实施例中，所述方法利用含有所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件的aav病毒生产细胞。

如本文所提及的，“阻遏子元件”是指能够结合启动子(或启动子附近)以减少或抑制启动子活性的蛋白质或多肽。阻遏子元件可以与阻遏子元件的底物或结合配偶体相互作用，使得所述阻遏子元件经历构象变化。阻遏子元件的这种构象变化带走了阻遏子元件减少或抑制启动子的能力，从而导致启动子的“去阻遏”，由此允许启动子继续启动转录。“功能启动子”是指在没有阻遏子元件作用的情况下将能够启动转录的启动子。可以用于本发明的实践的各种功能启动子是本领域已知的，并且包含例如pcmv、ph1、p19、p5、p40和腺病毒辅助基因的启动子(例如，e1a、e1b、e2a、e4orf6和va)。

在实施例中，所述方法适当地包括用对所关注基因进行编码的载体转导所述哺乳动物aav病毒生产细胞以生产经转导的病毒生产细胞。

在实施例中，所述方法进一步包括用所述阻遏子元件的结合配偶体处理所述哺乳动物aav病毒生产细胞。

可以用作可去阻遏启动子的示例性阻遏子元件及其对应的结合配偶体是本领域已知的，并且包含如cumate基因开关系统(cuo操纵子、cymr阻遏子和cumate结合配偶体)(参见例如mullick等人,“cumate基因开关：用于哺乳动物细胞中调控表达的系统(thecumategene-switch:asystemforregulatedexpressioninmammaliancells)”,《bmc生物技术(bmcbiotechnology)》6:43(1-18)(2006)，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中，包含其中所描述的可去阻遏启动子系统的公开内容)和本文所描述的teto/tetr系统(参见例如yao等人,“四环素阻遏子(tetr)而非tetr-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物调控哺乳动物细胞中的诱导性基因表达(tetracyclinerepressor,tetr,ratherthanthetetr-mammaliancelltranscriptionfactorfusionderivatives,regulatesinduciblegeneexpressioninmammaliancells)”,《人类基因疗法》9:1939-1950(1998)，所述文献的公开内容以全文引用的方式并入本文中)等系统。

在另外的实施例中，所述方法包括活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子。

在另外的实施例中，所述方法适当地包括扩增所述经转导的病毒生产细胞并且生产所述aav病毒载体并且随后分离所述病毒载体。

在实施例中，所述方法的步骤在封闭且自动化过程中执行。

在另外的实施例中，本文提供的是一种用于腺相关病毒(aav)病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：用以下转导稳定表达一种或多种对tetr和/或tetr-krab进行编码的核酸的哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对包括在第一可去阻遏启动子的控制下的e2a基因、e4orf基因和病毒相关非编码rna的腺病毒辅助基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对包括在第二可去阻遏启动子的控制下的rep基因和cap基因的aav基因进行编码；以及任选地第三核酸，所述第三核酸对在第三可去阻遏启动子的控制下的所关注基因进行编码；用所述tetr的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；扩增经转导的细胞并且在所述经转导的细胞内生产所述aav病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

在实施例中，在所述生产方法中利用的细胞(包含工程化哺乳动物aav病毒生产细胞)是哺乳动物细胞培养物，在一些实施例中，所述哺乳动物细胞培养物适当地是悬浮培养物。示例性哺乳动物细胞包含cho细胞或人细胞，包含hek细胞。

在另外的实施例中，aav病毒载体的自动化生产方法适当地利用包括功能启动子和两个四环素操纵子序列(teto2)的可去阻遏启动子。在此类实施例中，阻遏子元件是四环素阻遏蛋白。

在示例性实施例中，如本文所描述的，可去阻遏启动子包括功能启动子和两个四环素操纵子序列(teto2)。在两个四环素阻遏蛋白(tetr——teto2序列的阻遏子元件)与teto2序列结合之后，这些启动子几乎没有或没有转录发生。在用于tetr的结合配偶体(适当地多西环素(dox))的结合之后，tetr蛋白会改变构象，从teto2序列中释放，并且功能启动子开始其正常的转录过程，就像其自然地那样。因此，在实施例中，自动化生产方法适当地进一步包括用多西环素处理细胞，这使可去阻遏启动子活化从而允许生产病毒载体。

在实施例中，aav病毒载体的自动化生产方法包括所关注基因是在治疗上所关注的基因。

在实施例中，aav病毒载体的自动化生产方法生产至少约10¹⁰个病毒载体。例如，通过本文所描述的方法生产的aav病毒载体的量为至少约10¹⁰个aav病毒载体、或至少约10¹¹个aav病毒载体、或至少约10¹²个aav病毒载体、或至少约10¹³个aav病毒载体、或至少约10¹⁴个aav病毒载体、或约10¹⁰-10¹⁴个aav病毒载体、或约10¹⁰-10¹³个aav病毒载体、或约10¹⁰-10¹²个aav病毒载体、或约10¹⁰个、约10¹¹个、约10¹²个或约10¹³个aav病毒载体。

在另外的示例性实施例中，所公开的方法是一种用于慢病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括将工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统中。在于2019年8月23日提交的美国临时专利申请第62/890,904号中找到用于生产慢病毒载体生产细胞的方法，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

如本文所使用的，“慢病毒载体生产细胞”是指含有整合到其基因组中的生产慢病毒载体所需元件的细胞。

在实施例中，所述方法利用慢病毒载体生产细胞，所述慢病毒载体生产细胞包含整合到其基因组中的在第一启动子的控制下的慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)基因、在第二启动子的控制下的慢病毒包膜基因(包膜糖蛋白基因)以及在第三启动子的控制下的慢病毒组特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因两者。在合适的实施例中，核酸序列通过由转座子特异性反向末端重复序列(itr)的重组产生的序列侧接在5'端和3'端两者上。

如本文所公开的，慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)是促进晚期基因表达的rna结合蛋白。其对于将未剪接或单剪接的对病毒结构蛋白进行编码的mrna从细胞核运输到细胞质也很重要。

所述包膜糖蛋白基因(适当地水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因)在慢病毒载体表面上表达和展示，并且介导慢病毒载体转导到靶细胞中。

gag对从未剪接的mrna转译而来的多聚蛋白进行编码，所述多聚蛋白然后被病毒蛋白酶(pr)切割成基质蛋白、衣壳和核衣壳蛋白。由于gagmrna转译期间核糖体移码，慢病毒聚合酶(pol)表达为gag-pol多聚蛋白，并且对酶蛋白逆转录酶、蛋白酶和整合酶进行编码。这三种蛋白质与病毒粒子内的病毒基因组相关联。适当地，所述gag基因是hivgag基因，并且所述pol基因是hivpol基因。

在合适的实施例中，表达盒通过转座子特异性反向末端重复序列(itr)侧接在5'端和3'端两者上。

用于慢病毒载体生产细胞的示例性启动子是本领域已知的并且包含可去阻遏启动子，并且适当地，所述表达盒进一步对所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件进行编码。在实施例中，所述可去阻遏启动子包括功能启动子和四环素操纵子序列(teto)，并且所述阻遏子元件是四环素阻遏蛋白，如本文所描述的。

在另外的实施例中，用于生产慢病毒载体的方法包含用对所关注基因进行编码的载体转导哺乳动物慢病毒载体生产细胞。在实施例中，所述所关注基因是在治疗上所关注的基因。

在另外的实施例中，所述方法包含活化慢病毒载体生产细胞内的第一启动子、第二启动子和第三启动子并扩增经转导的病毒生产细胞。

在另外的实施例中，所述方法包含适当地分离所生产的慢病毒载体。本文描述了用于分离所生产的病毒载体的方法。

在示例性实施例中，所述方法在封闭且自动化过程中执行。

在另外的实施例中，提供了用于慢病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将哺乳动物细胞引入到全封闭式细胞工程系统中；用以下转导哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对在第一启动子的控制下的慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)基因和在第二启动子的控制下的包膜糖蛋白基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对在第三启动子的控制下的所关注基因进行编码；以及第三核酸，所述第三核酸对在第四启动子的控制下的慢病毒组特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因两者进行编码，扩增经转导的细胞并且在所述经转导的细胞内生产所述慢病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中在封闭且自动化过程中执行(a)到(d)。可以在于2019年12月18日提交的美国临时专利申请第62/949,848号中找到用于慢病毒载体的瞬时生产的方法，所述美国临时专利申请的全部公开内容以全文引用的方式并入本文中。

如本文所描述的，自动化方法适当地利用哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞是哺乳动物细胞培养物，并且在实施例中是悬浮培养物。示例性细胞包含人细胞，如hek293或hek293t细胞。

在另外的实施例中，所述方法利用包括在对四环素阻遏蛋白进行编码的序列之后的克鲁贝尔相关盒(kruppel-associatedbox)(krab)序列的核酸。

如本文所描述的，krab序列(大约75个氨基酸)适当地是来自人类锌指蛋白10的转录阻遏结构域，并且提供对阻遏子元件(适当地tetr阻遏子元件)的增加的调控。当通过dna结合结构域栓系到模板dna时，krab结构域起到转录阻遏子的作用。

在另外的实施例中，本文提供的方法进一步包括转座子特异性itr，所述转座子特异性itr为鳞翅目转座子itr。

可转座元件(转座子)可以在细胞的基因组周围移动，并且可用于插入基因以生产转基因生物体。鳞翅目转座子能够在多种物种的基因组内移动，并且可用于基因转导载体。转座子结构包含由内部重复序列(ir)、间隔子和在两端处的末端重复序列(tr)组成的复杂重复配置以及对转座酶进行编码的单个开放阅读框。

可以用于本文所描述的质粒和表达盒中的示例性鳞翅目转座子itr包含美国专利第7,105,343号中公开的那些，所述美国专利的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

在实施例中，慢病毒病毒载体的自动化生产方法生产至少约10¹⁰个病毒载体。例如，通过本文所描述的方法生产的慢病毒载体的量为至少约10¹⁰个慢病毒载体、或至少约10¹¹个慢病毒载体、或至少约10¹²个慢病毒载体、或至少约10¹³个慢病毒载体、或至少约10¹⁴个慢病毒载体、或约10¹⁰-10¹⁴个慢病毒载体、或约10¹⁰-10¹³个慢病毒载体、或约10¹⁰-10¹²个慢病毒载体、或约10¹⁰个、约10¹¹个、约10¹²个或约10¹³个慢病毒载体。

在实施例中，所述方法的步骤在封闭且自动化过程中执行，并且适当地包含用温度传感器、ph传感器、葡萄糖传感器、乳糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和光密度传感器中的一个或多个进行监测以及自动调整温度、ph水平、葡萄糖水平、乳糖水平、氧水平、二氧化碳水平和光密度中的一个或多个。

本文还提供了用根据本文所描述的各种方法生产的aav或慢病毒载体治疗哺乳动物受试者(适当地人类受试者)的方法。适当地，所述方法用于用所关注基因(包含在治疗上所关注的基因)治疗人类受试者。对人类受试者的施用可以包含例如吸入、注射或静脉内施用以及本领域已知的其它施用方法。

另外的示例性实施例

实施例1是一种用于腺相关病毒(aav)病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将工程化哺乳动物aav病毒生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统中，所述工程化哺乳动物aav病毒生产细胞包含整合到其基因组中的以下各项：腺病毒辅助基因，所述腺病毒辅助基因包括在第一可去阻遏启动子的控制下的e2a基因和e4orf6基因；aav基因，所述aav基因包括在第二可去阻遏启动子的控制下的rep基因和cap基因；在第三可去阻遏启动子的控制下的病毒相关非编码rna；以及所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件；用对所关注基因进行编码的载体转导所述哺乳动物aav病毒生产细胞以生产经转导的病毒生产细胞；用所述阻遏子元件的结合配偶体处理所述哺乳动物aav病毒生产细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；扩增所述经转导的病毒生产细胞并且在所述经转导的病毒生产细胞内生产所述aav病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

实施例2包含根据实施例1所述的方法，其中所述工程化哺乳动物aav病毒生产细胞是哺乳动物细胞培养物。

实施例3包含根据实施例2所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。

实施例4包含根据实施例1到3中任一项所述的方法，其中所述工程化哺乳动物aav病毒生产细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

实施例5包含根据实施例1到3中任一项所述的方法，其中所述工程化哺乳动物aav病毒生产细胞是人细胞。

实施例6包含根据实施例5所述的方法，其中所述人细胞是人胚胎肾(hek)细胞。

实施例7包含根据实施例1到6中任一项所述的方法，其中所述可去阻遏启动子中的每一个包括功能启动子和两个四环素操纵子序列(teto2)，并且其中所述阻遏子元件是四环素阻遏蛋白。

实施例8包含根据实施例7所述的方法，其中所述处理包括用多西环素进行处理。

实施例9包含根据实施例1到8中任一项所述的方法，其中所述所关注基因是在治疗上所关注的基因。

实施例10包含根据实施例1到9中任一项所述的方法，其中所生产的aav病毒载体的量为至少约10¹⁰个病毒载体。

实施例11包含根据实施例1到10中任一项所述的方法，其中所述封闭且自动化过程包括：用温度传感器、ph传感器、葡萄糖传感器、乳糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和光密度传感器中的一个或多个进行监测以及自动调整温度、ph水平、葡萄糖水平、乳糖水平、氧水平、二氧化碳水平和光密度中的一个或多个。

实施例12包含根据实施例1到11中任一项所述的方法，其中所述转导包括病毒感染、电穿孔、脂质体转染或膜破坏。

实施例13是一种用于腺相关病毒(aav)病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：用以下转导稳定表达一种或多种对tetr和/或tetr-krab进行编码的核酸的哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对包括在第一可去阻遏启动子的控制下的e2a基因、e4orf基因和病毒相关非编码rna的腺病毒辅助基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对包括在第二可去阻遏启动子的控制下的rep基因和cap基因的aav基因进行编码；以及任选地第三核酸，所述第三核酸对在第三可去阻遏启动子的控制下的所关注基因进行编码；用所述tetr的结合配偶体处理所述哺乳动物细胞；活化所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子；扩增经转导的细胞并且在所述经转导的细胞内生产所述aav病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

实施例14包含根据实施例13所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物细胞培养物。

实施例15包含根据实施例14所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。

实施例16包含根据实施例12到15中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。

实施例17包含根据实施例12到15中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

实施例18包含根据实施例17所述的方法，其中所述人细胞是人胚胎肾(hek)细胞。

实施例19包含根据实施例12到18中任一项所述的方法，其中所述处理包括用多西环素进行处理。

实施例20包含根据实施例12到19中任一项所述的方法，其中所述所关注基因是在治疗上所关注的基因。

实施例21包含根据实施例12到20中任一项所述的方法，其中所生产的aav病毒载体的量为至少约10¹⁰个病毒载体。

实施例22包含根据实施例12到21中任一项所述的方法，其中所述封闭且自动化过程包括：用温度传感器、ph传感器、葡萄糖传感器、乳糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和光密度传感器中的一个或多个进行监测以及自动调整温度、ph水平、葡萄糖水平、乳糖水平、氧水平、二氧化碳水平和光密度中的一个或多个。

实施例23包含根据实施例12到22中任一项所述的方法，其中所述转导包括病毒感染、电穿孔、脂质体转染或膜破坏。

实施例24是一种用于慢病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞引入到全封闭式细胞工程系统中，所述工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞包含整合到其基因组中的以下各项：在第一启动子的控制下的慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)基因；在第二启动子的控制下的慢病毒包膜基因；以及在第三启动子的控制下的慢病毒组特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因两者，其中核酸序列通过由转座子特异性反向末端重复序列(itr)的重组产生的序列侧接在5'端和3'端两者上。用对所关注基因进行编码的载体转导所述哺乳动物慢病毒载体生产细胞以生产经转导的病毒生产细胞；活化所述第一启动子、所述第二启动子和所述第三启动子；扩增所述经转导的病毒生产细胞并且在所述经转导的病毒生产细胞内生产所述慢病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

实施例25包含根据实施例24所述的方法，其中所述工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞是哺乳动物细胞培养物。

实施例26包含根据实施例25所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。

实施例27包含根据实施例24到26中任一项所述的方法，其中所述工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞是人细胞。

实施例28包含根据实施例27所述的方法，其中所述人细胞是人胚胎肾(hek)细胞。

实施例29包含根据实施例24到28中任一项所述的方法，其中所述gag基因是hivgag基因，并且所述pol基因是hivpol基因。

实施例30包含根据实施例24到29中任一项所述的方法，其中所述慢病毒包膜基因是水泡性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因。

实施例31包含根据实施例24到30中任一项所述的方法，其中所述第一启动子、所述第二启动子和所述第三启动子是可去阻遏启动子。

实施例32包含根据实施例31所述的方法，其中所述工程化哺乳动物慢病毒载体生产细胞进一步包含整合到其基因组中的所述第一可去阻遏启动子、所述第二可去阻遏启动子和所述第三可去阻遏启动子的阻遏子元件。

实施例33包含根据实施例32所述的方法，其中所述可去阻遏启动子中的每一个包括功能启动子和四环素操纵子序列(teto)，并且所述阻遏子元件是四环素阻遏蛋白。

实施例34包含根据实施例33所述的方法，所述方法进一步包括在对所述四环素阻遏蛋白进行编码的序列之后的克鲁贝尔相关盒序列。

实施例35包含根据实施例24到34中任一项所述的方法，其中所述转座子特异性itr是鳞翅目转座子itr。

实施例36包含根据实施例24到35中任一项所述的方法，其中所述所关注基因是在治疗上所关注的基因。

实施例37包含根据实施例24到36中任一项所述的方法，其中所生产的慢病毒载体的量为至少约10¹⁰个病毒载体。

实施例38包含根据实施例24到37中任一项所述的方法，其中所述封闭且自动化过程包括：用温度传感器、ph传感器、葡萄糖传感器、乳糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和光密度传感器中的一个或多个进行监测以及自动调整温度、ph水平、葡萄糖水平、乳糖水平、氧水平、二氧化碳水平和光密度中的一个或多个。

实施例39包含根据实施例24到38中任一项所述的方法，其中所述转导包括病毒感染、电穿孔、脂质体转染或膜破坏。

实施例40是一种用于慢病毒载体的自动化生产的方法，所述方法包括：将哺乳动物细胞引入到全封闭式细胞工程系统中；用以下转导哺乳动物细胞：第一核酸，所述第一核酸对在第一启动子的控制下的慢病毒病毒粒子蛋白表达调控子(rev)基因和在第二启动子的控制下的包膜糖蛋白基因进行编码；第二核酸，所述第二核酸对在第三启动子的控制下的所关注基因进行编码；以及第三核酸，所述第三核酸对在第四启动子的控制下的慢病毒组特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因两者进行编码，扩增经转导的细胞并且在所述经转导的细胞内生产所述慢病毒载体；以及分离所述病毒载体，其中所述步骤在封闭且自动化过程中执行。

实施例41包含根据实施例40所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是哺乳动物细胞培养物。

实施例42包含根据实施例41所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是悬浮培养物。

实施例43包含根据实施例40到42中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

实施例44包含根据实施例43所述的方法，其中所述人细胞是人胚胎肾(hek)细胞。

实施例45包含根据实施例40到44中任一项所述的方法，其中所述gag基因是hivgag基因，并且所述pol基因是hivpol基因。

实施例46包含根据实施例40到46中任一项所述的方法，其中所述包膜糖蛋白基因是水泡性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因，并且其中所述vsv-g基因和所述rev基因是密码子优化的。

实施例47包含根据实施例40到46中任一项所述的方法，其中所述所关注基因是在治疗上所关注的基因。

实施例48包含根据实施例40到47中任一项所述的方法，其中所生产的慢病毒载体的量为至少约10¹⁰个病毒载体。

实施例49包含根据实施例40到48中任一项所述的方法，其中所述封闭且自动化过程包括：用温度传感器、ph传感器、葡萄糖传感器、乳糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和光密度传感器中的一个或多个进行监测以及自动调整温度、ph水平、葡萄糖水平、乳糖水平、氧水平、二氧化碳水平和光密度中的一个或多个。

实施例50包含根据实施例40到49中任一项所述的方法，其中所述转导包括病毒感染、电穿孔、脂质体转染或膜破坏。

实施例51是一种根据实施例1到23中任一项所述的方法生产的aav病毒载体。

实施例52是一种根据实施例14到50中任一项所述的方法生产的慢病毒载体。

实施例53一种用aav载体进行治疗的方法，所述方法包括：向哺乳动物受试者施用根据实施例51所述的aav载体。

实施例54包含根据实施例53所述的方法，其中所述施用包括吸入、注射或静脉内施用。

实施例55是一种用慢病毒载体进行治疗的方法，所述方法包括：向哺乳动物受试者施用根据权利要求52所述的慢病毒载体。

实施例56包含根据实施例55所述的方法，其中所述施用包括吸入、注射或静脉内施用。

应当理解的是，虽然本文中已经展示和描述了某些实施例，但是权利要求不限于所描述和示出的部分的特定形式或布置。在本说明书中已经公开了说明性实施例，并且尽管采用了具体术语，但其仅用于一般性和描述性意义，而不是出于限制的目的。鉴于以上教导，对所述实施例的修改和变化都是可能的。因此，应当理解的是，可以以与具体描述的方式不同的方式实践所述实施例。

本说明书中所提及的所有公开、专利以及专利申请通过引用并入本文中，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。