一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用与流程

本发明属于碱性磷酸酶的检测技术领域，具体涉及一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用。

背景技术：

碱性磷酸酶一般存在于除高等植物外几乎所有的生物体内，可直接参加磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥着重要的作用。同时，碱性磷酸酶的检测是临床常规检测项目之一，主要用于诊断肝脏和骨骼系统疾病。由于它在许多疾病的诊断中都可以作为重要的生物指标，如原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎、纤维性骨炎、骨软化病等疾病的检查。如果血清中alp值不正常，会导致某些疾病的发生，例如，骨疾病、肝癌、乳腺癌、前列腺癌症和糖尿病。因此，开发一种快速、简便、灵敏的碱性磷酸酶检测方法具有重要的现实意义。

近年来，已有多种方法用于碱性磷酸酶活性检测，包括比色法、荧光法、表面增强拉曼光谱法、电化学、化学发光方法等。在这些方法中，荧光法引起了人们相当大的关注，主要是由于方法的灵敏度高，操作方便，成本效率低，并且很容易达到一种高通量的筛选模式，遗憾的是其难以避免复杂样品尤其是生物体液本底荧光和散射光的干扰。与荧光相比，磷光具有发射寿命长、选择性好等优点，尤其对于复杂样品的测试中，其较长的激发光谱和发射光谱之间的间隙进一步降低了样品自体荧光和散射光的干扰，提高分析检测的选择性。尤其对于mn:zns量子点的磷光测试中，不需要加入除氧剂和诱导剂，大大简化了磷光分析的操作。

技术实现要素：

本发明针对现有碱性磷酸酶的检测过程复杂，成本高以及干扰大的问题，提供一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法及应用。mn:zns量子点磷光性能优异，生物相容性好，方便检测。体系的磷光强度与碱性磷酸酶浓度呈良好的线性关系，相关系数0.993。检测过程简单方便、灵敏度高、检测限低，可实现实际临床样品中碱性磷酸酶的快速灵敏检测，本发明的方法对碱性磷酸酶的检测限可达0.045u/l。

本发明采用如下技术方案：

一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法，包括如下步骤：

第一步，制备mn:zns量子点：

将β-环糊精、zn(ac)2和mn(ac)2按摩尔比为3.5:1:0.03-0.05的比例混合，用naoh调节体系的ph值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与zn(ac)2等摩尔的na2s，室温下继续反应20-30min；再将溶液加热至50-70℃，空气中陈化1-2h，得到β-环糊精包覆的mn掺杂zns量子点粗产品，以与β-环糊精包覆的mn掺杂zns量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到mn:zns量子点固体粉末；

第二步：配制mn:zns量子点母液：

称量50mgmn:zns量子点，二次去离子水定容在100ml的容量瓶中；

第三步，焦磷酸钠溶液的配制：

称量0.2330g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中，配成浓度为5.0mm的焦磷酸钠溶液，使用时用100mmol/l的ph值为8.5的tris-hcl缓冲溶液稀释至稀释10倍；

第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准溶液：分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550u/l的碱性磷酸酶标准溶液；

第五步，检测标准曲线：分别取1ml的mn:zns量子点母液、50μl的焦磷酸钠溶液和500μl的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准溶液，用tris-hcl缓冲溶液定容至5ml，30-40℃下孵育30-50min，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线590nm处的磷光强度p对碱性磷酸酶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；

第六步，待测样品碱性磷酸酶及其加标回收率的检测：

待测样品碱性磷酸酶的检测，用100mmol/l的tris-hcl缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照mn:zns量子点母液和焦磷酸钠溶液的体积比为1ml:50μl的比例，分别加入mn:zns量子点母液和焦磷酸钠溶液，按照mn:zns量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，35℃下孵育35min，倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm；

待测样品碱性磷酸酶加标回收率的检测，用100mmol/l的tris-hcl缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照mn:zns量子点母液和焦磷酸钠溶液的体积比为1ml:50μl的比例，分别加入mn:zns量子点母液和焦磷酸钠溶液，再分别加入500μl不同浓度的碱性磷酸酶标准溶液样品，按照mn:zns量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值，得出碱性磷酸酶在待测样品中的加标回收率。

一种碱性磷酸酶的室温磷光检测方法应用于血清中的碱性磷酸酶的检测。

本发明的原理如下：

该检测体系在没有碱性磷酸酶的情况下具有强烈的室温磷光发射，随着碱性磷酸酶的加入，磷光逐渐猝灭。mn:zns量子点体系中加入焦磷酸钠后，焦磷酸盐和mn:zns量子点表面zn²⁺离子的强螯合作用以及焦磷酸盐和β-环糊精之间的氢键缩短了量子点之间的距离，导致电荷从一个量子点表面陷阱转移到另一个量子点表面陷阱掺杂带的概率增加，从而使得量子点的磷光增强。碱性磷酸酶的加入使焦磷酸盐水解成正磷酸盐，螯合作用及氢键作用消失，量子点之间的距离恢复正常，使得体系的磷光逐渐猝灭。

本发明的有益效果如下：

本发明的检测方法简单、高效、经济、环保。除了具备以往mn:zns量子点磷光检测的优势，如：避免生物样品自体荧光和散射光的干扰，免除繁琐的样品预处理过程，不需要加入除氧剂和诱导剂等，本发明的检测方法还具备如下优势：

1.本发明中mn:zns量子点以β-环糊精为修饰剂，焦磷酸钠通过与环糊精的超分子相互作用及其与zn²⁺离子的强螯合作用，使得量子点之间的距离缩短，其磷光发射增强，加入碱性磷酸酶后，由于碱性磷酸酶催化水解焦磷酸盐形成正磷酸盐，量子点之间的距离恢复，从而使得量子点的磷光发生猝灭。

2.本发明中mn:zns量子点制备步骤简单，合成条件温和，不需要有机溶剂，得到的磷光量子点材料具有很好生物溶性和分散性，且室温磷光性能优良。

3.碱性磷酸酶对焦磷酸钠的水解作用、焦磷酸钠与zn²⁺离子的强螯合作用及其与环糊精的超分子相互作用使得本方法具有较好的选择性。

4.本发明提出的磷光增强型分析体系同时协同环糊精的预富集作用使得本方法的灵敏度较高，分析检测碱性磷酸酶的检出限为0.045u/l，高于其它mn:zns量子点磷光分析体系2-3个数量级，该磷光检测体系对碱性磷酸酶的响应范围为0.2-10.4u/l。

5.本发明方法可应用于血清实际样品中碱性磷酸酶的检测，其应用范围更广。

附图说明

图1为不同浓度碱性磷酸酶存在时体系的磷光光谱图；

图2为室温磷光法检测碱性磷酸酶的标准曲线；

图3为量子点/焦磷酸检测体系磷光信号对碱性磷酸酶浓度（0-55.0u/l）的散点图。

具体实施方式

实施例1，室温磷光检测人血清中的碱性磷酸酶

第一步，制备mn掺杂zns量子点

将β-环糊精、zn(ac)2和mn(ac)2按摩尔比为3.5:1:0.05的比例混合，用naoh调节体系的ph值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与zn(ac)2的na2s，室温下继续反应30min；再将溶液加热至70℃，空气中陈化1.5h，得到β-cd包覆的mn:zns量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。

第二步，配制mn:zns量子点母液：

称量50mgmn:zns量子点，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中。

第三步，焦磷酸钠溶液的配制：

称量0.2230g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中，配成浓度为5.0mm的焦磷酸钠溶液，使用时用100mmol/l的tris-hcl缓冲溶液（ph8.5）稀释至稀释10倍；

第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品：

分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550u/l的碱性磷酸酶标准溶液。

第五步，移取1ml的mn:zns量子点溶液、50μl的焦磷酸钠溶液及500μl的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品溶液，用tris-hcl缓冲溶液定容至5ml，35℃下孵育35min，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度。将每条曲线590nm处的磷光强度对碱性磷酸酶浓度作图，获得工作曲线。当碱性磷酸酶浓度在0.2-10.4u/l范围内时，体系的磷光强度p与其浓度c呈现较好的线性关系（r²=0.993），回归方程为p=0.026c+0.064，以s/n=3为标准计算得检出限为0.045u/l。

第六步，实际样品的处理：

血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10ml，加入100mmol/l的tris-hcl缓冲液稀释至500ml，不需要进一步复杂的样品预处理过程。

第七步，血清样品中碱性磷酸酶的检测：

在比色管中，依次加入2ml的mn:zns量子点母液，100μl的焦磷酸钠溶液，最后加入稀释后的血清样定容在10ml的容量瓶中。35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm，因为含有碱性磷酸酶样本的磷光强度会高于无碱性磷酸酶样本的磷光强度，据此判断样品中是否含有碱性磷酸酶。

实施例2，室温磷光检测血清中的碱性磷酸酶

第一步，制备mn掺杂zns量子点：

将β-环糊精、zn(ac)2和mn(ac)2按摩尔比为3.5:1:0.03的比例混合，用naoh调节体系的ph值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与zn(ac)2等摩尔的na2s，室温下继续反应20min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化1.5h，得到β-cd包覆的mn:zns量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。

第二步，配制mn:zns量子点母液：

称量50mgmn:zns量子点，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中。

第三步，焦磷酸钠溶液的配制：

称量0.2230g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中，配成浓度为5.0mm的焦磷酸钠溶液，使用时用100mmol/l的tris-hcl缓冲溶液（ph8.5）稀释至稀释10倍；

第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品：

分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550u/l的碱性磷酸酶标准溶液。

第五步，移取1ml的mn:zns量子点溶液、50μl的焦磷酸钠溶液及500μl的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品溶液，用tris-hcl缓冲溶液定容至5ml，40℃下孵育30min，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；通过加入一定量的不同浓度梯度的碱性磷酸酶溶液以考察mn:zns量子点/碱性磷酸酶核酸适配体体系对它的响应情况。碱性磷酸酶浓度增加时，体系的磷光强度随之而增强。将每条曲线590nm处的磷光强度p对碱性磷酸酶浓度c作图，获得工作曲线。

第六步，实际样品的处理：

血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10ml，加入100mmol/l的tris-hcl缓冲液稀释至500ml，不需要进一步复杂的样品预处理过程。

第八步，检测碱性磷酸酶在血清中的加标回收率

在比色管中，依次加入2ml的mn掺杂zns量子点母液，100μl的碱性磷酸酶适配体溶液，分别加入500μl的不同浓度的碱性磷酸酶标准样品，最后加入稀释后的血清样定容在10ml的容量瓶中，定容后碱性磷酸的浓度分别为0.8、3.3、5.0、7.5u/l，同时做空白样，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值。

实施例3，室温磷光检测血清中的碱性磷酸酶

第一步，制备mn:zns量子点：

将β-环糊精、zn(ac)2和mn(ac)2按摩尔比为3.5:1:0.04的比例混合，用naoh调节体系的ph值至10.5，通氮气保护，室温下磁力搅拌40min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与zn(ac)2等摩尔的na2s，室温下继续反应20min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到β-cd包覆的mn:zns量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。

第二步，配制mn:zns量子点母液：

称量50mgmn:zns量子点，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中。

第三步，焦磷酸钠溶液的配制：

称量0.2230g焦磷酸钠，用二次去离子水定容在100ml的容量瓶中，配成浓度为5.0mm的焦磷酸钠溶液，使用时用100mmol/l的tris-hcl缓冲溶液（ph8.5）稀释至稀释10倍；

第四步，配制不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品：

分别配制浓度为22、42、63、84、104、133、186、245、355、450、550u/l的碱性磷酸酶标准溶液。

第五步，移取1ml的mn:zns量子点溶液、50μl的适配体溶液及500μl的不同浓度梯度的碱性磷酸酶标准品溶液，用tris-hcl缓冲溶液定容至5ml，30℃下孵育50min转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长312nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度，通过加入一定量的不同浓度梯度的碱性磷酸酶溶液以考察mn:zns量子点/焦磷酸钠体系对它的响应情况。将每条曲线590nm处的磷光强度p对碱性磷酸酶浓度c作图，获得工作曲线。当碱性磷酸酶浓度在0.2-10.4u/l范围内时，体系的磷光强度p与其浓度c呈现较好的线性关系。

第六步，实际样品的处理：

血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清10ml，加入100mmol/l的tris-hcl缓冲液稀释至500ml，不需要进一步复杂的样品预处理过程。

第八步，检测碱性磷酸酶在血清中的加标回收率

在比色管中，依次加入2ml的mn掺杂zns量子点母液，100μl的碱性磷酸酶适配体溶液，分别加入500μl的不同浓度的碱性磷酸酶标准样品，最后加入稀释后的血清样定容在10ml的容量瓶中，定容后碱性磷酸的浓度分别为0.8、3.3、5.0、7.5u/l，同时做空白样，35℃下孵育35min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为312nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出碱性磷酸酶浓度值。计算碱性磷酸酶在血清中的加标回收率，见表1，碱性磷酸酶在人血清中的加标回收率为93.75-103.03%。

表1人血清中碱性磷酸酶加标回收实验