一种用于液相杂交捕获测序的双链DNA探针制备方法与流程

本发明属于高通量基因测序技术领域，具体涉及一种用于液相杂交捕获测序的双链dna探针制备方法。

背景技术：

2005年lifesciences公司推出454flx焦磷酸测序平台，从此开启了高通量基因测序的新时代。高通量测序技术最显著的特征是实现了同时对几百万条甚至更多的dna分子并行测序，是对传统的sanger测序技术革命性的变革。基于sanger测序技术完成的人类基因组计划耗时10年，花费百亿资金。然而，illumina公司的高通量测序平台已经实现了24小时，花费大约1万人民币的成本完成一个人的全基因组重测序。在基因功能研究和应用领域，高通量测序技术人们对基因功能的研究的强有力工具，并且衍生出一系列的应用，例如高通量测序技术在临床方面的应用，包括肿瘤疾病诊断和用药指导，遗传疾病的筛查与诊断等。

目前人全基因组重测序的成本相对较高，在临床应用中难以普遍推广。并且临床应用的基因检测是很有针对性，只需要检测相关的目的基因。针对目标区间的靶向富集方法就应运而生，其中包括有多重pcr、液相杂交捕获、固相芯片捕获。液相杂交捕获是应用最多的方法。基于液相杂交捕获技术的杂交捕获测序方法极大的减少了测序成本，减轻了数据存储和分析的压力，实现了灵活地制定检测范围和相同成本下的更高深度的测序，提高了检测的准确性和灵敏度。

杂交捕获测序技术需要根据目标区间的dna序列设计和制备探针。常用的探针制备方法是通过寡核苷酸的化学固相合成技术合成，或者通过微阵列芯片原位合成技术合成。制备的探针质量决定着后续杂交捕获测序的数据质量。目前基于上述两种寡核苷酸合成技术的探针制备方法都存在这如下问题：人工合成的错误率高；合成的效率受序列的gc含量和序列长度的影响；随探针的长度越长，合成效率越低；合成最大长度120nt；探针池中每条探针的丰度差距大，通过多次pcr扩增会进一步的加大探针丰度的差距，影响捕获测序数据的均衡性；制备的rna探针稳定性差，对使用环境要求高。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种用于液相杂交捕获测序的双链dna探针制备方法，不依赖昂贵的合成平台，可以制备出240bp的双链dna探针，探针合成的效率不受gc含量和长度的影响，每条探针单独制备和质控，探针池中每条探针的丰度一致，使用时无需rna探针严苛的环境和操作要求，同时可以捕获目标文库dna的正反双链。

为实现上述目的，本发明的具体技术方案包括一下步骤。

1、设计与合成目标区间的特异性引物，根据目标区间的参考序列设计pcr产物长度240bp的引物，每对引物无间隔的连续设计，直至覆盖完整个目标区间，引物长度为20-25nt，每对特异性正反向引物序列的5’端分别连接特定序列，采用化学固相合成引物。

2、设计与合成5’生物素修饰的通用引物，根据目标区间的特异性引物5’端的特定序列设计一对5’生物素修饰的通用引物，采用化学固相合成引物。

3、第一轮pcr扩增，以含有靶向序列的dna为模板，利用步骤1中合成的目标区间特异性引物对和高保真的dna聚合酶扩增出每条原始探针，每条探针能与靶向序列结合的长度是240bp。

4、第二轮pcr扩增，以步骤3中的原始探针为模板，利用步骤2中合成的5’生物素修饰通用引物和高保真的dna聚合酶扩增出每条生物素修饰的探针，每条双链dna探针的两个5’端都有生物素修饰。

5、琼脂糖电泳检测步骤4中生物素修饰的探针。

6、利用核酸纯化磁珠纯化步骤4中生物素修饰的探针。

7、利用qubit荧光定量方法测定步骤6中纯化后的探针浓度。

8、将纯化后的每条探针稀释至相同的浓度，每条探针等质量混合为一个探针池。

9、探针池加热变性。

优选的，所述步骤1中特异性正反向引物序列的5’端分别连接特定序列，正向引物连接的序列为5’-gaagcgaggatcaact-3’，反向引物连接的序列为5’-tcggttcacgcaatg-3’。

优选的，所述步骤2中正向通用引物序列为5’-cactctcgaagcgaggatcaact-3’，反向通用引物序列为5’-tagacgtgtcggttcacgcaatg-3’。

优选的，所述步骤3中的pcr反应体系如下：

试剂名称单个反应用量

primestargxl0.5μl

5xpsgxlbuffer4μl

dntpmix（2.5mm）2μl

primermix（10um）2μl

模板dna（10-20ng/μl）1μl

补ddh2o至20μl。

优选的，所述步骤3中的pcr反应条件如下：

步骤循环数反应温度反应时间

1194℃2min

23298℃10sec

65℃30sec

68℃30sec

3168℃5min。

优选的，所述步骤4中的pcr反应体系如下：

试剂名称单个反应用量

primestargxl0.5μl

5xpsgxlbuffer4μl

dntpmix（2.5mm）2μl

primermix（10um）2μl

原始探针1μl

补ddh2o至20μl。

优选的，所述步骤4中的pcr反应条件如下：

步骤循环数反应温度反应时间

1194℃2min

23598℃10sec

60℃30sec

68℃30sec

3168℃5min。

优先的，所述步骤6中利用核酸纯化磁珠纯化步骤4中生物素修饰的探针，核酸纯化磁珠与生物素修饰的探针体积比为1:1。

本发明的有益效果是：不依赖昂贵的合成平台，可以制备出比120bp更长的240bp双链dna探针，探针合成的效率不受gc含量和长度的影响，制备过程简单，制备成本低。每条探针单独制备和质控，保证探针池中每条探针的丰度一致。双链dna探针使用时无需rna探针严苛的环境和操作要求，同时可以捕获目标文库dna的正反双链。能够灵活的应用于捕获任何靶向序列。

附图说明。

图1，双链dna探针制备方法流程图。

图2，实施例中第二轮pcr产物，生物素修饰的探针琼脂糖电泳检测图。

图3，实施例中69条探针对应的捕获区间的测序深度。

具体实施方法。

下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的详细描述，具体实施例是本发明的一个具体应用，而不是限定本发明的应用范围。下述实施例中的实验方法，如果无特殊说明，均为常规方法，所涉及到的试剂、材料、仪器均是本领域技术人员熟知，从商业途径可得。

实施例：人类线粒体dna液相杂交捕获的双链dna探针制备与捕获测序使用。

1、根据人类线粒体dna参考序列（ncbi网站数据库参考序列编号：nc_012920.1）设计合成目标区间的特异性引物，共设计69对引物序列（seqidno.3-seqidno.140），每对引物的5’端分别连接特定序列。设计一对5’生物素修饰的通用引物序列（seqidno.1-seqidno.2）。化学固相合成的引物干粉用te溶解为100um的原液，每对引物取10μl等体积混合，再用无核酸酶的去离子水稀释至10um的工作浓度。

2、按照常规方法从300μl的健康人外周血中提取dna，用作后续制备探针的dna模板和捕获测序的样本。

3、第一轮pcr扩增，利用69对目标区间的特异性引物和模板dna，扩增出69条原始探针。pcr试剂采用takara公司生产的高保真dna聚合酶试剂盒（货号：r050a）。pcr反应体系如下：

试剂名称单个反应用量

primestargxl0.5μl

5xpsgxlbuffer4μl

dntpmix（2.5mm）2μl

primermix（10um）2μl

模板dna（20ng/μl）1μl

补ddh2o至20μl

pcr反应条件如下：

步骤循环数反应温度反应时间

1194℃2min

23298℃10sec

65℃30sec

68℃30sec

3168℃5min。

4、第二轮pcr扩增，利用5’生物素修饰的通用引物和原始探针，扩增出69条生物素修饰的探针，每条探针的总长度是286bp。pcr试剂采用takara公司生产的高保真dna聚合酶试剂盒（货号：r050a）。pcr反应体系如下：

试剂名称单个反应用量

primestargxl0.5μl

5xpsgxlbuffer4μl

dntpmix（2.5mm）2μl

primermix（10um）2μl

原始探针1μl

补ddh2o至20μl

pcr反应条件如下：

步骤循环数反应温度反应时间

1194℃2min

23598℃10sec

60℃30sec

68℃30sec

3168℃5min。

5、采用浓度2%的琼脂糖电泳，1xtae的电泳液，电压120v，电泳时间20min，每个pcr产物电泳的上样量为2μl。电泳检测69个第二轮pcr产物。泳道中有286bp大小的目的条带，表明探针质检合格。

6、质检合格的第二轮pcr产物中加入等体积的核酸纯化磁珠，充分吸打混匀。室温孵育5min，将反应管置于磁力架上1～2min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。入200μl80%乙醇，洗涤磁珠，弃上清。室温放置5～10min至晾干。加入21μlte重悬磁珠，洗脱液转移至新离心管中，得到纯化后的探针。

7、用qubit2.0荧光计和配套的高灵敏度荧光定量试剂盒测定纯化后的69条探针浓度，并且用te将每条探针的浓度稀释至10ng/μl。

8、69条稀释后的探针各取2μl等量混合为探针池，再加入1242μl的te稀释探针池的浓度至1ng/μl。

9、稀释后的探针池95℃孵育10min，双链dna探针变性成单链状态的探针。小体积分装后-20℃冻存备用。

10、以下步骤是构建一个人的全基因组文库，然后用上述制备的线粒体dna探针捕获测序。

11、用全血提取的dna为样本，用illumina测序平台配套的建库试剂构建人全基因组文库。

12、用idt公司生产的杂交捕获试剂和线粒体dna探针，按照常规的液相杂交捕获的方法进行杂交捕获。

13、杂交捕获文库在illumina公司的novaseq6000测序仪器上进行测序，测得大约1g的数据。

14、测序数据按照常规的数据分析流程进行分析，评估杂交捕获的效果和探针制备的质量，结果：测序reads总数6183740条；比对上线粒体dna的reads数目5575451条；未比对上线粒体dna序列的reads数目608289条；捕获效率90.1%；捕获文库插入片段长度平均值261bp；测序数据的gc含量44.2%；测序数据质量q20值98.5%；测序数据质量q30值94.8%。

序列表

<110>张科

<120>一种用于液相杂交捕获测序的双链dna探针制备方法

<160>140

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cactctcgaagcgaggatcaact23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tagacgtgtcggttcacgcaatg23

<210>3

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gaagcgaggatcaactgatcacaggtctatcaccct36

<210>4

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcggttcacgcaatgtattattatgtcctacaagc35

<210>5

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gaagcgaggatcaactacaattgaatgtctgcacag36

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tcggttcacgcaatgattagtagtatgggagtggg35

<210>7

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gaagcgaggatcaactctcatcaatacaacccccgc36

<210>8

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tcggttcacgcaatgactcactggaacggggatgc35

<210>9

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gaagcgaggatcaacttcaccctctaaatcaccacg36

<210>10

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

tcggttcacgcaatggggggtgatctaaaacactc35

<210>11

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gaagcgaggatcaacttccccaataaagctaaaact36

<210>12

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tcggttcacgcaatgcctctagagggatatgaagc35

<210>13

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

gaagcgaggatcaactagcctgttctgtaatcgata36

<210>14

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

tcggttcacgcaatgcttagtttactgctaaatcc35

<210>15

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

gaagcgaggatcaactagtagagtgcttagttgaac36

<210>16

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

tcggttcacgcaatgtaggtttagctcagagcggt35

<210>17

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

gaagcgaggatcaactgccccaaacccactccacct36

<210>18

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

tcggttcacgcaatgagctcgtctggtttcggggg35

<210>19

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

gaagcgaggatcaactacctaagaacagctaaaaga36

<210>20

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

tcggttcacgcaatgtaaattttttactctctcta35

<210>21

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

gaagcgaggatcaactacacccatagtaggcctaaa36

<210>22

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

tcggttcacgcaatggttggttgattgtagatatt35

<210>23

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

gaagcgaggatcaactaagtcattattaccctcact36

<210>24

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

tcggttcacgcaatgggagccattcatacaggtcc35

<210>25

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

gaagcgaggatcaactacgagggttcagctgtctct36

<210>26

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

tcggttcacgcaatgttcgctttgactggtgaagt35

<210>27

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

gaagcgaggatcaactctactatactcaattgatcc36

<210>28

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

tcggttcacgcaatgggaggaatttgaangtagat35

<210>29

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

gaagcgaggatcaactctgtacgaaaggacaagaga36

<210>30

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

tcggttcacgcaatgtgccattgcgattagaatgg35

<210>31

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

gaagcgaggatcaactttcctaatgcttaccgaacg36

<210>32

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

tcggttcacgcaatggaggttgaccagggggttgg35

<210>33

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>33

gaagcgaggatcaactaacctaggcctcctatttat36

<210>34

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>34

tcggttcacgcaatgtgatggcaggagtaatcaga35

<210>35

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>35

gaagcgaggatcaacttgacccttggccataatatg36

<210>36

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>36

tcggttcacgcaatgatatgttgtgtagagttcag35

<210>37

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>37

gaagcgaggatcaacttttgtcaccaagaccctact36

<210>38

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>38

tcggttcacgcaatggggtttaagctcctattatt35

<210>39

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>39

gaagcgaggatcaactccttatttctaggactatga36

<210>40

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>40

tcggttcacgcaatgctcaggtaaaaaatcagtgc35

<210>41

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>41

gaagcgaggatcaacttaggcctagaaataaacatg36

<210>42

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>42

tcggttcacgcaatgagggggctattcctagtttt35

<210>43

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>43

gaagcgaggatcaactttcacttctgagtcccagag36

<210>44

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>44

tcggttcacgcaatgttattcatcctatgtgggta35

<210>45

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>45

gaagcgaggatcaacttagcagttctaccgtacaac36

<210>46

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>46

tcggttcacgcaatgtgaattcttcgataatggcc35

<210>47

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>47

gaagcgaggatcaactcaaaaaacaatagcctcatc36

<210>48

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>48

tcggttcacgcaatgtaaatttctataagattatt35

<210>49

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>49

gaagcgaggatcaactggttaaatacagaccaagag36

<210>50

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>50

tcggttcacgcaatgctcccgccttttttcccggc35

<210>51

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>51

gaagcgaggatcaactaagccccggcaggtttgaag36

<210>52

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>52

tcggttcacgcaatggagctgtgcctaggactcca35

<210>53

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>53

gaagcgaggatcaacttaagcctccttattcgagcc36

<210>54

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>54

tcggttcacgcaatggcaggagtaggagagaggga35

<210>55

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>55

gaagcgaggatcaacttcgcatctgctatagtggag36

<210>56

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>56

tcggttcacgcaatgctgctgtgattaggacggat35

<210>57

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>57

gaagcgaggatcaacttcctacttctcctatctctc36

<210>58

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>58

tcggttcacgcaatgtacctatgtatccaaatggt35

<210>59

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>59

gaagcgaggatcaacttggtctgagctatgatatca36

<210>60

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>60

tcggttcacgcaatgggccacctacggtgaaaaga35

<210>61

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>61

gaagcgaggatcaacttgactggcattgtattagca36

<210>62

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>62

tcggttcacgcaatgggccgagaaagtgttgtggg35

<210>63

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>63

gaagcgaggatcaacttatccggaatgccccgacgt36

<210>64

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>64

tcggttcacgcaatgattttatgtatacgggttct35

<210>65

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>65

gaagcgaggatcaactctagacaaaaaaggaaggaa36

<210>66

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>66

tcggttcacgcaatgaaaatgattatgagggcgtg35

<210>67

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>67

gaagcgaggatcaactccttatctgcttcctagtcc36

<210>68

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>68

tcggttcacgcaatgtcggtgtactcgtaggttca35

<210>69

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>69

gaagcgaggatcaactctacggcggactaatcttca36

<210>70

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>70

tcggttcacgcaatgtatacccccggtcgtgtagc35

<210>71

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>71

gaagcgaggatcaactctacggtcaatgctctgaaa36

<210>72

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>72

tcggttcacgcaatgatggtgggccatacggtagt35

<210>73

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>73

gaagcgaggatcaactaattacccccatactcctta36

<210>74

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>74

tcggttcacgcaatggatgagatatttggaggtgg35

<210>75

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>75

gaagcgaggatcaactaacaaccgactaatcaccac36

<210>76

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>76

tcggttcacgcaatggcgaaagcctataatcactg35

<210>77

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>77

gaagcgaggatcaacttctaagattaaaaatgccct36

<210>78

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>78

tcggttcacgcaatgtagaattagaattgtgaaga35

<210>79

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>79

gaagcgaggatcaactctgactatcctagaaatcgc36

<210>80

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>80

tcggttcacgcaatggtgtgttggttagtaggcct35

<210>81

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>81

gaagcgaggatcaacttaaccatataccaatgatgg36

<210>82

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>82

tcggttcacgcaatgggagtgggacttctagggga35

<210>83

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>83

gaagcgaggatcaacttaaacacatccgtattactc36

<210>84

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>84

tcggttcacgcaatgagccaataatgacgtgaagt35

<210>85

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>85

gaagcgaggatcaactcaactttcctcactatctgc36

<210>86

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>86

tcggttcacgcaatgttaaaattaaggcgaagttt35

<210>87

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>87

gaagcgaggatcaacttaatcaacaccctcctagcc36

<210>88

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>88

tcggttcacgcaatgctattagtggcaggttagtt35

<210>89

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>89

gaagcgaggatcaactttatgtcatccctcttatta36

<210>90

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>90

tcggttcacgcaatggtagggaggatatgaggtgt35

<210>91

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>91

gaagcgaggatcaacttatgcctagaaggaataata36

<210>92

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>92

tcggttcacgcaatgagtggtagtaatataattgt35

<210>93

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>93

gaagcgaggatcaactgacatgactttccaaaaaac36

<210>94

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>94

tcggttcacgcaatgagtttttttcgtgatagtgg35

<210>95

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>95

gaagcgaggatcaactctacctctctatactaatct36

<210>96

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>96

tcggttcacgcaatgagtgagcctagggtgttgtg35

<210>97

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>97

gaagcgaggatcaactaaacattctactactcactc36

<210>98

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>98

tcggttcacgcaatggtcagggggttgagaatgag35

<210>99

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>99

gaagcgaggatcaactaaaacacatagcctacccct36

<210>100

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>100

tcggttcacgcaatgtagtttgagtttgctaggca35

<210>101

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>101

gaagcgaggatcaactcgaacgcactcacagtcgca36

<210>102

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>102

tcggttcacgcaatggttgtggtaaatatgtagag35

<210>103

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>103

gaagcgaggatcaactacaatggggctcactcaccc36

<210>104

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>104

tcggttcacgcaatgggggcatgagttagcagttc35

<210>105

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>105

gaagcgaggatcaactcatgtctaacaacatggctt36

<210>106

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>106

tcggttcacgcaatggagactgataataaaggtgg35

<210>107

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>107

gaagcgaggatcaactttccccacaacaatattcat36

<210>108

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>108

tcggttcacgcaatgtatggtaattaggaagatga35

<210>109

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>109

gaagcgaggatcaactctaatcttagttaccgctaa36

<210>110

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>110

tcggttcacgcaatgtggattagcgtttagaaggg35

<210>111

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>111

gaagcgaggatcaactagcctcaccccactactagg36

<210>112

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>112

tcggttcacgcaatgtgcgaacagagtggtgatag35

<210>113

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>113

gaagcgaggatcaactgcagtctgcgcccttacaca36

<210>114

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>114

tcggttcacgcaatggagaggtatggttttgagta35

<210>115

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>115

gaagcgaggatcaactacttcaacctccctcaccat36

<210>116

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>116

tcggttcacgcaatgggggttattttcgttaatgt35

<210>117

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>117

gaagcgaggatcaactaccctactaaaccccattaa36

<210>118

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>118

tcggttcacgcaatggaatccgagtatgttggaga35

<210>119

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>119

gaagcgaggatcaacttaccctagcatcacacaccg36

<210>120

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>120

tcggttcacgcaatgcgggggaataggttatgtga35

<210>121

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>121

gaagcgaggatcaactagcaatctcaattacaatat36

<210>122

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>122

tcggttcacgcaatggttttagtggggttagcgat35

<210>123

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>123

gaagcgaggatcaactactcaccaagacctcaaccc36

<210>124

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>124

tcggttcacgcaatgttagtaatggggtttgtggg35

<210>125

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>125

gaagcgaggatcaactacccacactcaacagaaaca36

<210>126

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>126

tcggttcacgcaatgatttggaggatcaggcaggc35

<210>127

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>127

gaagcgaggatcaactcaccacaggactattcctag36

<210>128

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>128

tcggttcacgcaatggctatagttgcaagcaggag35

<210>129

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>129

gaagcgaggatcaactaacagccttcataggctatg36

<210>130

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>130

tcggttcacgcaatggatcccgtttcgtgcaagaa35

<210>131

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>131

gaagcgaggatcaactaaacaaccccctaggaatca36

<210>132

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>132

tcggttcacgcaatggggacggatcggagaattgt35

<210>133

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>133

gaagcgaggatcaacttaacaaactaggaggcgtcc36

<210>134

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>134

tcggttcacgcaatgaggattaggattgttgtgaa35

<210>135

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>135

gaagcgaggatcaactaataccaactatctccctaa36

<210>136

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>136

tcggttcacgcaatgtgttgatgggtgagtcaata35

<210>137

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>137

gaagcgaggatcaactaccgctatgtatttcgtaca36

<210>138

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>138

tcggttcacgcaatggctttatgtactatgtactg35

<210>139

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>139

gaagcgaggatcaactcatttaccgtacatagcaca36

<210>140

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>140

tcggttcacgcaatggtcttatttaaggggaacgt35