提高基因敲入效率的Cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，涉及一种提高基因敲入效率的cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统。
背景技术：
：规律成簇的间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,crispr)是一种来源于古细菌和细菌的自我防御系统，主要用来抵御外来入侵病毒的攻击。目前，crispr/cas9(crisprassociatedprotein9)系统已经被开发为一种基因组编辑的重要工具，该系统借助20nt左右的引导rna(guiderna，grna)特异性识别pam(protospaceradjacentmotifs，间隔序列前体旁序列)区，随后cas9的ruvc和hnh结构域对目的基因组进行切割，形成dna双链断裂(dnadouble-strandbreak,dsb)。dsb的产生进而诱导细胞激活非同源末端连接(nonhomologousendjoining,nhej)或同源定向修复(homologousdirectedrepair,hdr)机制，最后实现基因组的定向敲除或敲入。由于crispr/cas9系统的易操作、高特异特性使得其在农业、生物医学等领域应用广泛。一般地，限制基因敲入效率有3个主要因素：转染(或病毒包装)效率、cas9切割效率和细胞hdr效率。通过优化转染(或病毒包装)效率、使用更高效的cas9切口酶或突变体、融合激活hdr通路因子或小分子化合物抑制nhej修复通路等方式均可以一定程度地提高基因组敲入效率。这些方法的应用有利于基因组敲入事件的发生，但存在位点/细胞差异性或对细胞生长不利。因此，寻找一种更安全高效的基因组敲入方法对模式动物的制备、基因治疗和异种器官移植等具有重要意义。dna结合域(dnabindingdomain,dbd)是一类能够识别某种特殊序列的功能域，常见于转录因子中，是转录因子发挥正常功能的重要元件。它们通常通过氢键和范德华力组合装配后与识别基序产生化学性结合。bolukbasi等人通过分别将dna结合域zfps和tales串联在cas9后面，发现这两个dna结合域可以识别靶位点附近的dna序列，从而可以提高cas9的靶向特异性，降低基因编辑的脱靶风险(bolukbasi,m.f.,gupta,a.,oikemus,s.,etal(2015).dna-binding-domainfusionsenhancethetargetingrangeandprecisionofcas9.natmethods12,1150-1156.)。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种可以提高基因敲入效率的cas9融合蛋白。本发明的第二个目的在于提供一种安全高效的外源基因敲入整合系统。根据本发明的第一方面，提供了一种可以提高基因敲入效率的cas9融合蛋白，该cas9融合蛋白包括cas9蛋白和来源于转录因子thap11的dna结合域(以下称为cas9-thap11融合蛋白)。本发明通过将cas9蛋白和dna结合域融合一体，并在利用其进行基因敲入时，在同源供体末端融合dbd识别基序，即可通过dna结合域识别同源供体以及将同源供体主动抓捕至dsb处对目的基因进行修复，从而可以有效提高基因敲入(knockin,ki)效率。其中，cas9蛋白和来源于转录因子thap11的dna结合域融合得到的cas9融合蛋白提高ki效率的效果最佳。cas9融合蛋白用于外源基因敲入整合系统时的工作原理如图1所示。在一些实施方式中，cas9-thap11融合蛋白的氨基酸序列可以包括如seqidno.1所示的氨基酸序列。根据本发明的第二方面，提供了编码cas9-thap11融合蛋白的核苷酸序列，包括如seqidno.2所示的核苷酸序列。根据本发明的第三方面，提供了一种表达载体，该表达载体含有编码cas9-thap11融合蛋白的核苷酸序列。在一些实施方式中，该表达载体还可以含有grna的核苷酸序列。在一些实施方式中，该表达载体还含有启动子(包括但不限于cmv、cag、u6、cbh等)、报告基因(包括但不限gfp、egfp、rfp、mcherry、荧光素酶等)、接头序列(linker)、酶切位点等。根据本发明的第四方面，提供了一种外源基因敲入整合系统，包括：cas9-thap11融合蛋白；或编码cas9-thap11融合蛋白的核苷酸序列和/或其pcr扩增引物；或表达cas9-thap11融合蛋白的表达载体；和grna的核苷酸序列和/或其pcr扩增引物；或含grna的核苷酸序列的表达载体；和表达供体dna的供体载体。根据本发明的第五方面，提供了一种外源基因敲入整合系统，包括：可同时表达的cas9-thap11融合蛋白和grna的表达载体；和表达供体dna的供体载体。在一些实施方式中，供体dna的两末端均可以连接有cas9-thap11融合蛋白中来源于转录因子thap11的dna结合域的识别序列(以下简称为thap11-dbd识别基序)。在一些实施方式中，供体dna的两末端可以分别连接有两个thap11-dbd识别基序。在一些实施方式中，外源基因敲入整合系统还可以包括小分子化合物，小分子化合物可以选自沃尼妙林(cas：101312-92-9)或其药学上可接受的盐、长春碱(cas：865-21-4)或其药学上可接受的盐中的一种或多种。将表达cas9-thap11融合蛋白和grna的表达载体和供体载体转染进细胞后，用上述小分子化合物对转染后的细胞进行干预，可以产生协同作用，进一步显著提高不同基因组及细胞系的基因敲入效率。在一些实施方式中，小分子化合物可以为沃尼妙林盐酸盐。由此，不仅可以显著提高敲入效率，还可以有效促进细胞生长，对细胞无毒性。相比于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过将cas9蛋白和thap11的dna结合域融合，制得cas9融合蛋白用于基因敲入，可以有效提高基因的敲入效率；此外，cas9融合蛋白进一步协同小分子化合物，利用小分子化合物对转染后的细胞进行干预，可以有效促进不同细胞及其位点的ki事件的发生，进一步显著提高基因的敲入效率，为模式动物的生产以及基因治疗提供便利。附图说明图1为本发明cas9融合蛋白用于外源基因敲入整合系统时的工作原理示意图，图中，一个m表示一个dbd识别基序，donor-lr表示供体dna左右两末端均连接有dbd识别基序，donor-r表示供体dna仅右侧末端连接有dbd识别基序，donor-l表示供体dna仅左侧末端连接有dbd识别基序，donor-nc表示供体dna左右两末端均不连接dbd识别基序；图2为px330-hindiii质粒的图谱；图3为cas9相关载体主要结构的结构模式图，从上到下依次为：px330-grna-cas9载体、px330-grna-cas9-dbd载体、px330-grna-cas9-dbd-mcherry载体；图4表示cas9与不同转录因子dna结合域的融合蛋白对ki效率的影响，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01；图5表示dbd识别基序在供体dna左右两末端不同富集形式对ki效率的影响，图中，mthap11-l表示仅在供体dna左侧末端连接mthap11的dbd识别基序，mthap11-r表示仅在供体dna右侧末端连接mthap11的dbd识别基序，mthap11-lr表示仅在供体dna左右两侧末端均连接mthap11的dbd识别基序，mthap11-nc表示供体dna左右两侧末端均不连接mthap11的dbd识别基序，其他dbd类似表述的含义同mthap11；*表示p<0.05，**表示p<0.01；图6表示通过westernblot实验验证mthap11的dbd识别基序在供体dna左右两末端不同富集形式对ki效率的影响的结果；图7表示cas9-mthap11融合蛋白的表达情况；图8-10表示在供体dna左右两末端连接不同数目的dbd识别基序对ki效率的影响，图中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，ns表示p>0.05；图11表示cas9-mthap11融合蛋白在actb位点的ki效率，**表示与control组相比，p<0.01；图12表示cas9蛋白和cas9-mthap11融合蛋白在hek293t细胞hactb位点的切割效率；图13表示不同浓度的vinblastine和valnemulin1干预对ki效率的影响，**表示与control组相比，p<0.01；图14表示vinblastine和valnemulin1单独干预和共同干预分别在hek293t细胞gapdh和actb位点的ki效率；*表示与不加vinblastine和valnemulin1的对照组相比，p<0.05，**表示与不加vinblastine和valnemulin1的对照组相比，p<0.01；图15表示分别单独用vinblastine、valnemulin1干预和用vinblastine和valnemulin1共同干预对hek293t细胞的生长抑制效果；图16-19依次表示cas9-mthap11融合蛋白协同valnemulin1在hek293t细胞、hela细胞、hepg2细胞和a549细胞hactb和hgapdh位点的ki效率，*表示与不使用cas9-mthap11融合蛋白和valnemulin1的对照组相比，p<0.05，**表示与不使用cas9-mthap11融合蛋白和valnemulin1的对照组相比，p<0.01。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为市售，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中，有关cas9相关载体的表述中，“px330-cas9-mthap11”表示以px330-hindiii质粒为载体骨架，可以融合表达cas9和mthap11的dbd的表达载体；“px330-hactb-cas9-mthap11”表示以px330-hindiii质粒为载体骨架，可以融合表达cas9和mthap11的dbd以及表达以hactb为靶位点的grna的表达载体。其他类似表述的cas9载体的含义可以参考上述表达载体。供体载体中，“2mthap11-hgapdh-2mthap11”表示外源基因敲入整合系统中以hgapdh为靶位点的供体载体中，供体dna两端分别连接有两个mthap11的dbd识别基序。其他类似表述的供体载体的含义可以参考上述表达载体。实施例11、px330-grna-cas9-dbd载体的构建(1)根据ncbi提供的转录因子dna结合域的基因cds序列设计并合成引物进行pcr扩增(引物见表1)，pcr体系及反应程序参见takara公司的maxdnapolymerase(#r045a)使用说明书，回收和纯化pcr产物。回收和纯化pcr产物的方法参见omega公司的gelextractionkit(#d2500)说明书。表1dbd引物信息表(2)将px330-hindiii质粒(px330-hindiii质粒的图谱如图2所示)按照thermofisher公司fastdigesthindiii(#fd0504)的说明书进行单酶切。酶切好的质粒与步骤(1)中纯化好的pcr产物进行无缝克隆，详细克隆过程见takara公司in-fusionhdcloningkits(#639648)的说明书。(3)转化克隆载体并划线涂板，第二天挑单克隆菌进行sanger测序，测序引物与表1一致，将正确连接的载体菌液扩大培养并进行质粒抽提备份。测序无误的质粒即为可以融合表达cas9和dbd的载体，记为px330-cas9-dbd载体。(4)将上述px330-cas9-dbd载体按照thermofisher公司fastdigestbpii(#fd1014)的说明书进行单酶切。(5)以hgapdh和hactb为靶位点，设计grna并设计合成grnaoligo引物，grnaoligo引物序列见表2。表2grnaoligo引物信息表(6)grna引物合成后浓度稀释成10μm，上下游各取5μl轻轻混匀后进行退火反应，反应过程如下：95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→10℃，1min→95℃，3min→4℃，10min。(7)将退火后的grna与经bpii酶切的px330-cas9-dbd载体使用t4连接酶16℃连接2h，转化trans5α并划线涂板。将单克隆菌pcr验证后送华大基因测序，测序引物为：u6-promoter(human):5’-ccgtaacttgaaagtatttcg-3’。测序结果无误后进行质粒抽提并备份；即得可同时融合表达cas9和dbd以及表达grna的表达载体，记为px330-grna-cas9-dbd载体，px330-grna-cas9-dbd载体主要结构的结构模式如图3所示。2、px330-grna-cas9载体的构建：将px330-hindiii质粒按照thermofisher公司fastdigestbpii(#fd1014)的说明书进行单酶切，然后将退火后的grna与经bpii酶切的px330质粒使用t4连接酶16℃连接2h，转化trans5α并划线涂板。将单克隆菌pcr验证后送华大基因测序，测序引物为：u6-promoter(human):5’-ccgtaacttgaaagtatttcg-3’。测序结果无误后进行质粒抽提并备份，即得可同时表达cas9蛋白和grna的表达载体，记为px330-grna-cas9载体，px330-grna-cas9载体主要结构的结构模式如图3所示。3、红光校正px330-grna-cas9-dbd-mcherry载体的构建红光校正px330-grna-cas9-dbd-mcherry载体的构建过程与px330-grna-cas9-dbd载体构建步骤类似：根据pmv-mcherry质粒将mcherry的基因序列通过pcr扩增出来，回收和纯化pcr产物；然后使用ecori酶切px330-grna-cas9-dbd载体，并将酶切好的px330-grna-cas9-dbd载体和mcherry的pcr产物进行无缝克隆，通过无缝连接酶将mcherry克隆至px330-grna-cas9-dbd载体中；转化克隆载体并划线涂板，第二天挑单克隆菌进行sanger测序，测序无误后抽提质粒并备份，即得px330-grna-cas9-dbd-mcherry载体，px330-grna-cas9-dbd-mcherry载体主要结构的结构模式如图3所示。pcr扩增及测序引物为：inf-mcherry-f:5’-caaaaaagaaaaaggaattcgagggcagaggaagtctgct-3’；inf-mcherry-r:5’-tcagcgagctctaggaattcttacttgtacagctcgtccatgcc-3’。4、供体载体的构建供体载体由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，供体载体包括puc57载体骨架、供体dna和连接于供体dna末端的dbd识别基序，其中，供体dna包括插入有外源序列t2a-gfp的靶位点基因整合片段和位于靶位点基因整合片段左右两侧的同源臂。dbd识别基序的序列如表3所示。表3dbd识别基序序列dbd名称识别序列atf3gtgacgtacagthap11actacaattcccaggal4cggaggactgtcctccgpdr1ccgccgaataa供体dna的结构模式如图1所示，图中m(motif，基序)表示dbd识别基序。5、利用外源基因敲入整合系统进行基因敲入(1)细胞复苏与传代：将从液氮中取出的细胞(包括hek293t、hela、hepg2和a549细胞系)迅速转移至37℃水浴锅中摇晃解冻，解冻后的细胞转移至无菌15ml离心管中，并加入3ml含10％fbs完全培养基，混匀后于90g离心机中离心5min。将离心后的细胞用预热的8ml完全培养基重悬并转移至10cm细胞培养皿中培养。将培养皿放置于37℃，5％co2培养箱中，每两天换一次新鲜的培养基。当细胞密度达到80％后，吸去培养皿中的培养基，并用pbs缓慢清洗两次，加入2ml0.05％胰蛋白酶-edta消化酶，培养箱中消化1～2min，待细胞变亮变圆后，轻轻吸去消化酶，并加入3～5ml完全培养基终止消化并重悬。将重悬的细胞等量加入3～5个细胞培养皿中，并补加至8ml培养基后置于细胞培养箱中培养。(2)细胞转染：以24孔板为例，参照lipofectamine3000reagent(#l3000015)说明书进行共转染，其中cas9载体用量为500ng/孔，供体载体用量为250ng/孔。转染48h后使用流式细胞术检测绿色荧光细胞比例。(3)转染校正：为排除系统误差，提高试验可信性和准确度，利用海肾校正和红光校正两种校正方法对基因敲入效率(ki效率)进行校正。i、海肾校正校正方法如下(以24孔板为例)：将含海肾基因的pgl3.0载体和cas9系统(即外源基因敲入整合系统，包括cas9载体和供体载体)共转入hek293t细胞中，供体dna用量为250ng/孔，其中，对照组的cas9载体为px330-hgapdh-cas9，供体载体中的供体dna两末端无dbd识别基序；实验组的cas9载体为px330-hgapdh-cas9-dbd，供体载体为m-hgapdh-m(m表示dbd识别基序)。转染48h后一部分细胞用于流式细胞术，另一部分细胞用于检测双荧光素酶检测实验，详细实验过程参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，#11402es60)说明书。将流式细胞术检测到的荧光颗粒和双荧光素酶检测的比值进行归一化处理，比较不同dbd对基因敲入效率的影响。结果如图4所示，由图4的结果可知，cas9融合thap11结合域能够明显提高基因敲入效率，提高幅度达50％以上。ii、红光校正校正方法如下：将pmv-mcherry质粒和cas9系统(包括px330-grna-cas9-dbd-mcherry载体和供体载体)共转入hek293t细胞中，供体dna用量为250ng/孔。转染48h后利用流式细胞术检测红色荧光细胞中绿色荧光细胞所占比例。在进行红光校正过程中，通过将px330-hgapdh-cas9-dbd-mcherry和dbd识别基序在供体dna左右两末端不同富集形式的供体载体(靶位点为hgapdh)组成的cas9系统和pmv-mcherry质粒共转入细胞中，考察了不同供体富集形式(分别在供体dna左端、右端或两端连接dbd识别基序)对ki效果的影响。结果如图5所示，图5结果表明两端富集的形式具有最高的ki效果(47％～96％)，其次为右端富集(60％)，不同的dbd对ki的影响不同。另外取转染48h后的细胞提取总蛋白进行westernblot实验，实验结果如图6-7所示。图6结果证明了两端富集形式最好，图7结果证实已成功融合cas9与mthap11的dbd。为了更好的富集cas9和供体，本实施例通过以px330-hgapdh-cas9-mthap11-mcherry为cas9载体以及在供体dna两端同时加上不同数目的mthap11的dbd识别基序，研究了dbd识别基序的数目能否更深程度地促进ki事件的发生。结果如图8-10所示，结果显示，在供体左右两边识别序列各为两个时，ki效率达到饱和，即过多的识别序列并不会再次显著提升ki效率。同时，本实施例还以px330-hactb-cas9-mthap11-mcherry为cas9载体、以2mthap11-hactb-2mthap11为供体载体研究dbd在不同位点是否具有相同的特性，结果如图11所示，图11的结果表明在actb位点使用cas9-mthap11融合蛋白同样能够提高ki效率。7、t7ei实验鉴定dbd对cas9切割效率的影响分别用px330-hactb-cas9载体、px330-hactb-cas9-mthap11载体和供体载体2mthap11-hactb-2mthap11共转染hek293t细胞，转染48h后收集两种ki细胞，并对其进行细胞dna抽提，详细抽提步骤见omega公司的tissuednakit(#d3396)说明书。使用如下引物扩增基因组dna：t7-actb-f：5’-gagctgtcacatccagggtcct-3’；t7-actb-r：5’-agaagtggggtggcttttaggat-3’。琼脂糖凝胶电泳后进行切胶回收，回收条带大小为504bp，回收过程详见omega公司的gelextractionkit(#d2500)说明书。将回收后的dna进行t7ei实验，具体过程参考newenglandbiolabs公司的t7endonucleasei(#m0302)说明书。琼脂糖电泳后使用tanongis软件对其进行灰度扫描，结果如图12所示，cas9蛋白和cas9-mthap11融合蛋白在hek293t细胞hactb位点的切割效率分别为64％和66％，即mthap11的dna结合域对cas9的切割效率无明显影响。实施例21、单一药物对ki效率的影响将px330-hactb-cas9-mthap11载体和2mthap11-hactb-2mthap11供体载体共转染至hek293t细胞中(10cm细胞板)，转染6h后将细胞消化下来，1：1接种至24孔板中，12h后待细胞贴壁后加入小分子化合物，控制终浓度为10μm，并确保每孔仅含一种药物。36～48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光表达情况，即为细胞的ki效率。筛选出较好的两种小分子化合物分别为vinblastine和valnemulinhydrochloride。将药物梯度稀释后重复上述实验过程，药物终浓度分别设置4个梯度：10μm，5μm，2.5μm，1μm。结果如图13所示，vinblastine和valnemulinhydrochloride(图中上标1代表盐酸盐，即valnemulin1表示valnemulinhydrochloride)在终浓度为1μm时仍具有显著的提高ki效率的作用。2、两种药物联合对ki效率的影响分别共转染px330-hactb-cas9-mthap11载体和供体载体2mthap11-hactb-2mthap11、共转染px330-hgapdh-cas9-mthap11载体和供体载体2mthap11-hgapdh-2mthap11至hek293t细胞中，转染6h后将细胞消化下来，1：1接种至24孔板中，12h后待细胞贴壁后分别往两种ki细胞中加入vinblastine、valnemulin1和按摩尔比1:1混合的vinblastine、valnemulin1混合物，控制终浓度均为1μm。36～48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光表达情况，即为细胞的ki效率。结果如图14所示，由图14的结果可知，在gapdh和actb位点，两种药物具有协同作用，联合后均可以显著提高hek293t细胞的ki效率，相较于未加小分子化合物组分别提高96％和111％。3、vinblastine、valnemulin1的细胞毒性将hek293t细胞接种至96孔板中，12h后待细胞贴壁后分别往细胞中加入vinblastine、valnemulin1和按摩尔比1:1混合的vinblastine、valnemulin1混合物，控制终浓度为1μm，每个组别设置8个重复。药物加入24h后使用上海翊圣生物科技有限公司的cck8试剂盒(#40203es60)检测小分子化合物的细胞毒性，结果如图15所示，由图15的结果可知，单一的vinblastine抑制细胞生长，单一的valnemulin1能够促进细胞生长，而两种化合物联合使用细胞生长的抑制效果加剧。实施例3分别共转染px330-hactb-cas9-mthap11载体和供体载体2mthap11-hactb-2mthap11、共转染px330-hgapdh-cas9-mthap11载体和供体载体2mthap11-hgapdh-2mthap11至不同的细胞系中，即hek293t细胞、hela细胞、hepg2细胞和a549细胞，转染6h后将细胞消化下来，1：1接种至24孔板中，12h后待细胞贴壁后分别往各种ki细胞中加入valnemulin1，控制终浓度为1μm，36～48h后使用流式细胞仪检测绿色荧光表达情况，以验证cas9-mthap11融合蛋白协同valnemulin1对不同基因组和不同细胞系ki效率的影响。结果如图16-19所示，在hek293t细胞、hela细胞和hepg2细胞中，cas9-mthap11融合蛋白协同valnemulin1均能够提高外源基因敲入整合系统在hactb和hgapdh位点的ki效率，且最高能够提高5倍的ki效率；在a549细胞中，cas9-mthap11融合蛋白协同valnemulin1能够现在提高外源基因敲入整合系统在hgapdh位点的ki效率。以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。序列表<110>温氏食品集团股份有限公司<120>提高基因敲入效率的cas9融合蛋白和外源基因敲入整合系统<130>2020<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1544<212>prt<213>人工序列()<400>1metasptyrlysasphisaspglyasptyrlysasphisaspileasp151015tyrlysaspaspaspasplysmetalaprolyslyslysarglysval202530glyilehisglyvalproalaalaasplyslystyrserileglyleu354045aspileglythrasnservalglytrpalavalilethraspglutyr505560lysvalproserlyslysphelysvalleuglyasnthrasparghis65707580serilelyslysasnleuileglyalaleuleupheaspserglyglu859095thralaglualathrargleulysargthralaargargargtyrthr100105110argarglysasnargilecystyrleuglngluilepheserasnglu115120125metalalysvalaspaspserphephehisargleuglugluserphe130135140leuvalglugluasplyslyshisgluarghisproilepheglyasn145150155160ilevalaspgluvalalatyrhisglulystyrprothriletyrhis165170175leuarglyslysleuvalaspserthrasplysalaaspleuargleu180185190iletyrleualaleualahismetilelyspheargglyhispheleu195200205ilegluglyaspleuasnproaspasnseraspvalasplysleuphe210215220ileglnleuvalglnthrtyrasnglnleupheglugluasnproile225230235240asnalaserglyvalaspalalysalaileleuseralaargleuser245250255lysserargargleugluasnleuilealaglnleuproglyglulys260265270lysasnglyleupheglyasnleuilealaleuserleuglyleuthr275280285proasnphelysserasnpheaspleualagluaspalalysleugln290295300leuserlysaspthrtyraspaspaspleuaspasnleuleualagln305310315320ileglyaspglntyralaaspleupheleualaalalysasnleuser325330335aspalaileleuleuseraspileleuargvalasnthrgluilethr340345350lysalaproleuseralasermetilelysargtyraspgluhishis355360365glnaspleuthrleuleulysalaleuvalargglnglnleuproglu370375380lystyrlysgluilephepheaspglnserlysasnglytyralagly385390395400tyrileaspglyglyalaserglnglugluphetyrlyspheilelys405410415proileleuglulysmetaspglythrglugluleuleuvallysleu420425430asnarggluaspleuleuarglysglnargthrpheaspasnglyser435440445ileprohisglnilehisleuglygluleuhisalaileleuargarg450455460glngluaspphetyrpropheleulysaspasnargglulysileglu465470475480lysileleuthrpheargileprotyrtyrvalglyproleualaarg485490495glyasnserargphealatrpmetthrarglysserglugluthrile500505510thrprotrpasnpheglugluvalvalasplysglyalaseralagln515520525serpheilegluargmetthrasnpheasplysasnleuproasnglu530535540lysvalleuprolyshisserleuleutyrglutyrphethrvaltyr545550555560asngluleuthrlysvallystyrvalthrgluglymetarglyspro565570575alapheleuserglygluglnlyslysalailevalaspleuleuphe580585590lysthrasnarglysvalthrvallysglnleulysgluasptyrphe595600605lyslysileglucyspheaspservalgluileserglyvalgluasp610615620argpheasnalaserleuglythrtyrhisaspleuleulysileile625630635640lysasplysasppheleuaspasnglugluasngluaspileleuglu645650655aspilevalleuthrleuthrleuphegluaspargglumetileglu660665670gluargleulysthrtyralahisleupheaspasplysvalmetlys675680685glnleulysargargargtyrthrglytrpglyargleuserarglys690695700leuileasnglyileargasplysglnserglylysthrileleuasp705710715720pheleulysseraspglyphealaasnargasnphemetglnleuile725730735hisaspaspserleuthrphelysgluaspileglnlysalaglnval740745750serglyglnglyaspserleuhisgluhisilealaasnleualagly755760765serproalailelyslysglyileleuglnthrvallysvalvalasp770775780gluleuvallysvalmetglyarghislysprogluasnilevalile785790795800glumetalaarggluasnglnthrthrglnlysglyglnlysasnser805810815arggluargmetlysargileglugluglyilelysgluleuglyser820825830glnileleulysgluhisprovalgluasnthrglnleuglnasnglu835840845lysleutyrleutyrtyrleuglnasnglyargaspmettyrvalasp850855860glngluleuaspileasnargleuserasptyraspvalasphisile865870875880valproglnserpheleulysaspaspserileaspasnlysvalleu885890895thrargserasplysasnargglylysseraspasnvalproserglu900905910gluvalvallyslysmetlysasntyrtrpargglnleuleuasnala915920925lysleuilethrglnarglyspheaspasnleuthrlysalagluarg930935940glyglyleusergluleuasplysalaglypheilelysargglnleu945950955960valgluthrargglnilethrlyshisvalalaglnileleuaspser965970975argmetasnthrlystyraspgluasnasplysleuilearggluval980985990lysvalilethrleulysserlysleuvalseraspphearglysasp99510001005pheglnphetyrlysvalarggluileasnasntyrhishisalahis101010151020aspalatyrleuasnalavalvalglythralaleuilelyslystyr1025103010351040prolysleuglusergluphevaltyrglyasptyrlysvaltyrasp104510501055valarglysmetilealalyssergluglngluileglylysalathr106010651070alalystyrphephetyrserasnilemetasnphephelysthrglu107510801085ilethrleualaasnglygluilearglysargproleuilegluthr109010951100asnglygluthrglygluilevaltrpasplysglyargasppheala1105111011151120thrvalarglysvalleusermetproglnvalasnilevallyslys112511301135thrgluvalglnthrglyglypheserlysgluserileleuprolys114011451150argasnserasplysleuilealaarglyslysasptrpaspprolys115511601165lystyrglyglypheaspserprothrvalalatyrservalleuval117011751180valalalysvalglulysglylysserlyslysleulysservallys1185119011951200gluleuleuglyilethrilemetgluargserserpheglulysasn120512101215proileasppheleuglualalysglytyrlysgluvallyslysasp122012251230leuileilelysleuprolystyrserleuphegluleugluasngly123512401245arglysargmetleualaseralaglygluleuglnlysglyasnglu125012551260leualaleuproserlystyrvalasnpheleutyrleualaserhis1265127012751280tyrglulysleulysglyserprogluaspasngluglnlysglnleu128512901295phevalgluglnhislyshistyrleuaspgluileilegluglnile130013051310serglupheserlysargvalileleualaaspalaasnleuasplys131513201325valleuseralatyrasnlyshisargasplysproileargglugln133013351340alagluasnileilehisleuphethrleuthrasnleuglyalapro1345135013551360alaalaphelystyrpheaspthrthrileasparglysargtyrthr136513701375serthrlysgluvalleuaspalathrleuilehisglnserilethr138013851390glyleutyrgluthrargileaspleuserglnleuglyglyaspser139514001405glysergluthrproglythrsergluseralathrproglusermet141014151420proglyphethrcyscysvalproglycystyrasnasnserhisarg1425143014351440asplysalaleuhisphetyrthrpheprolysaspalagluleuarg144514501455argleutrpleulysasnvalserargalaglyvalserglycysphe146014651470serthrpheglnprothrthrglyhisargleucysservalhisphe147514801485glnglyglyarglysthrtyrthrvalargvalprothrilephepro149014951500leuargglyvalasngluarglysvalalaargargproalaglyala1505151015151520alaalaalaargargargglnglnlysargproalaalathrlyslys152515301535alaglyglnalalyslyslyslys1540<210>2<211>8847<212>dna<213>人工序列()<400>2tggccttttgctggccttttgctcacatgtgagggcctatttcccatgattccttcatat60ttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacaca120aagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtt180ttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgat240ttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgtt300ttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggc360accgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc420gtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataac480ttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatag540taacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgccc600acttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacg660gtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggc720agtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgct780tcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaat840tattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcggggcgaggggcggggcgggg900cgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttcctttta960tggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcg1020ctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggc1080tctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggct1140gtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgt1200ttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccat1260ggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatga1320cgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccga1380caagaagtacagcatcggcctggacatcggcaccaactctgtgggctgggccgtgatcac1440cgacgagtacaaggtgcccagcaagaaattcaaggtgctgggcaacaccgaccggcacag1500catcaagaagaacctgatcggagccctgctgttcgacagcggcgaaacagccgaggccac1560ccggctgaagagaaccgccagaagaagatacaccagacggaagaaccggatctgctatct1620gcaagagatcttcagcaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacagactgga1680agagtccttcctggtggaagaggataagaagcacgagcggcaccccatcttcggcaacat1740cgtggacgaggtggcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctgagaaagaaact1800ggtggacagcaccgacaaggccgacctgcggctgatctatctggccctggcccacatgat1860caagttccggggccacttcctgatcgagggcgacctgaaccccgacaacagcgacgtgga1920caagctgttcatccagctggtgcagacctacaaccagctgttcgaggaaaaccccatcaa1980cgccagcggcgtggacgccaaggccatcctgtctgccagactgagcaagagcagacggct2040ggaaaatctgatcgcccagctgcccggcgagaagaagaatggcctgttcggaaacctgat2100tgccctgagcctgggcctgacccccaacttcaagagcaacttcgacctggccgaggatgc2160caaactgcagctgagcaaggacacctacgacgacgacctggacaacctgctggcccagat2220cggcgaccagtacgccgacctgtttctggccgccaagaacctgtccgacgccatcctgct2280gagcgacatcctgagagtgaacaccgagatcaccaaggcccccctgagcgcctctatgat2340caagagatacgacgagcaccaccaggacctgaccctgctgaaagctctcgtgcggcagca2400gctgcctgagaagtacaaagagattttcttcgaccagagcaagaacggctacgccggcta2460cattgacggcggagccagccaggaagagttctacaagttcatcaagcccatcctggaaaa2520gatggacggcaccgaggaactgctcgtgaagctgaacagagaggacctgctgcggaagca2580gcggaccttcgacaacggcagcatcccccaccagatccacctgggagagctgcacgccat2640tctgcggcggcaggaagatttttacccattcctgaaggacaaccgggaaaagatcgagaa2700gatcctgaccttccgcatcccctactacgtgggccctctggccaggggaaacagcagatt2760cgcctggatgaccagaaagagcgaggaaaccatcaccccctggaacttcgaggaagtggt2820ggacaagggcgcttccgcccagagcttcatcgagcggatgaccaacttcgataagaacct2880gcccaacgagaaggtgctgcccaagcacagcctgctgtacgagtacttcaccgtgtataa2940cgagctgaccaaagtgaaatacgtgaccgagggaatgagaaagcccgccttcctgagcgg3000cgagcagaaaaaggccatcgtggacctgctgttcaagaccaaccggaaagtgaccgtgaa3060gcagctgaaagaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtggaaatctccgg3120cgtggaagatcggttcaacgcctccctgggcacataccacgatctgctgaaaattatcaa3180ggacaaggacttcctggacaatgaggaaaacgaggacattctggaagatatcgtgctgac3240cctgacactgtttgaggacagagagatgatcgaggaacggctgaaaacctatgcccacct3300gttcgacgacaaagtgatgaagcagctgaagcggcggagatacaccggctggggcaggct3360gagccggaagctgatcaacggcatccgggacaagcagtccggcaagacaatcctggattt3420cctgaagtccgacggcttcgccaacagaaacttcatgcagctgatccacgacgacagcct3480gacctttaaagaggacatccagaaagcccaggtgtccggccagggcgatagcctgcacga3540gcacattgccaatctggccggcagccccgccattaagaagggcatcctgcagacagtgaa3600ggtggtggacgagctcgtgaaagtgatgggccggcacaagcccgagaacatcgtgatcga3660aatggccagagagaaccagaccacccagaagggacagaagaacagccgcgagagaatgaa3720gcggatcgaagagggcatcaaagagctgggcagccagatcctgaaagaacaccccgtgga3780aaacacccagctgcagaacgagaagctgtacctgtactacctgcagaatgggcgggatat3840gtacgtggaccaggaactggacatcaaccggctgtccgactacgatgtggaccatatcgt3900gcctcagagctttctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctgaccagaagcgacaa3960gaaccggggcaagagcgacaacgtgccctccgaagaggtcgtgaagaagatgaagaacta4020ctggcggcagctgctgaacgccaagctgattacccagagaaagttcgacaatctgaccaa4080ggccgagagaggcggcctgagcgaactggataaggccggcttcatcaagagacagctggt4140ggaaacccggcagatcacaaagcacgtggcacagatcctggactcccggatgaacactaa4200gtacgacgagaatgacaagctgatccgggaagtgaaagtgatcaccctgaagtccaagct4260ggtgtccgatttccggaaggatttccagttttacaaagtgcgcgagatcaacaactacca4320ccacgcccacgacgcctacctgaacgccgtcgtgggaaccgccctgatcaaaaagtaccc4380taagctggaaagcgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcggaagatgat4440cgccaagagcgagcaggaaatcggcaaggctaccgccaagtacttcttctacagcaacat4500catgaactttttcaagaccgagattaccctggccaacggcgagatccggaagcggcctct4560gatcgagacaaacggcgaaaccggggagatcgtgtgggataagggccgggattttgccac4620cgtgcggaaagtgctgagcatgccccaagtgaatatcgtgaaaaagaccgaggtgcagac4680aggcggcttcagcaaagagtctatcctgcccaagaggaacagcgataagctgatcgccag4740aaagaaggactgggaccctaagaagtacggcggcttcgacagccccaccgtggcctattc4800tgtgctggtggtggccaaagtggaaaagggcaagtccaagaaactgaagagtgtgaaaga4860gctgctggggatcaccatcatggaaagaagcagcttcgagaagaatcccatcgactttct4920ggaagccaagggctacaaagaagtgaaaaaggacctgatcatcaagctgcctaagtactc4980cctgttcgagctggaaaacggccggaagagaatgctggcctctgccggcgaactgcagaa5040gggaaacgaactggccctgccctccaaatatgtgaacttcctgtacctggccagccacta5100tgagaagctgaagggctcccccgaggataatgagcagaaacagctgtttgtggaacagca5160caagcactacctggacgagatcatcgagcagatcagcgagttctccaagagagtgatcct5220ggccgacgctaatctggacaaagtgctgtccgcctacaacaagcaccgggataagcccat5280cagagagcaggccgagaatatcatccacctgtttaccctgaccaatctgggagcccctgc5340cgccttcaagtactttgacaccaccatcgaccggaagaggtacaccagcaccaaagaggt5400gctggacgccaccctgatccaccagagcatcaccggcctgtacgagacacggatcgacct5460gtctcagctgggaggcgacagcggttcagagaccccaggaactagcgagagcgctacacc5520ggaatcgatgcctggctttacgtgctgcgttccgggctgctacaacaattcacaccggga5580caaggcgctgcacttctacacgtttcccaaggacgctgagttgcggcgcctctggctcaa5640gaacgtgtcccgtgctggcgtcagtgggtgcttctccaccttccaacccaccaccggcca5700ccgtctctgcagcgtccactttcagggcggccgcaagacctacacggtgcgcgttcccac5760cattttcccgctgcgtggcgtcaatgagcgcaaagtagctcggagacctgcgggagctgc5820ggcagcccgccgtaggcagcagaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaa5880aaagaaaaagtaagaattcctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgc5940cagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactccc6000actgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattct6060attctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcagg6120catgctggggagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgc6180gctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgg6240gcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtatttt6300ctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgc6360cctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacac6420ttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcg6480ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctt6540tacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgc6600cctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactct6660tgttccaaactggaacaacactcaactctatctcgggctattcttttgatttataaggga6720ttttgccgatttcggtctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcga6780attttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctg6840atgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacggg6900cttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgt6960gtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcc7020tatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttc7080ggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatc7140cgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatga7200gtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgttt7260ttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgag7320tgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaag7380aacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgta7440ttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttg7500agtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgca7560gtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggag7620gaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatc7680gttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctg7740tagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttccc7800ggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcgg7860cccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtggaagccgcg7920gtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacga7980cggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcac8040tgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaa8100aacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgacca8160aaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaag8220gatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccac8280cgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaa8340ctggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggcc8400accacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccag8460tggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttac8520cggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagc8580gaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttc8640ccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgca8700cgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacc8760tctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacg8820ccagcaacgcggcctttttacggttcc8847<210>3<211>35<212>dna<213>人工序列()<400>3gctacaccggaatcgatgcctggctttacgtgctg35<210>4<211>33<212>dna<213>人工序列()<400>4ggccgccggccttttctgctgcctgcggcgggc33<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列()<400>5gctacaccggaatcgatgcctggctttacgtgctg35<210>6<211>33<212>dna<213>人工序列()<400>6ggccgccggccttttctgctgcctacggcgggc33<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>7caccagccccagcaagagcacaag24<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>8aaaccttgtgctcttgctggggct24<210>9<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>9cacccgtccaccgcaaatgcttct24<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列()<400>10aaacagaagcatttgcggtggacg24当前第1页12