一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法与流程

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法。

背景技术：

槟榔在海南是仅次于橡胶的第二大热带经济作物，被称为“绿金”，种植面积近140万亩，其产量占全国95％的份额，全省近230万农民种植槟榔并以此为生，其病虫害防治一直是政府、农户及科研机构最为关注的问题之一，而植物病毒病是目前病害中危害最大，防治最难的一类病害。槟榔黄化病(yellowleafdisease)是影响槟榔生长和产量的最严重的一种侵染性的病害，引起植株的叶片黄化，甚至出现畸形，最终导致果实和叶片的脱落死亡。目前尚无可快速鉴别诊断槟榔黄化病相关病毒的检测方法。因此建立一种槟榔黄化病相关病毒快速鉴别诊断方法对槟榔栽培种植具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法。一方面该病毒为研究槟榔黄化病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。另一方面本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。

本发明的第一个方面是提供一种槟榔黄化病相关病毒，该病毒命名为槟榔黄化病相关病毒(arecapalmyellowleafdiseasevirus,ayldv)，于2019年07月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v201947。

由于槟榔黄化病相关病毒是一种单链rna病毒，基因组rna的合成直接由其依赖于rna的rna聚合酶进行复制，在rna复制过程中，依赖于rna的rna聚合酶缺乏3’-5’的纠错功能，导致基因组在自然复制时容易发生突变，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在≤30％的变异，因此在检测时，还需针对≥70％同源序列具有检测能力。

因此，本发明的第二个方面是提供一种引物对，所述引物对为：

l-f：tgcttccgcaaatctaccaactg，l-r：ttcttccataccttcgcaacacg。

本发明的第三个方面是提供一种试剂盒，其含有本发明第二个方面所述的引物对。

可采用常规pcr检测、sybrgreeni染色的实时荧光定量pcr检测、数字pcr检测或依赖于解旋酶的等温扩增(hda)检测，本发明对此不进行限定，试剂盒所需其他成分，本领域技术人员可根据所掌握的技术进行合理配置。

所述试剂盒还可包括核酸探针，所述核酸探针的序列为本发明第二个方面所述的引物对，核酸探针可以用地高辛(dig)、荧光素或者放射性同位素等进行所有核苷酸或特定核苷酸，如dig-dutp的掺入法标记；也可以用dig、荧光素、报告基团、荧光淬灭基团或放射性同位素等进行末端修饰标记，例如探针的5’端标记fam、hex、vic等，3’端标记淬灭基团tamra等；进行直接对槟榔黄化病相关病毒(arecapalmyellowleafdiseasevirus,ayldv)或其他变异的同源病毒的基因组核酸(同源性≥70％)进行独立的原位杂交或斑点杂交检测，也可与实时定量pcr技术联合，进行taqman探针或beacon探针的荧光定量pcr检测。

本发明的第四个方面是提供如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒在检测如本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒和/或与其同属且同源性≥70％的病毒中的应用。

如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒用于检测下述特异性序列：

(a)本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸的整体或部分特异性rna序列或该rna序列转换的dna序列；和/或

(b)与本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸序列的特异性rna序列或转换的dna的同源性≥70％的rna或dna序列；和/或

(c)(a)、(b)的简并碱基的rna或dna序列；和/或

(d)与(a)、(b)的简并碱基的rna或dna序列的同源性≥70％的rna或dna序列；和/或

(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的rna和dna序列；

其中，本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明的第五个方面是提供如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒在检测槟榔是否会感染黄化病中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种槟榔黄化病相关病毒的检测方法，其特征在于，采用如本发明第二个方面所述的引物对、或者本发明第三个方面所述的检测盒对如本发明第一个方面所述的槟榔黄化病相关病毒和/或与其同属且同源性≥70％的病毒进行检测。

使用所述试剂盒的检测方法包括但不限于常规聚合酶链式反应(pcr)、恒温对流pcr、套氏pcr、实时荧光pcr、恒温对流实时荧光pcr、数字pcr、斑点杂交、原位杂交、环介导等温扩增(lamp)、滚环扩增技术(rca)、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增技术(hda)、交叉引物扩增技术、核酸快速等温检测放大技术；也可包括但不限于同时对1株或1种以上槟榔黄化病相关病毒与其同源种或变异种的基因芯片、芯片检测；还可以包括但不限于同时对包含槟榔黄化病相关病毒及其同源种或变异种的基因芯片、芯片检测。

其中，所述引物对的扩增目的片段为428bp。

本发明从槟榔叶片中分离到的病毒，属于长线性病毒，形态为弯曲线性，10-20nm×2000-3500nm，为研究槟榔黄化病提供了研究基础，在科学研究及经济作物保护上有较大的使用价值。本发明的检查方法能够准确快速地检测出该病毒，高效可靠，在科学研究及经济作物保护上也具有较大的价值。

附图说明

图1为槟榔黄化病相关病毒的电镜图片。

图2为槟榔黄化病相关病毒的系统发育进化树。

图3为检测槟榔黄化病毒的1％琼脂糖凝胶电泳图，其中，m：dnamarkerd2000，1-10：槟榔黄化病叶，ck：槟榔正常叶。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

生物保藏信息

本发明的病毒从槟榔病叶中分离到，该病毒命名为槟榔黄化病相关病毒(arecapalmyellowleafdiseasevirus,ayldv)，于2019年07月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学保藏中心，保藏编号为cctccno：v201947。该病毒形态为弯曲线性，10-20nm×2000-3500nm。能够侵染槟榔，主要表现为初期底部或中部树冠的叶尖变黄，后期整株叶片黄化，部分植株出现叶片枯萎甚至死亡。

实施例1槟榔黄化病相关病毒的分离、纯化和鉴定

1.1分离和纯化

(1)取槟榔病叶200g，用5倍体积(1l)的extractionbuffer(0.2mol/lnaac缓冲液，ph5.0，加巯基乙醇至0.2％)于搅拌机中匀浆，四层纱布过滤，冰浴30min；4℃,8000r/min，离心10分钟，取上清；加入peg6000、nacl、tritonx-100分别至终浓度8％、0.2mol/l、0.5％，4℃搅拌45min；4℃，8500r/min，离心15min，弃上清，用滤纸小心吸去残留液体；用0.1倍于extractionbuffer体积的tris-citratebuffer(0.1mol/ltrisph6.5，0.032mol/l柠檬酸钠，加入tritonx-100至终浓度0.5％)重悬，4℃搅拌45min；4℃，10000r/min，离心10min，取上清；将上清转移到超速离心瓶中，用配有平针头的注射器伸入液面以下将30％蔗糖垫溶液从离心管底部缓慢注入；4℃，27000r/min(转子型号：hitachip50at2)，离心2h，弃上清，沉淀用300μltris-citratebuffer重悬，即为病毒粗提液。

(2)电镜观察，将病毒粗提纯液(5μl)置于2％磷钨酸溶液(ph6.8)中负染约3min后，用透射电镜进行观察拍照。

(3)全基因组扩增：在通过高通量测序获得部分槟榔黄化病相关病毒序列的基础上，在此基础上设计引物对全基因组进行长片段的扩增和验证，然后采用smarterracecdnaamplificationkit扩增s片段的3’末端和5’末端的以获得全基因组序列。

1.2种属鉴定

槟榔黄化病相关病毒电镜图片如图1所示，该病毒呈弯曲线状，10-20nm×2000-3500nm。全基因组扩增检测该病毒核苷酸序列如seqidno:3所示，根据槟榔长线性病毒科各个科(属)病毒基因组的氨基酸序列，利用muscle软件进行比对，利用mega软件构建长线病毒科病毒开放阅读框orf1a最大相似度进化树(图2)，系统发育进化树显示该病毒与长线性病毒科隐症病毒属的亲缘关系最近。对其进行了保藏，保藏编号为cctccno：v201947。

实施例2检测槟榔黄化病相关病毒的pcr试剂盒

检测槟榔黄化病相关病毒的pcr试剂盒包括表1所示成分。

表1

由于槟榔黄化病相关病毒是一种单链rna病毒，基因组rna的合成直接由其依赖于rna的rna聚合酶进行复制，在rna复制过程中，依赖于rna的rna聚合酶缺乏3’-5’的纠错功能，导致基因组在自然复制时容易发生突变，基因组的整体或部分特异性序列的片段内可能存在变异，因此在检测时，还需针对≥70％同源序列具有检测能力。因此，本实施例针对病毒基因组中保守区域设计了引物l-f和引物l-r来进行对槟榔是否会感染黄化病进行检测。其中，引物l-f和引物l-r的序列见表2。

表2检测槟榔黄化病相关病毒的引物序列及扩增片段

参照以下方法检测：

1、将槟榔黄化的疑似感染组织匀浆提取后，提取rna，调节rna浓度至500ng/μl，再反转录为cdna。为了提高合成效率，先将rna模板、随机引物(randomprimer)与无rna酶水(rnase-freewater)加入pcr用八连管中混匀，65℃孵化5分钟后，冰浴2分钟，然后再加入其它组分。

rna模板2微升

随机引物(randomprimer)1微升

无rna酶水(rnase-freewater)5微升

其它组分：

2×tsreactionmix(r-mix)10微升

enzymemix(e-mix)10微升

gdnaremover(remover)1微升

2、将各组分轻轻混匀，使用pcr仪进行孵育得到模板cdna，程序如下：

20微升体系：

(1)25℃10分钟

(2)42℃30分钟

(3)85℃5秒

3、然后利用如表3所示的引物进行pcr扩增。具体的反应体系与条件如下：

加样成分如表2所示，依次加入相关试剂，混匀后分装,加入检测样品cdna。按以下程序进行pcr检测：

4、将pcr产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图3所示。泳道1-10为感染该病毒或其变异体的感病槟榔的扩增条带。

5、实际应用：

对300份感染本发明的槟榔黄化病相关病毒的阳性样品进行检测，以及300份未感染本发明的槟榔黄化病相关病毒的阴性样品，用上述检测技术进行检测，结果显示该技术的灵敏度为100.0％，特异性为100.0％。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>海南大学

<120>一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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