一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于药物制备领域，具体涉及一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物及其制备方法和应用。

背景技术：

纳米材料的大小是决定其与生物环境相互作用模式的关键因素，并可能从根本上影响其在临床应用中的功能表现。从临床角度看，大尺寸纳米颗粒(20-200nm)由于增强了渗透和保留(epr)效应，通常表现出较好的肿瘤聚集效应，而小尺寸纳米颗粒(<10nm)由于较好的扩散流动性，往往具有较强的肿瘤穿透能力。超分子纳米技术的出现为结合大小纳米生物材料的优点提供了新的机会，其中最常见就是利用纳米颗粒的自组装来进行尺寸转换。通常当肿瘤微环境收到特异性刺激时，会触发这些可改变大小的纳米组装，它们会发生特定的生化转变，并聚合/分解成特定的拓扑纳米结构以达到所需要的目的，从而更好的杀死肿瘤。

此外，光动力疗法(pdt)是一种经临床批准的治疗多种癌症适应症的方法。然而其临床转化受到一系列与光激活性光敏剂(ps)的传递和驱动相关问题的阻碍，ps通常具有高度疏水性，在水环境中易于聚集，导致快速清除和自猝灭；因此一个最佳的pdt纳米制剂策略应该是在系统再分配过程中具有高的肿瘤特异性，同时能够在肿瘤吸收后以单分子的方式传递ps分子。

因此可以合成一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物，使其用于肿瘤特异性光动力治疗时能够在肿瘤组织内原位形成长时间的聚集物，在近红外光的照射下，通过pdt产生ros(活性氧)杀死肿瘤。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物；本发明的目的之二在于提供一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物，所述聚合物的结构式为：

其中n＝113。

2、上述一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)制备peg4000-cdm-znpc：将cdm-peg4000和四氨基锌酞菁(znpc)在无水四氢呋喃充分溶解，在氮气保护下搅拌反应24h，反应结束后真空干燥，然后溶于二氯甲烷中，离心得到固体，真空干燥即可；

(2)制备peg4000-cdm-znpc-s-s-：将羧基二硫吡啶溶于dmf中，然后加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，反应活化羧基30min，再加入步骤(1)中所述peg4000-cdm-znpc，在氮气的保护下，常温搅拌反应12～24h，反应结束后真空干燥去除dmf溶剂，继续溶于水中，透析除去过量的edc、nhs以及羧基二硫吡啶，真空冷冻干燥得到墨绿色固体即为产物peg4000-cdm-znpc-s-s-；

(3)制备peg4000-cdm-znpc-s-s-ha：将巯基化透明质酸(ha-hs)溶于pbs中，peg4000-cdm-znpc-s-s-溶于dmf中，混合后在氮气保护下，25℃搅拌反应48h，反应结束后透析处理4d，用乙醇沉淀，冷冻干燥即可得到产物聚合物peg4000-cdm-znpc-s-s-ha。

优选的，步骤(1)中所述cdm-peg4000与znpc的摩尔比为1:4；步骤(2)中所述羧基二硫吡啶、nhs、edc和peg4000-cdm-znpc的摩尔比为1:5:5:2；步骤(3)中所述ha-hs、peg4000-cdm-znpc-s-s-的摩尔比为2:1。

优选的，步骤(1)中所述cdm-peg4000按照如下方法制备：

(1)将2-丙酸基-3-甲基丁烯二酸酐(cdm)溶于无水二氯甲烷中，加入草酰氯和催化剂dmf，冰上反应30min后转移至室温反应6h，得到酰氯化cdm，真空干燥后待用；

(2)将步骤(1)中干燥的酰氯化cdm和聚乙二醇单甲醚4000溶解在无水二氯甲烷中，加入吡啶作为催化剂，在25℃下反应6h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液萃取，收集有机相并真空干燥；

(3)将步骤(2)中有机相经过干燥的产物充分溶解在二氯甲烷中，用无水乙醚沉淀两次，真空干燥得到的白色粉末产物即为cdm-peg4000；

进一步优选的，所述cdm、草酰氯、催化剂dmf、聚乙二醇单甲醚4000和吡啶的质量体积比为0.276:0.378:40:0.8:30，g:g:ml:g:ml。

优选的，步骤(1)中所述四氨基锌酞菁按照如下方法制备：

(1)将4-硝基邻苯二甲酰亚胺、尿素和钼酸铵混合加热熔融，加入六水合氯化锌，160℃加热反应至不产生气泡，冷却后依次用1mol/l的hcl和1mol/l的naoh溶液洗涤，再用超纯水洗涤至中性，真空干燥，得到蓝紫色产物；

(2)将所述蓝紫色产物和九水合硫化钠混合加热，加入dmf充分溶解，继续加热，温度至60℃时，加速搅拌1h，用水洗涤至中性，真空干燥，得到墨绿色的固体物质即为znpc。

进一步优选的，所述4-硝基邻苯二甲酰亚胺、尿素、钼酸铵、六水合氯化锌和九水合硫化钠的质量比为：4.1:10:0.05:1.2:2.88。

优选的，步骤(2)中所述羧基二硫吡啶按照如下方法制备：将二硫二吡啶溶解在乙醇中，加入醋酸，然后逐滴加入3-巯基乙酸的乙醇溶液，室温反应20h，真空干燥去除乙醇溶剂，用柱层析提纯即可得到产物羧基二硫吡啶。

进一步优选的，所述二硫二吡啶、醋酸和3-巯基乙酸的质量体积比为3.75:0.4:0.9，g:ml:g，所述柱层析中的洗脱剂为体积比为3:2二氯甲烷和乙醇的混合溶液。

优选的，步骤(2)中所述透析时透析袋的分子量为1000，所述透析时间3d。

优选的，步骤(3)中所述巯基化透明质酸按照如下方法制备：取透明质酸ha加入到ph＝5的六次二甲基缓冲液中充分溶解，然后加入n-羟基硫代琥珀酰亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，反应活化3～6h，继续加入硫醇氨盐酸盐，在氮气的保护下反应24h，透析2～4d后用乙醇沉淀，即可得到产物。

进一步优选的，所述透明质酸、edc、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和硫醇氨盐酸盐的质量比为0.2:0.5:0.3:0.3，所述透析时使用的透析袋的分子量为1000。

优选的，步骤(3)中所述透析时采用的透析袋的分子量为3000。

3、上述一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物peg4000-cdm-znpc-s-s-ha，将光敏剂酞菁锌(znpc)通过ph-酸响应性的马来酸酰胺连接物与peg4000结合，然后使用氧化还原可裂的二硫连接物固定化到透明质酸(ha)链上，其中的peg段可增强静脉给药后分子载体的血液循环，到达酸性肿瘤微环境后脱落，使残留的znpc-s-s-ha原位自组装成大团簇，避免逆向扩散，提高肿瘤保留率；同时由于具有亲水性、可降解性以及特异性结合肿瘤细胞膜上过表达的cd44的能力，ha被用作载体底物和肿瘤靶向配体。而本发明的聚合物由于ha和peg片段的亲水作用，经静脉给药后，peg4000-cdm-znpc-s-s-ha在体液中的分散性高，循环寿命长。当到达肿瘤微环境时，酸性环境ph可通过裂解顺丁烯二酸酰胺连接物来去除peg片段，导致整体疏水性急剧增加，空间阻碍降低，剩下的znpc-s-s-ha在znpc分子间疏水相互作用的驱动下自组装成簇，增强了ps-载体在肿瘤组织中的保留，聚集的znpc-s-s-ha可通过透明质酸介导的内吞作用被肿瘤细胞有效内化，随后细胞内高浓度的谷胱甘肽(gsh)可裂解二硫键并以非聚集形式释放znpc分子，从而优化pdt的疗效。预期这种聚合激活的序贯性肿瘤靶向可以提高ps递送到肿瘤组织的效率和特异性，同时在轻度刺激下进一步增加ros的产生，来更好的杀死肿瘤细胞。

2、本发明还提供了一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物的制备方法，反应物来源广泛、操作简单，可进行大批量生产，有利于聚合物peg4000-cdm-znpc-s-s-ha的产业化应用。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为实施例1中制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)的电镜图，其中a为聚合物的tem图，b为聚合物在ph＝6.5的酸性条件下处理后的tem图，c为聚合物在ph＝6.5的酸性条件下处理后的sem图；

图2为中间产物znpc-s-s-ha和znpc的紫外吸收图；

图3为实施例1中制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)分别在ph＝6.5和ph＝7.4的溶液中的粒径分布图；

图4为肿瘤细胞吞噬效果图，其中a1～a4为不添加任何物质的空白对照组的效果图，b1～b4为添加实施例1中制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)的效果图，c1～c4为添加聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)经过ph＝6.5的酸处理后的物质的效果图；

图5实施例1中制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)在光照和未光照条件下对细胞的毒性效果图；

图6为中间产物(znpc-s-s-ha)在光照和未光照条件下对细胞的毒性效果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

制备一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)，按照如下方法进行：

1、制备四氨基锌酞菁(znpc)：

(1)将4.1g4-硝基邻苯二甲酰亚胺、10g尿素和0.05g钼酸铵置于三口烧瓶中，加热熔融，加入1.2g六水合氯化锌后加热至160℃，继续反应直到烧瓶中不产生气泡为止，冷却后依次用1mol/l的hcl和1mol/l的naoh溶液洗涤，再用超纯水洗涤至中性，真空干燥，得到蓝紫色产物；

(2)将上述蓝紫色产物和2.88g九水合硫化钠加入到三口烧瓶中，加热并加入dmf15ml使其充分溶解，加热到60℃后加快搅拌速度，反应1h后，用水洗涤至中性，真空干燥除去溶剂，得到墨绿色的固体物质即待制备产物四氨基锌酞菁(znpc)。

2、制备cdm-peg4000的合成：

(1)0.276gcdm(2-丙酸基-3-甲基丁烯二酸酐)溶于无水二氯甲烷中，加入0.378g草酰氯和40μldmf作催化剂，先在冰上反应30min后，转移至室温反应6h，得到酰氯化cdm，真空干燥后备用；

(2)向真空干燥的酰氯化cdm中加入800mg聚乙二醇单甲醚，再加入无水二氯甲烷溶解，加入30μl吡啶作为催化剂，在25℃下反应6h，反应结束后加入饱和氯化铵溶液萃取，收集有机相，真空干燥，然后继续溶于二氯甲烷中，用无水乙醚沉淀二次，沉淀产物经过真空干燥后得到的白色粉末即为cdm-peg4000。

3、制备羧基二硫吡啶：

将3.75g二硫二吡啶溶解于10ml乙醇中，加入0.4ml醋酸，然后逐滴加入含有0.9g3-巯基乙酸的乙醇溶液，在室温中反应20h，真空干燥后去除乙醇溶剂得到粗产物，然后用体积比为3:2的二氯甲烷和乙醇混合形成的混合溶液作为洗脱剂进行柱层析纯化，收集产物，真空干燥即为羧基二硫吡啶。

4、制备巯基化透明质酸(ha-hs)：

将200mg透明质酸(ha)加入到ph＝5的六次二甲基缓冲液中，加入500mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺(edc)和300mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，活化反应3～6h，然后加入300mg硫醇氨盐酸盐，在氮气的保护下反应24h，反应结束后用分子量为1000的透析袋透析2～4d，用乙醇沉淀后收集产物即为巯基化透明质酸(ha-hs)。

5、制备peg4000-cdm-znpc：

将cdm-peg4000和四氨基锌酞菁(znpc)按照1:4的摩尔比加入到无水四氢呋喃中充分溶解，调节转子搅拌速度为400rpm，在氮气保护下反应24h，真空干燥得到粗产物，将粗产物溶于二氯甲烷中，离心收集固体，除去上清溶液中过量的znpc，真空干燥即为产物peg4000-cdm-znpc。

6、制备cdm-peg4000-znpc-s-s-：

将羧基二硫吡啶溶于dmf中，加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，反应活化羧基30min，然后加入peg4000-cdm-znpc，在氮气保护下，常温反应12～24h，调节转子搅拌速度为400rpm，反应结束后真空干燥去除反应体系中的dmf溶剂，继续溶于水中，用分子量为1000的透析袋透析处理3d，去除过量的edc、nhs以及羧基二硫吡啶，最后真空冷冻干燥得到墨绿色固体即为产物peg4000-cdm-znpc-s-s-；

反应过程中羧基二硫吡啶、nhs、edc和peg4000-cdm-znpc的摩尔比为1:5:5:2。

7、制备peg4000-cdm-znpc-s-s-ha

将制备的巯基化透明质酸(ha-hs)溶于10ml的pbs溶液中、peg4000-cdm-znpc-s-s-溶于dmf中，混合后在氮气保护下，25℃搅拌反应48h，反应结束后用分子量为3000的透析袋透析处理4d，然后用乙醇沉淀，沉淀得到的产物经过冷冻干燥即为目标产物生物级联反应式光动力集成生物聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)，其结构是如下所示：

其中n＝113。

实施例2

对实施例1中制备的生物级联反应式光动力集成生物聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)进行在酸性条件下的体外模拟实验：

实施例1中制备得到的生物级联反应式光动力集成生物聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)的tem图如图1中a所示，可以看出聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)为不规则大分子，没有形成纳米颗粒。接下来将将实施例1中制备得到的生物级联反应式光动力集成生物聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)在ph＝6.5的酸性条件下进行处理，处理后产物的tem和sem图分别如图1中b和c所示，可以看出聚合物在ph＝6.5的酸性条件处理后已经形成纳米颗粒，说明本发明制备的生物级联反应式光动力集成生物聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)在ph＝6.5的酸性条件下能够发生自组装，形成纳米颗粒。

测试本发明的中间产物znpc-s-s-ha和znpc的紫外吸收，其结果如图2所示，四氨基锌酞菁(znpc)的紫外吸收中有650cm^-1和720^-1的特征峰，而在znpc上连接s-s和ha后形成的中间体znpc-s-s-ha中，相应的特征峰消失，形成一个宽峰；说明在本发明的反应过程中确实将二硫键(s-s)与质酸分子(ha)连接在了四氨基锌酞菁上，才能在紫外吸收峰上发生红移现象，以便后续对peg4000进行修饰连接。

测试实施例1中制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)分别在ph＝6.5和ph＝7.4的溶液中处理后的粒径分布情况，其结果如图3所示，说明本发明制备得到的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)在在ph＝6.5和ph＝7.4的溶液均能够进行自组装形成纳米颗粒，同时不同的酸性环境对其自组装形成的产物的影响不同。

将不同的物质添加到肿瘤细胞中形成的肿瘤细胞吞噬效果图如图4所示，其中a1～a4中未添加任何物质，属于空白对照组，b1～b4为添加的是本发明制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)，c1～c4中添加的是本发明制备的聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)经过ph＝6.5的酸处理后的物质。通过图4中显示的肿瘤细胞吞噬效果对比结果，可以看出本发明制备的聚合物经过ph＝6.5的酸处理后自主装形成纳米颗粒更容易被肿瘤细胞吞噬。

在光照和未光照的条件下对聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)和中间产物znpc-s-s-ha进行细胞毒性测试，得到的mtt图如图5和图6所示。可以看出无论光照还是不光照的条件下，聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)对细胞都是无毒性的；而中间产物znpc-s-s-ha由于聚合物(peg4000-cdm-znpc-s-s-ha)经过酸处理后，导致其中的peg断裂，形成的亲疏水产物znpc-s-s-ha能够自组装形成纳米颗粒，并且在ha(透明质酸)的作用下靶向肿瘤细胞，被肿瘤细胞更多的吞噬，在肿瘤细胞高gsh作用下，二硫键断裂，释放光敏剂，在激光器的照射下，光敏剂产生ros，杀死肿瘤细胞。

通过以上的测试结果，说明通过本发明的制备方法能够得到一种生物级联反应式光动力集成生物聚合物peg4000-cdm-znpc-s-s-ha，将光敏剂酞菁锌(znpc)通过ph-酸响应性的马来酸酰胺连接物与peg4000结合，然后使用氧化还原可裂的二硫连接物固定化到透明质酸(ha)链上，其中的peg段可增强静脉给药后分子载体的血液循环，到达酸性肿瘤微环境后脱落，使残留的znpc-s-s-ha原位自组装成大团簇，避免逆向扩散，提高肿瘤保留率；同时由于具有亲水性、可降解性以及特异性结合肿瘤细胞膜上过表达的cd44的能力，ha被用作载体底物和肿瘤靶向配体。而本发明的聚合物由于ha和peg片段的亲水作用，经静脉给药后，peg4000-cdm-znpc-s-s-ha在体液中的分散性高，循环寿命长。当到达肿瘤微环境时，酸性环境ph可通过裂解顺丁烯二酸酰胺连接物来去除peg片段，导致整体疏水性急剧增加，空间阻碍降低，剩下的znpc-s-s-ha在znpc分子间疏水相互作用的驱动下自组装成簇，增强了ps-载体在肿瘤组织中的保留，聚集的znpc-s-s-ha可通过透明质酸介导的内吞作用被肿瘤细胞有效内化，随后细胞内高浓度的谷胱甘肽(gsh)可裂解二硫键并以非聚集形式释放znpc分子，从而优化pdt的疗效。预期这种聚合激活的序贯性肿瘤靶向可以提高ps递送到肿瘤组织的效率和特异性，同时在轻度刺激下进一步增加ros的产生，从而更好的杀死肿瘤细胞。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。