一株耐酸且兼性厌氧的锰氧化细菌及其应用的制作方法

本发明属于环境工程领域，具体涉及一株耐酸且兼性厌氧的锰氧化细菌及其应用。

背景技术：

锰在陆地和水生系统中含量丰富，是生物体不可缺少的微量元素之一。但锰浓度过高，人体会慢性中毒，并引发多种脑神经疾病。世界各国锰污染主要有：锰矿废弃地、锰矿尾渣等造成的水体及土壤的污染，电解二氧化锰和金属锰、钢铁冶炼等行业产生的含锰废水和废渣造成的水体及土壤的污染。由于锰污染的严重性和普遍性，脱锰技术成为世界各国的研究热点。

具有猛氧化能力的微生物种类繁多，并广泛地分布于海洋、淡水和十壤环境中。前已报道的猛氧化细菌主要分布在变形菌亚纲、放线菌门和厚壁菌门等。研究最多的主要包括三株分离自海洋的模式菌如牛盘纤发菌ss-1和sp-6、恶臭假单胞菌mnb1和gb-1和芽孢杆菌sg-1。此外，近年来不断有其它的猛氧化菌属被报道，如气单胞菌属、生金菌属、假单胞菌属、杆状菌属、纤发菌属、土微菌属、弧菌属、细枝发菌属、节杆菌属、生丝微菌属、海洋螺菌属、红球菌属等。

环境因素强烈影响着微生物的生长繁殖、新陈代谢等生命活动。影响锰氧化菌活性和锰氧化能力的主要因素研究较多的有ph、温度、溶氧、光照、共存离子种类和浓度等。ph是影响猛氧化微生物生长代谢的一个重要环境因素，且与氧化活性的表达密切相关。大多生物猛氧化的最适ph为中性，当低于6或高于8.5后，氧化作用会受到强烈抑制。mn²⁺浓度过高也会对猛氧化菌的生长及氧化活性产生抑制作用，而不同种类的微生物的耐受性不尽相同。目前大部门报道的锰氧化菌在锰离子浓度低于2mm时表现出较好的锰氧化能力，锰离子浓度高于30mm后则大部分不具有锰氧化能力。芽孢菌属bacillusspsg-1在10mmmn²⁺条件下依然具备氧化的能力，但其去除率并不高。此外，目前认为，大部分生物氧化锰是一个严格需氧的过程，且猛氧化量会随着氧浓度的增加而增大。

已经公开报道的锰氧化菌主要用于ph中性条件下，极端酸性环境中筛选获得锰氧化菌的报道还相对有限。另一方面，在一些氧限制条件下的高猛天然环境中，若能筛选出具有兼性厌氧特征的锰氧化菌，将可以更好的适应缺氧环境，从而适合用于生物原位修复技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株耐酸且兼性厌氧的锰氧化细菌及其在水体或固体基质中的应用。

本发明为实现发明目的，采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一株耐酸且兼性厌氧的锰氧化细菌，所述细菌为短芽胞杆菌，分类命名为brevibacillusbrevis，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60819，保藏日期为2019年10月23日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)是从马鞍山酸性矿山废水中筛选出的一株具有耐酸能力的锰氧化细菌，并通过驯化提高了该菌株在酸性条件下去除锰的能力，从而得到一株能够高效脱锰的锰氧化细菌，该菌株具有兼性厌氧特征，还能够同时去除其它重金属。

所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)为革兰氏阳性菌，呈短杆状(0.6-1.2μm)，具有运动性，不能水解淀粉，氧化型葡萄糖氧化发酵，接触酶阳性，氧化酶阴性，v-p实验阴性，甲基红实验阴性，吲哚实验阴性，硝酸盐还原实验阳性。

进一步地，所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)在ph＝4～7的条件下能生长并且具有mn²⁺氧化活性，优选为ph＝5.5～7。

进一步地，所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)在mn²⁺浓度不大于30mm时，能生长并且具有mn²⁺氧化活性。

第二方面，本发明提供了一种用于除锰的微生物菌剂，所述微生物菌剂包含所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)作为活性成分。所述微生物菌剂中可以根据需要添加适当的辅料。

第三方面，本发明提供了所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)用于去除水体或固体基质中的mn²⁺的应用。本发明的所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)能在不灭菌的水体或固体基质中生存并发挥mn²⁺氧化活性，因此可用于去除水体或固体基质中的mn²⁺。

第四方面，本发明提供了一种去除水体或固体基质中mn²⁺的方法，是将所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)或包含所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的微生物菌剂接种到待处理的水体或固体基质中，在ph＝4～7(优选为5.5～7)的条件下进行培养，即完成mn²⁺的去除。

进一步地，培养时间因细菌添加时的活性和水体或固体基质的条件而异。

进一步地，可以利用本发明的短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)进行mn²⁺去除的水体包括但不限于酸性矿山废水、酸性工业废水、生活废水、地下水或自来水，可以利用本发明的短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)进行mn²⁺去除的固体基质包括但不限于土壤或沉积物。

另外，本发明的所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)和包含所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的微生物菌剂除可去除mn²⁺之外，还可以去除其它重金属(如铁、铜、锌、铬、镉、砷)。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明的短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)具有较高的锰氧化能力，可以高效去除酸性和中性条件下水体或固体基质中的mn²⁺，同时还可以去除包括铁、铜、锌、铬、镉、砷在内的其它多种重金属，应用前景广阔。

2、本发明的短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)具有耐酸能力，且为兼性厌氧菌，在较低溶解氧时也有较好的活性，使其环境适应性更强，可用于酸性矿山废水或酸性工业废水中重金属的去除，可适应不同溶解氧条件下的废水，同时也适合用于缺氧环境下的生物原位修复技术。

3、本发明的短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)在mn²⁺浓度达30mm时仍能生长并且具有mn²⁺氧化活性，该浓度远高于常见水体和固体基质中的mn²⁺浓度。

4、本发明可以通过固定化技术将所述短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)制成生物材料，相对于物理化学法成本低、对不同污染水体适应性强且无二次污染，在含锰废水和地下水的生物处理过程中具有非常好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)氧化锰离子生成固相产物的xps扫描图(图1中raw代表检测出的未经处理的原始峰数据，background代表仪器本底值，peak1～3代表将原始数据处理之后获得的锰元素价态峰，sum代表处理之后所有数据的总和，用于与raw比对，确保处理之后数据不失真)。

图2为本发明实施例2中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的扫描电镜图片。

图3为本发明实施例2中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的革兰氏鉴定结果。

图4为本发明实施例2中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的系统进化树发育图。

图5为本发明实施例3中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)在不同ph条件下的菌体浓度变化(5(a))及其对锰元素的去除率示意图(5(b))。

图6为本发明实施例4中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)在不同初始锰离子浓度时的锰离子去除率示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用培养基和溶液的配方如下：

lb培养基的配方为：10g/l胰蛋白胨、10g/lnacl、5g/l酵母提取物，121℃高压灭菌20min。

含锰液体培养基的配方为：10g/l胰蛋白胨、10g/lnacl、5g/l酵母提取物、0.755g/lmnso4，在氮气保护下121℃高压灭菌20min。

postage液体培养基的配方为(a液和b液中各成分的浓度皆为其在最终培养基中的浓度)：

a液：0.5g/lkh2po4、1.0g/lnh4cl、1.0g/lna2so4、0.1g/lcacl2·2h2o、2.0g/lmgso4·7h2o、1.0g/l酵母膏、3.5g/l乳酸钠，待所有药品充分溶解后，调节培养基ph＝7，分装在50ml血清瓶中，每瓶最终培养基体积40ml，充入过量氮气，在氮气保护下高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min；

b液：0.1g/l抗坏血酸、0.5g/l(nh4)2fe(so4)2·6h2o；

待a液冷却至60℃以下，再在无菌环境下用无菌一次性注射器注入用0.22μm滤头过滤灭菌的b液。

postage固体培养基的配方为(a液和b液中各成分的浓度皆为其在最终培养基中的浓度)：

a液：0.5g/lkh2po4、1.0g/lnh4cl、1.0g/lna2so4、0.1g/lcacl2·2h2o、2.0g/lmgso4·7h2o、1.0g/l酵母膏、3.5g/l乳酸钠、15g/l琼脂粉，待所有药品充分溶解后，调节培养基ph＝7，分装于500ml广口瓶中，在氮气保护下高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min；

b液：0.1g/l抗坏血酸、0.5g/l(nh4)2fe(so4)2·6h2o；

待a液冷却至60℃以下，再加入用0.22μm滤头过滤灭菌的b液，并于60℃保温备用。

实施例1、短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的筛选分离及纯化

本实施例中短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)的筛选步骤如下：

(1)培养基的配置：按照上述配方配置lb培养基、含锰液体培养基、postage液体培养基和postage固体培养基。

双层postage固体平板的制作：先倒一层postage固体平板，在接种操作完成后，立即再倒一层平板覆盖，此法可使菌体生长于兼性厌氧环境。

(2)菌源的富集：将提取自马鞍山酸性矿山废水的菌液按照5％(体积比)的接种比例接种于postage液体培养基中，于35℃、120rpm恒温摇床避光培养约15d后，挑选培养基明显浑浊的血清瓶重复此步骤，反复几次获得高浓度菌液。

(3)锰氧化菌的分离纯化：将步骤(2)获得的高浓度菌液按照10、100、1000、10000的倍数稀释于无菌水中，在无菌环境下各取20μl稀释后的菌液均匀涂布于双层postage固体平板上，于35℃恒温避光培养箱培养3d，选择菌落数适中的固体平板，挑取单菌落划线于双层postage固体平板上，重复此步骤直至获得菌落形态统一，获得待筛菌株。

(4)锰氧化菌的初筛：挑取步骤(3)中获得的待筛菌株，接种于lb培养基中。于35℃、120rpm恒温摇床培养48h后，按1％(体积比)的接种量接种于含锰液体培养基中。于35℃、120rpm恒温摇床培养72h后，采用火焰原子吸收法测定溶液中的剩余锰浓度，并测定培养液的ph值，与相同条件下培养的无菌空白试验组进行对照。结果表明，初筛阶段编号为mm2的菌株对锰表现出很强的去除能力，初始锰浓度5mm时培养3d对锰的去除率可达88.7％。

(5)锰氧化菌的复筛：将初筛获得的编号为mm2的菌株接种于含锰液体培养基中，于35℃、120rpm恒温摇床培养72h后，取菌液在低温高速离心机中于8000xg转速离心获得沉淀，将沉淀真空干燥后磨成粉进行xps扫描，如图1所示，检测到沉淀物中含有氧化态锰的峰值，说明该菌有氧化锰的能力。将具有锰氧化活性的菌株(即为本发明筛选获得的编号为mm2的菌株)接种在甘油管中，置于-80℃冰箱保存。通过上述路线分离得到一株编号为mm2的菌株，证明该菌株具有锰氧化的能力。

实施例2、锰氧化菌的鉴定

对上述获得的一株编号为mm2的菌株进行形态鉴定、生化鉴定及16srrna测序分析：

1、该菌的生理生长形态为：液体培养基中分散，不形成菌膜；在固体培养基上菌落呈白色，不透明，表面光滑，边缘规则；

2、该菌为杆菌，如图2所示为扫描电镜结果。

3、如图3所示，革兰氏鉴定结果为革兰氏阳性菌：已知革兰氏阳性菌呈蓝紫色、革兰氏阴性菌呈红色，图3中革兰氏染色后呈蓝紫色，所以为革兰氏阳性菌。

4、生化鉴定结果为：兼性厌氧，呈短杆状(0.6-1.2μm)，具有运动性，不能水解淀粉，氧化型葡萄糖氧化发酵，接触酶阳性，氧化酶阴性，v-p实验阴性，甲基红实验阴性，吲哚实验阴性，硝酸盐还原实验阳性。

5、细菌基因组dna提取及16srrna序列分析：

(1)细菌基因组dna提取、pcr扩增及测序实验均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，所获得的基因序列如seqidno.1所示。

(2)将获得的序列在ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)上的blast程序在genebank中进行核苷酸同源性比较。结果显示genebank中该菌株mm2与登录号为nr113589.1的相似性为99％，鉴定其为短芽胞杆菌，芽胞杆菌属，命名为brevibacillusbrevismm2。系统进化树如图4所示。

实施例3、短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)用于处理不同ph含锰废水

将冷冻保藏的菌株解冻，并接种至过滤灭菌的lb培养基中，在35℃、转速120rpm下培养1d以恢复其活性。

在lb培养基中事先加入定量硫酸锰至初始锰离子浓度为10mm，并分别调节初始ph为4、5.5、7和8。调节接种量使培养基中的初始菌液od600值为0.1，并设置一个空白组。在35℃、转速120rpm的条件下培养，并分别在培养1d、2d和3d时取样，对菌液进行离心，取上清液，过滤，测试其中的锰元素含量(火焰原子吸收光谱法)，对比空白组，确认菌株在不同ph条件下的菌体浓度变化及其对锰元素的去除效率，结果分别如图5(a)和5(b)所示。

相比于初始ph＝7，当初始ph＝5.5时，短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)经过一段时间的适应之后，仍可以达到较高的浓度，且最终对mn²⁺离子保有一定的去除能力；而当ph＝4时，短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)表现出不能很好的适应该培养环境的特征，且对mn²⁺离子的去除能力相当低下，因此推测该菌株对弱酸性环境具有较好的适应能力，可以处理较弱酸性的废水，但是对于较强酸性的环境则不能很好适应。而当ph＝8时，菌株同样表现出不能很好的适应该培养环境的特征，且对mn²⁺离子的去除能力较弱，说明该菌株不适宜在较碱性的初始条件生长。

因此，该菌株适宜用来修复弱酸性的含锰酸性矿山废水或者酸性工业废水。

实施例4、不同mn²⁺浓度下短芽胞杆菌(brevibacillusbrevismm2)对mn²⁺离子的去除

在lb培养基中事先加入不同浓度的硫酸锰并调节接种量，使培养基中的初始mn²⁺浓度分别为1、5、10、20和30mm，初始菌液od600值为0.1，并设置一个空白组。在35℃、转速120rpm的条件下培养，并分别在培养1d、2d和3d时取样。对菌液进行离心，取上清液，过滤，测试其中的锰元素含量(火焰原子吸收光谱法)，对比空白组，确认菌株在不同mn²⁺浓度下对锰元素的去除效率，结果如图6所示。当mn²⁺浓度小于等于10mm时，菌株brevibacillusbrevismm2均对mn²⁺的去除率高达90％以上，而当mn²⁺浓度达到30mm时，仍然可以去除20％的mn²⁺。这表明该菌株可以用来高效修复含锰地下水，并可以用来处理高浓度的含锰废水。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>合肥工业大学

<120>一株耐酸且兼性厌氧的锰氧化细菌及其应用

<130>2020

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1469

<212>dna

<213>brevibacillusbrevis

<400>1

tcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgagggttttcggaccc60

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