制备普卡那肽的改进方法与流程

1.本发明涉及使用新型非线性固相肽合成来制备普卡那肽的改进方法。具体地，本发明的普卡那肽的制备方法涉及使用王树脂和2
‑
氯三苯甲基氯(2
‑
cltrt)树脂的5氨基酸单元和11氨基酸单元的片段的固相合成。


背景技术：

2.背景技术说明包括可能有助于理解本发明的信息。并非承认此处提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
3.普卡那肽(plecanatide)是fda批准用于治疗慢性特发性便秘(cic)和便秘型肠易激综合征的药物。普卡那肽通过cgmp的积累增加肠道转运和肠液。
4.普卡那肽是一种16残基肽，它是鸟苷酸环化酶
‑
c肽的激动剂，氨基酸序列为h
‑
asn1
‑
asp2
‑
glu3
‑
cys4
‑
glu5
‑
leu6
‑
cys7
‑
val8
‑
asn9
‑
val10
‑
ala11
‑
cys12
‑
thr13
‑
gly14
‑
cys15
‑
leu16
‑
oh。除了用glu3替代asp3外，它在结构上与人尿鸟苷素(uroguanylin)相同。cys4和cys12以及cys7和cys15之间存在二硫键。
5.pct公开wo2014197720公开了通过溶液和固相混合方法纯化或分离肽的方法，如wo2012/18972中所述。具体地，wo2014197720公开了如下合成a、b和c三个肽片段然后通过片段a、b和c的缩合组装线性肽序列：通过固相从2
‑
氯三苯甲基氯树脂制备片段a，boc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
leu
‑
oh；通过固相从2
‑
氯三苯甲基氯树脂制备片段b，fmoc
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(tbu)
‑
gly
‑
oh；通过溶液相合成来制备片段c，cys(acm)
‑
leu
‑
otbu，在溶液相中将片段b和c偶联以产生片段b
‑
c，并将片段a和b
‑
c偶联以产生线性肽a
‑
b
‑
c。部分保护的线性普卡那肽(haa1
‑
16oh)被h2o2氧化，然后用碘同时去除s
‑
acm基团和形成二硫键以得到粗品普卡那肽，将其通过rp
‑
hplc色谱纯化得到纯化的普卡那肽。
6.中国专利公开cn103694320a公开了多肽药物的制备，具体涉及普卡那肽的制备方法。该方法包括以下步骤：进行固相合成以获得fmoc
‑
leu
‑
树脂；根据普卡那肽的肽序列在fmoc
‑
leu
‑
树脂上依次偶联
‑
cys15、
‑
gly、
‑
thr、
‑
cys12、
‑
ala、
‑
val、
‑
asn、
‑
val、
‑
cys7、
‑
leu、
‑
glu、
‑
cys4、
‑
glu、
‑
asp和
‑
asn，以制备普卡那肽线性肽树脂，裂解以制备普卡那肽线性粗品肽；取普卡那肽线性粗品肽，进行一次环化和二次环化，以获得普卡那肽。
7.尽管有多种制备普卡那肽的方法可用，但线性序列中从val8起的氨基酸的偶联效率随着链长的增加而降低。因此，cys7、leu6、glu5、cys4、glu3、asp2和asn1的偶联仍然不完整，倾向于形成相关的缺失型杂质。产生的杂质仅在序列上少一个氨基酸，在纯化过程中产生接近的洗脱峰。这导致多个纯化循环，从而降低最终产品的分离产率。由于上述杂质的存在，还必须获得最终分离产品的杂质概况。
8.因此，需要开发一种改进的方法，其简单、高效且有成本效益，并且以提高的产率和纯度提供所需化合物。
9.发明目的
10.本发明的一个目的是提供一种改进的制备普卡那肽的方法，其简单、高效且有成本效益。
11.本发明的另一个目的是提供一种改进的制备普卡那肽的方法，其以提高的产率和纯度提供所需化合物。
12.本发明的另一个目的是提供一种改进的制备普卡那肽的方法，其可商业规模化以进行大规模操作。


技术实现要素：

13.本发明涉及一种制备多肽药物的方法，特别是制备普卡那肽的方法。具体地，本发明涉及一种制备普卡那肽的方法，该方法涉及使用王树脂和2
‑
氯三苯甲基氯(2
‑
cltrt)树脂的5氨基酸单元和11氨基酸单元的片段的固相合成。
14.在一方面，本发明涉及一种制备普卡那肽的方法，其包括以下步骤：
15.(a)使用合适的试剂使式(i)的直链h2n
‑
asn1
‑
asp2
‑
glu3
‑
cys4
‑
glu5
‑
leu6
‑
cys(acm)7
‑
val8
‑
asn9
‑
val10
‑
ala11
‑
cys12
‑
thr13
‑
gly14
‑
cys(acm)15
‑
leu16
‑
oh单环化，以获得式(vi)的单环肽，
[0016][0017]
(b)使用反相柱色谱纯化步骤(a)中获得的式(vi)的单环肽，
[0018]
(c)使用合适的试剂使步骤(b)中获得的式(vi)的单环肽双环化，以获得式(vii)的双环肽，
[0019][0020]
和
[0021]
(d)使用反相柱色谱将步骤(c)中获得的式(vii)的双环肽纯化并脱盐，以获得纯的普卡那肽。
[0022]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中式(i)的直链通过包括以下步骤的方法获得：
[0023]
(a)使用偶联试剂将片段a与王树脂结合的片段b偶联以获得王树脂结合的受保护的肽片段；
[0024]
(b)使用试剂三氟乙酸/三异丙基硅烷/3,6
‑
二氧杂
‑
1,8
‑
辛二硫醇(dodt)/水将步骤(a)中获得的王树脂结合的受保护的肽片段切割和脱保护，以获得式(i)的直链，h2n
‑
asn1
‑
asp2
‑
glu3
‑
cys4
‑
glu5
‑
leu6
‑
cys(acm)7
‑
val8
‑
asn9
‑
val10
‑
ala11
‑
cys12
‑
thr13
‑
gly14
‑
cys(acm)15
‑
leu16
‑
oh。
[0025]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中用于纯化单环肽的反相柱色谱具有：柱规格：250
×
80mm，介质规格：c
‑
18，10μ，100a
°
，流动相a：0.02m三乙基磷酸铵的水溶液，ph 6.5，和流动相b：乙腈。
[0026]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中用于纯化式(vii)的双环肽的
反相柱色谱具有：柱规格：250
×
80mm，介质规格：c
‑
18，10μ，100a
°
，流动相a：0.02m三乙基磷酸铵的水溶液，ph 6.5，和流动相b：乙腈。
[0027]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中用于纯化式(vii)的双环肽的反相柱色谱具有：柱规格：250
×
80mm，介质规格：c
‑
18，10μ，100a
°
，流动相a：0.1
‑
0.2％tfa的水溶液，和流动相b：乙腈。
[0028]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中用于使式(vii)的双环肽脱盐的反相柱色谱具有：柱规格：250
×
80mm，介质规格：c
‑
18，10μ，100a
°
，流动相a：0.025％氢氧化铵，流动相b：乙腈，流动相c：0.1
‑
0.25m乙酸铵的水溶液，和流动相d：0.1％tfa的水溶液。
[0029]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中单环化步骤中的合适试剂选自1％h2o2溶液。
[0030]
在另一方面，本发明涉及普卡那肽的制备方法，其中双环化步骤中的合适试剂选自2％碘溶液。
[0031]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中片段a为fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
oh或boc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cus(trt)
‑
glu(otbu)
‑
oh。
[0032]
在另一方面，本发明涉及普卡那肽的制备方法，其中王树脂结合的片段b为h2n
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂。
[0033]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中片段a的长度不超过5个氨基酸单元。
[0034]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中王树脂结合的片段b的长度不超过11个氨基酸单元。
[0035]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中使用固相肽合成来制备片段a和片段b。
[0036]
在另一方面，本发明涉及制备普卡那肽的方法，其中三氟乙酸/三异丙基硅烷/dodt/水的比例分别为体积比9:0.5:0.25:0.25。
[0037]
本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将由以下对优选实施方式的详细描述变得更加明显。
附图说明
[0038]
图1示出了制备普卡那肽的方法的一般策略的示意说明。
具体实施方式
[0039]
下面对本发明的实施方式进行详细描述。对实施方式的详细描述是为清楚地传达本发明。然而，所提供的细节量并不旨在限制实施方式的预期变化；相反，它旨在涵盖落入由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等同方式和替换方式。
[0040]
本文中的所有出版物均以引用方式并入，如同每个单独的出版物或专利申请都被具体且单独地指示为以引用方式并入。如果并入参考文献中术语的定义或用法与本文提供的该术语定义不一致或相反，则适用本文提供的该术语定义，但参考文献中该术语的定义
不适用。
[0041]
在整个说明书中对“一个实施方式”或“实施方式”的引用意味着结合该实施方式描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方式中。因此，在本说明书中不同地方出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定都指代相同的实施方式。
[0042]
此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合。
[0043]
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式的表达组分的量、性质(例如浓度、反应条件等)的数字在一些情况下应理解为受到术语“约”的修饰。因此，在一些实施方式中，说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施方式寻求实现的期望性质而变化。在一些实施方式中，数值参数应基于报告的有效数字位数并通过应用常见的四舍五入技术来解释。尽管说明本发明的一些实施方式的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施方式中阐述的数值尽可能准确地报告。在本发明的一些实施方式中呈现的数值可能包含由它们各自的测试测量中发现的标准偏差不可避免地引起的某些误差。
[0044]
如在本文的描述和随后的权利要求中所用，除非上下文另有明确规定，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数指代。此外，如本文的描述中所用，除非上下文另有明确规定，否则“在
…
中”的含义包括“在
…
之中”和“在
…
之上”。
[0045]
除非上下文另有要求，在整个以下说明书中，词语“包括”及其变体，例如“含有”和“包含”应解释为开放和包括性的意义，即“包括但不限于”。
[0046]
本文对数值范围的描述仅旨在作为一种简写方法，其单独指代落入该范围内的各个单独数值。除非本文另有说明，否则每个单独的数值都被并入到说明书中，如同在本文中单独叙述。
[0047]
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。本文针对某些实施方式提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不对所要求保护的发明的范围施加限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指明任何未要求保护的要素对本发明的实施是至关重要的。
[0048]
此处公开的本发明的替代要素或实施例的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独地或与组的其他成员或本文中发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员可以包含在一个组中或从一个组中删除。当发生任何此类包含或删除时，说明书在此被视为包含修改后的组从而满足书面要求。
[0049]
下文的描述以及本文描述的实施方式是通过说明本发明的原理和方面的特定实施方式的一个或多个实例的方式提供的。提供这些实例是出于解释这些原理和本发明的目的，而非进行限制。
[0050]
还应当理解，本公开可以以多种方式实现，包括作为系统、方法或设备。在本说明书中，这些实施方式或本发明可以采用的任何其他形式可以被称为方法。通常，在本发明的范围内可以改变所公开方法的步骤的顺序。
[0051]
本文提供的本发明的标题和摘要仅为方便起见，并不对实施方式的范围或含义进行解释。
[0052]
以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施方式。尽管每个实施方式代表发明要素的单个组合，但认为本发明主题包括所公开的要素的所有可能的组合。因此，如果一个实施方式包括要素a、b和c，而第二个实施发生包括要素b和d，则本发明的主题也被认为包括a、b、c或d的其余组合，即使没有明确披露。
[0053]
如本文所用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语在下文未定义，则应给予相关领域技术人员给出的最广泛定义，如提交申请时的印刷出版物和已授权专利中所反映的那样。
[0054]
如本文所用，术语“王树脂(wang resin)”是指基于聚乙烯的树脂，优选包含基于对烷氧基苯甲醇或对烷氧基苄氧基羰基酰肼的树脂。王树脂通常在强酸条件下去除，例如至少50％三氟乙酸溶液。王树脂的实例包括但不限于h
‑
leu
‑
王树脂或游离树脂。
[0055]
如本文所用，术语“肽”是指含有至少两个氨基酸的化合物，其中一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基连接(即两个氨基酸通过肽键连接)。如本文所用，术语“肽”包括其中羧基和/或氨基被保护或未受保护的氨基酸序列。氨基酸羧基的合适保护基包括otbu、obzl或ofm。氨基酸氨基的合适保护基包括fmoc、boc、mmt、mtt、cbz或trt。
[0056]
如本文所用，术语“片段”是指存在于普卡那肽中的两个或更多个氨基酸的序列。片段中的氨基酸可以受保护或未受保护。
[0057]
除非另有说明，术语“受保护的肽”或“受保护的肽片段”是指其中氨基酸的所有反应性基团都被保护基团掩蔽的肽或肽片段。n
‑
末端氨基酸的合适保护基包括9
‑
芴基甲氧羰基(fmoc)、叔丁氧羰基(boc)、苯甲酰基(bz)、乙酰基(ac)和苄基(bn)。优选地，n
‑
末端保护基是fmoc或boc，更优选地是fmoc。c
‑
末端氨基酸的合适保护基包括三苯甲基(三苯基甲基，trt)和o
‑
叔丁基(otbu)。巯基的保护基的实例包括乙酰氨基甲基(acm)、叔丁基(tbu)、3
‑
硝基
‑2‑
吡啶硫基(3
‑
nitro
‑2‑
pyridinesulfenyl,npys)、2
‑
吡啶硫基(pyr)和三苯甲基(trt)。
[0058]
本公开的实施方式涉及改进的制备普卡那肽的方法。
[0059]
本发明涉及使用王树脂和2
‑
氯三苯甲基氯(2
‑
cltrt)树脂通过固相合成获得普卡那肽的改进方法。本发明的方法包括以所需顺序偶联合适的受保护氨基酸、切割和脱保护，然后氧化和纯化以获得普卡那肽。
[0060]
本发明的发明人开发了一种改进的方法，它是一种简单、高效和具有成本效益的方法，并以改进的产率和纯度提供所需的化合物，并且解决了与现有技术中报道的方法相关的问题。本发明的方法不涉及使用任何有毒和/或昂贵的溶剂，也不涉及使用较昂贵的偶联剂和试剂。因此，本发明提供了一种制备普卡那肽的方法，该方法简单、高效、具有成本效益、纯度高且可商业规模化用于大规模操作。
[0061]
在一个实施方式中，本发明的普卡那肽的制备方法涉及5+11片段偶联策略。具体地，本发明制备普卡那肽的方法包括将片段a与片段b偶联以获得普卡那肽。片段a使用2
‑
氯三苯甲基氯(2
‑
cltrt)树脂进行合成，片段b使用王树脂进行合成。分离的且经完全保护的片段a与王树脂结合的片段b偶联以获得王树脂结合的京完全保护的肽基片段。
[0062]
在本发明的一个实施方式中，使用切割鸡尾酒混合物三氟乙酸/三异丙基硅烷/dodt/水(tfa/tis/dodt/水)切割王树脂结合的经完全保护的肽基片段并整体脱保护以获得线性的完全脱保护的肽链。
[0063]
在一个实施方式中，本发明的片段a由五个氨基酸单元长度组成。片段a选自肽fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
oh或boc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cus(trt)
‑
glu(otbu)
‑
oh。此外，片段a表示为fmoc
‑
aa1
‑
aa5
‑
oh或boc
‑
aa1
‑
aa5
‑
oh。
[0064]
在一个实施方式中，本发明的片段b由与王树脂结合的11个氨基酸单元长度组成。王树脂结合的片段b表示为h2n
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂。片段b也表示为h2n
‑
aa6
‑
aa16
‑
o
‑
树脂。
[0065]
在一个实施方式中，本发明的方案1如图1所示，其展示了普卡那肽制备方法的一般策略的示意性描述。方案1所示的普卡那肽的制备方法包括以下步骤：片段a和片段b的固相合成、肽片段的偶联、树脂结合的肽片段的切割和脱保护、单环化、双环化和最后将双环肽脱盐以获得纯普卡那肽。
[0066]
在一个实施方式中，普卡那肽的制备方法包括以下步骤:
[0067]
(a)将片段a与王树脂结合的片段b偶联以获得王树脂结合的受保护的肽片段；
[0068]
(b)使用试剂三氟乙酸/三异丙基硅烷/dodt/水对步骤(a)中获得的王树脂结合的受保护的肽片段进行切割和脱保护，以获得式(i)的直链，h2n
‑
asn1
‑
asp2
‑
glu3
‑
cys4
‑
glu5
‑
leu6
‑
cys(acm)7
‑
val8
‑
asn9
‑
val10
‑
ala11
‑
cys12
‑
thr13
‑
gly14
‑
cys(acm)15
‑
leu16
‑
oh；
[0069]
(c)使用合适的试剂使式(i)的直链h2n
‑
asn1
‑
asp2
‑
glu3
‑
cys4
‑
glu5
‑
leu6
‑
cys(acm)7
‑
val8
‑
asn9
‑
val10
‑
ala11
‑
cys12
‑
thr13
‑
gly14
‑
cys(acm)15
‑
leu16
‑
oh单环化，以获得式(vi)的单环肽，
[0070][0071]
(d)使用反相柱色谱纯化步骤(a)中获得的式(vi)的单环肽；
[0072]
(e)将步骤(b)中获得的式(vi)的单环肽用合适的试剂双环化，以获得式(vii)的双环肽
[0073]
和
[0074]
(f)使用反相柱色谱将步骤(e)中得到的式(vii)的双环肽纯化和脱盐，以获得纯的普卡那肽。
[0075]
本发明的方法包括合适的肽片段的固相合成、随后在溶液中的片段缩合以形成线性粗品肽，以及对线性粗品肽的半胱氨酸氨基酸残基进行任选的氧化环化以形成环化的最终产物。
[0076]
本发明的片段a和b分别使用2
‑
氯三苯甲基氯(2
‑
cltrt)树脂和王树脂通过固相合成制备。上述片段可以通过标准固相肽合成技术制备，其中肽键通过第一个氨基酸的氨基(即，nh2)与第二个氨基酸的羧基(即，cooh)的直接缩合并消去一个水分子而产生。
[0077]
在一个实施方式中，王树脂在25℃至65℃的温度搅拌2至9小时与氨基酸结合。优
选地，温度为25℃至30℃搅拌7至9小时，或温度为45℃至65℃搅拌2至4小时。更优选地，温度为45℃至50℃搅拌3小时。
[0078]
在一个实施方式中，本发明的王树脂结合的片段b，h2n
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂是通过在25℃至65℃的温度搅拌20分钟至4小时使氨基酸偶联而制备的。优选地，温度为25℃至30℃搅拌2至4小时，或温度为45℃至65℃搅拌20至30分钟。更优选地，温度为45℃至50℃搅拌20分钟。
[0079]
在一个实施方式中，本发明的片段a和b的偶联涉及使用偶联剂组合。合适的偶联剂组合的实例包括但不限于n,n'
‑
二异丙基碳二亚胺
‑1‑
羟基苯并三唑(dic
‑
hobt)、六氟磷酸苯并三唑四甲基脲
‑
六氟磷酸氮杂苯并三唑四甲基脲(hbtu
‑
hatu)、六氟磷酸苯并三唑四甲基脲
‑1‑
羟基苯并三唑(hbtu
‑
hobt)、四氟硼酸苯并三唑四甲基脲
‑1‑
羟基苯并三唑(tbtu
‑
hobt)。优选地，偶联剂组合是n,n'
‑
二异丙基碳二亚胺和1
‑
羟基苯并三唑(dic
‑
hobt)。
[0080]
在一个实施方式中，使本发明的片段a和王树脂结合的片段b在25℃至65℃的温度搅拌45分钟至5小时来偶联。优选地，温度为25℃至30℃搅拌3至5小时，或温度为45℃至65℃搅拌45分钟至1小时。更优选地，温度为45℃至50℃搅拌45分钟。
[0081]
在一个实施方式中，式(i)的线性肽的单环化中的反应物料的浓度在0.5
‑
1.0mg/ml的范围内。优选地，反应物料的浓度为1.0mg/ml。
[0082]
虽然前面描述了本公开的各种实施方式，但可以在不脱离其基本范围的情况下设计本公开的其他和进一步的实施方式。本发明的范围由所附的权利要求确定。本发明不限于所描述的实施方式、版本或实例，包括所述实施方式、版本或实例是为了使本领域普通技术人员能够结合本领域普通技术人员可获得的信息和知识来制造和使用本发明。
[0083]
为清楚起见并帮助理解本文所公开并要求保护的发明，以下术语和缩写定义如下：
[0084]
boc：叔丁氧基羰基
[0085]
cbz：苄氧基羰基
[0086]
dcm：二氯甲烷
[0087]
dic：n,n'
‑
二异丙基碳二亚胺
[0088]
dipea：二异丙基乙胺
[0089]
dmf：二甲基甲酰胺
[0090]
edt：乙二硫醇
[0091]
fmoc：9
‑
芴基甲氧基羰基
[0092]
hatu：六氟磷酸氮杂苯并三唑四甲基脲
[0093]
hbtu：六氟磷酸苯并三唑四甲基脲
[0094]
hoat：羟基
‑7‑
氮杂苯并三唑
[0095]
hobt：n
‑
羟基苯并三唑
[0096]
hplc：高效液相色谱
[0097]
mtbe：甲基叔丁基醚
[0098]
obt：o
‑
苯并三唑
[0099]
obzl：o
‑
苯甲基
[0100]
otbu：叔丁基酯
[0101]
tbtu：四氟硼酸苯并三唑四甲基脲
[0102]
tbu：叔丁基
[0103]
tfa：三氟乙酸
[0104]
trt：三苯甲基
[0105]
实施例
[0106]
本发明以下列实施例的形式作进一步说明。然而，应理解以下实施例仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。
[0107]
实施例1：片段a(fmoc
‑
aa1
‑
aa5
‑
oh)的合成
[0108]
h2n
‑
glu(otbu)
‑
o
‑2‑
cltrt的合成：将2
‑
cltrt树脂(50g，取代＝1.0mmol/g树脂)装入肽合成烧瓶中并用二氯甲烷(500ml)洗涤两次。在不搅拌的情况下将树脂悬浮在二氯甲烷(dcm)(500ml)中30分钟。向树脂中加入fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh(2.0当量)、dipea(3.0当量)和dmf(500ml)的澄清混合物。将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在25
‑
30℃柔和搅动2小时。然后排干反应物料并用dmf(3x500ml)和dcm(3x500ml)洗涤树脂。所得树脂中加入10％dipea在甲醇中的混合物，将悬浮液搅拌30分钟并排干溶剂。所得树脂用dmf(3x500ml)和dcm(3x500ml)洗涤。
[0109]
向上述获得的树脂中加入20％哌啶在dmf(500ml)中的澄清混合物。将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在25
‑
30℃搅动10分钟，并排干溶剂。所得树脂进一步加入20％哌啶在dmf(500ml)中的澄清混合物，悬浮液在25
‑
30℃下搅拌10分钟，排干溶剂，树脂用dmf(3x500ml)、ipa(500ml)和dcm(3x500ml)洗涤以获得h2n
‑
glu(otbu)
‑
o
‑2‑
cltrt。通过kaiser颜色测试确认fmoc脱保护的完成。
[0110]
fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
o
‑2‑
cltrf的合成：将fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh(2.0当量)、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺(dic)(2.0当量)和1
‑
羟基苯并三唑(hobt)(2.0当量)在dmf(500ml)中的澄清混合物添加到h2n
‑
glu(otbu)
‑
o
‑2‑
cltrt中。在氮气鼓泡和温和搅拌下，在25
‑
30℃将悬浮液柔和搅动3小时。通过kaiser颜色测试监测反应的完成。反应完成后，排干溶剂并用dmf(3
×
500ml)和dcm(3
×
500ml)洗涤树脂。然后对fmoc
‑
glu(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
asp(otbu)
‑
oh和fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh或boc
‑
asn(trt)
‑
oh进行相同的偶联和fmoc脱保护过程，得到下式的2
‑
cltrt树脂结合的肽链：fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
o
‑2‑
cltrt树脂。
[0111]
fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
oh的合成：将上述步骤中获得的2
‑
cltrt树脂结合片段装入肽合成烧瓶中。在不搅拌的情况下将树脂悬浮在二氯甲烷(dcm)(500ml)中10分钟，并添加1.0％tfa的dcm溶液(4x250ml)。每次将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在25
‑
30℃柔和搅动10分钟，并将溶剂排入圆底烧瓶中。将收集的含有片段a的溶液用水洗涤两次(2
×
1000ml)并蒸发有机层。将蒸发后获得的稠浆状物质溶解在mtbe(25ml)中并通过添加正己烷(150ml)进行沉淀，以获得片段a的灰白色沉淀，fmoc
‑
aa1
‑
aa5
‑
oh。这通过巴氏漏斗(buckner funnel)过滤沉淀的固体并用正己烷(2
×
150ml)洗涤。然后将固体在真空烘箱中在35
‑
40℃于高真空下干燥至恒重。产率：90％，hplc纯度：95％。
[0112]
实施例2：片段b(h2n
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr
(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂)的合成
[0113]
h2n
‑
leu
‑
o
‑
王树脂的合成：将王树脂(15g，取代＝0.5mmol/g树脂)装入肽合成烧瓶中并用二氯甲烷(500ml)洗涤两次。在不搅拌的情况下将树脂悬浮在二氯甲烷(dcm)(500ml)中30分钟。添加fmoc
‑
leu
‑
oh(3.0当量，8.0g)、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺(3.0当量，3.5ml)和1
‑
羟基苯并三唑(3.0当量，3.5g)和dmap(0.1当量，0.09g)在dmf(75ml)中的澄清混合物。在氮气鼓泡和温和搅拌下将悬浮液在45
‑
50℃柔和搅动3小时。反应完成后，排出溶剂并用dmf(3x150ml)和dcm(3x150ml)洗涤树脂。向所得树脂中加入乙酸酐:吡啶:dcm(相对于树脂重量为0.1:0.2:9.7)的混合物。将悬浮液搅拌30分钟并排出溶剂。树脂用dmf(3x150ml)和dcm(3x150ml)洗涤。
[0114]
向在上述步骤中获得的树脂添加20％哌啶在dmf(150ml)中的澄清混合物。将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在25
‑
30℃柔和搅动10分钟，排干溶剂并进一步向树脂中加入20％哌啶在dmf(150ml)中的澄清混合物。将悬浮液在25
‑
30℃搅拌10分钟，排干溶剂并用dmf(3x150ml)、ipa(150ml)和dcm(3x150ml)洗涤树脂以获得h2n
‑
leu
‑
o
‑
王树脂。通过kaiser颜色测试确认fmoc脱保护的完成。
[0115]
h2n
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂的合成：将fmoc
‑
cys(acm)
‑
oh(2.0当量)、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺(dic)(2.0当量)和1
‑
羟基苯并三唑(hobt)(2.0当量)在dmf(500ml)中的澄清混合物加入树脂中。将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在45
‑
50℃下柔和搅动20分钟。通过kaise颜色测试监测反应进程。反应完成后，排干溶剂，用dmf(3
×
150ml)和dcm(3
×
150ml)洗涤树脂，得到h2n
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂。
[0116]
对fmoc
‑
gly
‑
oh、fmoc
‑
thr(otbu)
‑
oh、fmoc
‑
cys(trt)
‑
oh、fmoc
‑
ala
‑
oh、fmoc
‑
val
‑
oh、fmoc
‑
asn(trt)
‑
oh、fmoc
‑
val
‑
oh、fmoc
‑
cys(acm)
‑
oh和fmoc
‑
leu
‑
oh进行相同的偶联和脱保护过程，以得到片段b，h2n
‑
aa6
‑
aa16
‑
o
‑
王树脂。
[0117]
实施例3：片段a和片段b的偶联
[0118]
将fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
oh(片段a)(2.0当量，22.2g)、n,n
‑
二异丙基碳二亚胺(3.0当量，3.5ml)和1
‑
羟基苯并三唑(3.0当量，3.5g)在dmf(150ml)中的澄清混合物加入树脂中。将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在45
‑
50℃下柔和搅动45分钟。通过kaiser颜色测试监测反应进程。反应完成后，排干溶剂，用dmf(3x150ml)和dcm(3x150ml)洗涤树脂，得到fmoc
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂。所得树脂用20％哌啶在dmf(150ml)中的澄清混合物处理。将悬浮液在氮气鼓泡和温和搅拌下在25
‑
30℃柔和搅动10分钟，排干溶剂并进一步向树脂中加入20％哌啶在dmf(150ml)中的澄清混合物。将悬浮液在25
‑
30℃搅拌10分钟，排干溶剂并用dmf(3x150ml)、dcm(3x150ml)、ipa(150ml)、mtbe(3x150ml)洗涤树脂，得到h2n
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
val
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂。通过kaiser颜色测试确认fmoc脱保护的完成。
[0119]
实施例4：式(i)h2n
‑
asn
‑
asp
‑
glu
‑
cys
‑
glu
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn
‑
val
‑
ala
‑
cys
‑
thr
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
oh的合成
[0120]
在0
‑
10℃将h2n
‑
asn(trt)
‑
asp(otbu)
‑
glu(otbu)
‑
cys(trt)
‑
glu(otbu)
‑
leu
‑
cys
(acm)
‑
val
‑
asn(trt)
‑
v al
‑
ala
‑
cys(trt)
‑
thr(otbu)
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
o
‑
王树脂加入tfa:tips:dodt:水(9:0.5:0.25:0.25，体积比，220ml)的预冷却混合物中。悬浮液在25
‑
30℃温和搅拌3小时。通过烧结漏斗过滤树脂。在0
‑
10℃下将滤液加入到预冷的甲基叔丁基醚(1100ml)中。将反应混合物在0
‑
10℃搅拌30分钟并在25
‑
30℃搅拌1小时。然后过滤获得的沉淀固体并用mtbe(3x 250ml)洗涤。然后将抽吸干燥的固体在35
‑
40℃的真空烘箱中干燥至恒重，得到干燥的h2n
‑
asn
‑
asp
‑
glu
‑
cys
‑
glu
‑
leu
‑
cys(acm)
‑
val
‑
asn
‑
val
‑
ala
‑
cys
‑
thr
‑
gly
‑
cys(acm)
‑
leu
‑
oh。产率：80％，hplc纯度：50％。
[0121]
实施例5：式(vi)的单环肽的合成
[0122]
将实施例4中获得的式(i)的线性肽加入水中，保持反应物料的浓度为1mg/ml。使用氢氧化铵将反应物料的ph值调节至8.5
‑
9.5。向反应物料中加入1％h2o2溶液。在25
‑
30℃搅拌反应物料2小时。通过hplc监测反应进程。反应完成后，使用乙酸或tfa将反应物料的ph值调节至5.5
‑
6.5。通过1.2μ滤纸过滤反应物料。所得滤液经反相柱色谱纯化。反应物料的hplc纯度：55％。
[0123]
将以上获得的式(vi)的粗品单环肽加载到柱中而无需进一步稀释。反相柱色谱的细节如下。
[0124]
色谱柱规格：250x80mm
[0125]
介质规格：c
‑
18，10μ，100
‑
120a
°
[0126]
流动相a：0.02m三乙基磷酸铵的水溶液，ph 6.5，流动相b：乙腈。
[0127]
式(vi)的单环肽获自hplc纯度≥75％的级分。将hplc纯度≤75％和≥45％的级分合并用于使用相同方法重新纯化。
[0128]
实施例6：普卡那肽的合成
[0129]
将实施例5中获得的单环肽用水稀释以将反应物料的浓度维持在约0.5mg/ml。使用10％三氟乙酸的水溶液将反应物料的ph值调节至1
‑
2。向反应物料中加入作为甲醇溶液的碘(2当量)，直到反应物料的黄色维持超过10分钟。将反应物料在25
‑
30℃下搅拌2小时。通过hplc监测反应进程。反应完成后，过量的碘用抗坏血酸淬灭，反应物料的ph值用氢氧化铵调节至5.5
‑
6.5。反应物料通过1
‑
1.2μ滤纸过滤，得到粗品双环肽滤液。反应物料的hplc纯度：65％。
[0130]
将上述得到的粗品双环肽进行反相柱色谱纯化。将含有粗品双环肽的滤液用水稀释后加载至柱，使乙腈浓度保持在≤2％。反相柱色谱的细节如下。
[0131]
色谱柱规格：250x80mm
[0132]
介质规格：c
‑
18，10μ，100
‑
120a
°
[0133]
流动相a：0.02m三乙基磷酸铵的水溶液，ph 6.5或0.1％tfa的水溶液，流动相b：乙腈。
[0134]
双环肽获自hplc纯度≥94％且单一最大杂质≤3％的级分。将获得的双环肽合并用于脱盐。将具有hplc纯度≤94％和≥80％的级分合并用于使用相同方法重新纯化。
[0135]
脱盐：将上述获得的双环肽用等量的水稀释。将该溶液装入反相柱色谱脱盐。反相柱色谱的细节如下。
[0136]
介质规格：c
‑
18，10μ，100
‑
120a
°
[0137]
流动相a：0.05％氢氧化铵，流动相b：乙腈，流动相c：0.25m乙酸铵的水溶液，流动
相d：0.02m三乙基磷酸铵的水溶液，ph 6.5或0.1％tfa的水溶液
[0138]
普卡那肽获自hplc纯度≥97.5％且单个最大杂质≤1％的级分。将具有hplc纯度≤97.5％和≥5％的级分合并用于使用与上述相同的方法重新纯化。
[0139]
冻干：从脱盐获得的合并级分通过0.2μ过滤器过滤并进行冻干以获得干燥的普卡那肽。
[0140]
上述实施例仅是说明性的，不应视为对本发明范围的限制。对所公开的实施方式的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是明显的。可以在不脱离本发明的范围的情况下做出这样的变化和修改。
[0141]
本发明的优点
[0142]
本发明提供了一种改进的制备普卡那肽的方法，该方法是一种简单、高效且具有成本效益的方法。
[0143]
本发明提供了一种改进的制备普卡那肽的方法，其具有更高的产率和纯度。
[0144]
本发明提供了一种改进的制备普卡那肽的方法，其提供具有最少的或没有缺失型杂质的中间体和粗品普卡那肽。这在最终分离的普卡那肽的纯化容易性和产量方面具有优势。
[0145]
本发明通过采用11+5策略提供了改进的制备普卡那肽的方法，这导致粗品材料中的肽含量更高，否则如果遵循顺序偶联策略则将是一个挑战。
[0146]
本发明提供了改进的制备普卡那肽的方法，该方法得到纯化的单环中间体，该中间体具有高纯度和肽含量，从而在双环化和纯化过程中得到更好的产率。
[0147]
本发明提供了制备片段b的方法，其中当偶联反应在45℃下进行时，每个氨基酸的偶联时间小于30分钟。这不仅减少了反应时间，而且确保了序列中所有氨基酸的完全偶联。