一种可降解苯磺隆的成刚菌BI-1及其培养方法和应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种可降解苯磺隆的成刚菌bi-1及其培养方法和应用。

背景技术：

磺酰脲类除草剂是目前世界上使用量第二大的除草剂，其除草机理是抑制植物体内乙酰乳酸合成酶(als)的活性，进而阻断支链氨基酸的合成，使细胞停止在有丝分裂阶段，杂草停止生长而死亡。苯磺隆是20世纪80年代由美国杜邦公司开发的一种内吸传导型磺酰脲类除草剂，主要用于防除各种一年生阔叶杂草，具有高效、光谱、高选择性等特点，在我国长江、黄河和淮河流域有着广泛的使用范围，但因其使用年限的延长、施用量的增加以及施用操作不当等原因，对土壤、水体、生物及大气等诸多环境因子造成大量污染，影响农田轮作与生产。因此，解决苯磺隆的残留问题对改善除草剂对作物的药害，修复受除草剂污染的土地有重要的理论意义和实际价值。

在生态系统中，微生物作为分解者，具有代谢类型多样，适应能力强的特点，能通过代谢土壤中的有机污染物，使其转化成无毒或者低毒物质。微生物降解具有安全、快速、廉价、无二次污染的特点，大量研究已经表明微生物对农药污染土壤的修复是一种行之有效的方法，对农产品安全与环境保护有着重要的意义。国内外苯磺隆的研究主要集中在田间药效、残留分析方法研究及其对植物生理特性的影响等方面，关于苯磺隆降解菌株的分离鉴定研究较少。

目前，已经公开的可降解苯磺隆的菌株较少，现简述如下：中国专利文献cn102154141a公开了一种降解苯磺隆的假单胞菌nyz42菌株(保藏编号为cctccno:m2010222)，该菌株可以在5日内降解200mg/l的苯磺隆，降解效率达80％；中国专利文献cn102321539a公开了一种复合微生物菌剂，该微生物菌剂分别以食苯芽孢杆菌accc10244和解几丁质芽孢杆菌accc10227为菌源进行生产发酵获得，该复合微生物菌剂可用于降解包括苯磺隆在内的多种磺酰脲类除草剂；中国专利文献cn106834149a公开了一种成刚菌属噬甲基短杆菌及其在降解磺酰脲除草剂的应用，该成刚菌属噬甲基短杆菌从南京农药厂污水处理池的污泥中分离得到，保藏编号为成刚菌属噬甲基短杆菌cgmccno.11649。将含有活菌数目3.2×10⁹个/ml的该成刚菌属噬甲基短杆菌cgmccno.11649以1/10(v/v)的接种量将上述菌体分别接种于以50mg/l氯嘧磺隆、甲磺隆、苯磺隆、醚磺隆和氯磺隆为唯一碳源的无机盐培养基中，30℃、180r/min条件下培养，每12h取样一次，检测氯嘧磺隆等磺酰脲除草剂的残留量。实验结果表明，经过最初20h适应期后，菌株对氯嘧磺隆、甲磺隆和苯磺隆表现出较强降解活性。反应60h，3种除草剂的降解率均已达到了90％。

当前，可降解苯磺隆的微生物菌株仍较少，并且原位修复技术尚不成熟，有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明提供一种可降解苯磺隆的成刚菌菌株chenggangzhangellasp.bi-1，该菌株在苯磺隆初始浓度50mg/l以下时，48h即可使苯磺隆完全降解，对低浓度苯磺隆的降解效果更好，该菌株的发现可以为苯磺隆污染的修复提供新的种质资源。一种可降解苯磺隆的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1，其特征在于，其保藏号为cctccno.m2019586。

本发明的第二目的在于提供一种如上所述的可降解苯磺隆的成刚菌bi-1的培养方法，其采用如下技术方案：采用me培养基对所述菌株bi-1进行培养。

本发明的成刚菌bi-1的发酵培养方法，该发酵培养方法采用如下技术方案：采用me培养基(g/l，1.0nh4no3，0.5nacl，1.5k2hpo4，0.5kh2po4，0.2mgso4·7h2o，1％甲醇)培养菌株bi-1至对数生长期后，接种于含有酵母粉0.3-0.5％、蛋白胨0.4-0.6％和氯化钙0.001-0.002％的发酵培养基进行发酵培养。

优选的，发酵培养时，发酵罐中培养温度为30-35℃，接种比例为15％，通气量为1:0.8，搅拌速度为200r/min，ph为7.2。

优选的，在发酵过程中，还包括向发酵罐中补料的操作，每32h补充发酵培养基一次，发酵时间共80h，发结束后活菌数量达10⁹个/ml以上。

本发明的第三目的在于提供一种用于降解土壤中苯磺隆的菌剂，该菌剂采用如下技术方案：所述菌剂包括如上所述的可降解苯磺隆的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1。在实际使用时，可将菌株bi-1与适当的载体(如肥料、液体、造粒辅料等)混合以制备所述菌剂。该菌剂的剂型可为液体、干粉(干燥菌株bi-1的发酵培养液等方法)、颗粒剂(与常用的辅料混合)等。

优选的，所述菌剂的剂型为液体剂，所述菌剂通过上述任意一项所述发酵方法制成，其中菌株bi-1的活菌数为10⁹个/ml以上。

本发明的第四目的在于提供一种降解苯磺隆的方法，采用如下技术方案：采用菌株bi-1或采用以所述成刚菌bi-1为原料制成的如上述任意一项所述的菌剂来对样品中的苯磺隆进行降解。例如，将该菌剂用于水体、土壤等样品中苯磺隆的降解。

优选的，种植黄瓜幼苗，以灌根方式接种降解菌剂，提高菌株bi-1在土壤中的存活能力，进而促进根际土壤中苯磺隆的降解效率。

本发明还提供了一种提高如上所述的可降解苯磺隆的菌株bi-1存活能力的方法，具体技术方案为：所述成刚菌bi-1能定殖在黄瓜根系，利用根系分泌物进行生长，提高生物量。

本发明的有益效果是：1.本发明公开的苯磺隆降解细菌是从长期施用磺酰脲类除草剂农田土壤中分离得到，可高效降解苯磺隆。实验室条件下，添加菌株bi-1至培养基中反应2d，可以完全降解50mg/l苯磺隆，可以为苯磺隆污染土壤的修复提供新的种质资源；

2.本发明公开的苯磺隆降解菌剂制备工艺流程简单，原料来源广泛，成本低，易于大规模推广。

3.本发明的菌株bi-1分离自农田土壤，并能够在黄瓜根际定殖，提高存活能力，对田间复杂修复环境的适应能力强，并且菌株降解苯磺隆的产物对黄瓜无明显药害，既解决了农业活动中苯磺隆污染的问题，同时又能生产出绿色、无农药毒害的农产品，实现修复种植同步进行。

4.相较于传统的物理化学修复方法，本发明提供的菌株bi-1与黄瓜联合修复，可提高降解菌剂的田间利用率，见效快，无二次污染，更加科学环保。

本发明的菌种保藏日期为2019年7月26日，保藏编号：cctccno.m2019586。分类命名为成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1在me培养基上的菌落形态图；

图2为本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1对苯磺隆降解效果的液相色谱图，图2a为仅含有苯磺隆、未接种菌株bi-1反应后的液相色谱图，图2b为培养基中含有苯磺隆且接种有本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1并培养2d的液相色谱图。

图3a为温度对本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1降解苯磺隆影响的柱状图，图3b为ph对本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1降解苯磺隆影响的柱状图，图3c为苯磺隆初始浓度对本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1降解苯磺隆影响的柱状图；

图4中：左图为未接种本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1的条件下培养5d的黄瓜根系图，右图为接种本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1的条件下培养5d的黄瓜根系图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1的筛选和鉴定

取5g长期施用磺酰脲类除草剂的农田土样(南京市江宁区，31.95°n118.85°e)，加入到含50mg/l苯磺隆的100ml基础盐培养基中，30℃、180rpm振荡培养5d，按10％的接种量，每5d转接一次，重复3次后测定富集液对苯磺隆的降解效果，对有降解效果的富集液梯度稀释，涂布于50mg/l的苯磺隆基础盐固体培养基平板上，30℃培养至单菌落生成，挑取单菌落液体培养至对数期，接种至20ml含有50mg/l苯磺隆的基础盐培养基中(g/l，1.0nh4no3，0.5nacl，1.5k2hpo4，0.5kh2po4，0.2mgso4·7h2o)，培养4d，检测单菌落的降解效果。

菌株对苯磺隆的降解采用高效液相色谱法(hplc)：向反应后的培养基中加入20ml二氯甲烷，旋涡震荡1min，静置分层移除上层水相，有机相中加入无水硫酸钠，取2ml有机相液体自然风干，0.2ml甲醇重悬，0.22μm尼龙滤膜过滤，hplc(岛津rid-10a)检测苯磺隆含量。高效液相色谱条件：色谱柱，c18反相柱(250mm×4.6mm×5μm,agilenttechnologies,paloalto,ca,usa)；流动相，乙腈∶水∶乙酸(60∶40∶0.5)；柱温，40℃；流速，1.0ml/min；检测波长，230nm；进样量，20μl。

通过上述分离路线，筛选得到了一株细菌，命名为bi-1，并验证该菌株对苯磺隆具有优良的降解能力。

实施例2成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1的鉴定

挑取具有降解能力的单菌落，接种至me液体培养基中，培养至对数期，利用常规的生理生化测定方法对菌株进行鉴定，实验步骤参照说明书即可。同时将菌株划线至me固体培养基上，观察菌落形态的形态特征。

形态特征：培养3d后，其菌落直径约为0.5-1.0mm，白色，圆形，凸起(详见说明书附图1)

生理生化鉴定结果如下：生理生化鉴定结果显示菌株bi-1是革兰氏阴性菌，严格需氧，最适生长温度为30℃，最适ph为7.0，最适盐浓度为2.0％，氧化酶、过氧化氢酶与脲酶阳性，硝酸盐还原，吲哚生成呈阴性。蔗糖、麦芽糖、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、d-葡萄糖酸、丙酮酸甲酯、dl-苹果酸、乙酸和甲酸可被菌株利用生长，但不能利用肌醇、糊精、海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖。

提取菌株bi-1基因组dna，并作为模板，以通用引物27f(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)与1492r(5′-taccttgttacgactt-3′)，pcr扩增菌株的16srrna基因序列。pcr反应体系如下(30μl)：2×easytaqpcrsupermix15μl，27f(25pmol/μl)1μl，1492r(25pmol/μl)1μl，dna1μl，ddh2o12μl。反应条件：95℃，5min；94℃，30s；55℃，30s，72℃，1.5min；72℃，10min，10℃，5min，其中第二步到第四步循环30次。利用omega回收试剂盒对扩增片段进行纯化回收，t/a克隆后测序。

菌株bi-1的16srrna基因序列(1451bp)如下：

gagtttgatcctggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcgcatccttcggggtgagcggcagacgggtgagtaacgcgtggggatgtgcctggtggtacggaacaactcatggaaacgtgagctaataccgtataagcccttttggggaaagatttatcgccaccagatcaacccgcgttggattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctctttcactggggaagataatgacggtacccagagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatactaagggggctagcgttgttcggaatcactgggcgtaaagcgcacgtaggcggagtcttaagtcagaggtgaaatcccaaggctcaaccttggaactgcctttgatactgggtgtcttgaggtcgagagaggtgagtggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggctcactggctcgattctgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattacctgataccctggtagtccacgccgtaaacgatggaagctagccgttggtcagcatgctgatcagtggcgcagctaacgctttaagcttcccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcctttgacatcctgtgccactcagagagatttgaggttcccttcggggacgcagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccctagttgccagcattcagttgggcactctagggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggcagcgaaggggtgacccggagctaatctccagaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgttgcgctaacccgcaagggaggcaggcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgta

测序结果进行在线分析(www.ezbiocloud.net)，ezbiocloud数据库比对结果表明菌株bi-1与chenggangzhangella属的亲缘关系最近，其中与chenggangzhangellamethanolivoranschl1^t的16srrna基因序列相似度达到99.79％，与其他菌株的序列相似度均不超过98％。通过neighbor-joining法构建菌株bi-1的系统进化树，菌株bi-1位于chenggangzhangella属进化树内部，并与chenggangzhangellamethanolivoranschl1^t构成了一个亚分支，结合bi-1的生理生化特征，将菌株bi-1鉴定为chenggangzhangella属中不同于chl1^t一株细菌，保藏编号：cctccno.m2019586。

实施例3菌株chenggangzhangellasp.bi-1的培养条件筛选

研究温度、ph与苯磺隆初始浓度对菌株bi-1降解的影响：

接种菌株bi-1单菌落至me液体培养基中，培养至对数期，调节至10⁸cfu/ml待用。

以5％(v/v)的比例接种bi-1菌悬液至50mg/l苯磺隆的基础盐液体培养基中，分别在15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃摇床中，160rpm震荡培养2d，hplc计算苯磺隆的浓度；以5％(v/v)的比例接种bi-1菌悬液至50mg/l苯磺隆的基础盐液体培养基中，调节ph至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，30℃，160rpm震荡培养2d，hplc计算苯磺隆的浓度；以5％(v/v)的比例接种bi-1菌悬液至10、25、50、100、200mg/l苯磺隆的基础盐液体培养基中，30℃，160rpm震荡培养2d，并设置不接种bi-1菌悬液的对照组，hplc计算苯磺隆的浓度(hplc检测方法同实施例1)。

图2a为仅添加有50mg/l苯磺隆的基础盐液体培养基的hplc检测图谱，图2b为添加有50mg/l苯磺隆的基础盐液体培养基并接种bi-1菌悬液、震荡培养2d的hplc检测图谱；由图2可知，添加菌株bi-1至培养基中反应2d，即可完全降解50mg/l苯磺隆，本发明的菌株bi-1的发现丰富了苯磺隆降解菌株的种质资源，且本发明的成刚菌chenggangzhangellasp.bi-1对低浓度苯磺隆的降解效率更高。

如图3a所示，菌株bi-1最适降解温度为30℃；如图3b所示，菌株bi-1的最ph为7.0；如图3c所示，苯磺隆初始浓度在50mg/l以下，反应2d均能完全降解；浓度达到100mg/l，降解率为70.3％；升至200mg/l时，对菌株降解影响较大，降解率仅为25.2％。

实施例4菌株chenggangzhangellasp.bi-1的发酵及菌剂的制备

me固体培养基上活化菌株bi-1后，接种至多瓶含400mlme液体培养基中，培养至对数期，作为接种发酵罐的种子液。发酵罐500l，投料量420l，发酵培养基配方(％)：酵母粉0.3，蛋白胨0.5，氯化钙0.001。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30-40℃，将上述对数期菌种按15％(v/v)的比例接入发酵罐中。温度控制在30℃，培养过程中无菌空气的通气量为1：0.8，搅拌速度为200r/min，ph7.2，每32h补料一次，整个工艺流程培养时间为80h，结束后活菌数量达到10⁹个/ml以上，25kg桶装液体剂型。

实施例5将菌株chenggangzhangellasp.bi-1用于降解土壤中的苯磺隆

将黄瓜种子置于装有无菌水的培养皿中，浸泡过夜后，转移到8％的naclo中震荡消毒3min，用无菌水反复清洗5次，置于湿润的无菌纱布上，25℃暗处萌发2d，挑选萌发良好的种子接种在无菌的hoagland半固体培养液，置于人工气候培养箱中，以25℃，16h光照和22℃，8h黑暗为一周期，培养3d待用。

采集农田土壤(未检测到苯磺隆)装至盆钵中，每盆450g，加入苯磺隆至3mg/kg，搅拌均匀，喷水使土壤保持一定的含水量，每个盆钵种植3颗黄瓜幼苗，灌根接种上述所制菌剂，向每颗幼苗根部注入10ml，另设仅添加菌剂与仅添加苯磺隆的处理，添加苯磺隆与菌剂但未种植黄瓜的处理，以及未进行处理的样品作为空白对照，每个处理设置3个平行。

将按照上述设置的盆钵分别置于人工气候培养箱(gxz型智能光照培养箱，宁波江南仪器厂，gxz-500d)中，以25℃，16h光照和22℃，8h黑暗为一周期，培养20d。对于种植黄瓜的处理，每5d取一次根际土，测定苯磺隆的含量与菌株bi-1的数量，并取小段黄瓜根系样品，利用激光共聚焦显微镜(clsm,leicatcssp3)观察菌株bi-1在根系的定殖情况，菌株bi-1已被绿色荧光蛋白基因gfp，在蓝光激发下发出绿色荧光。对于未种植黄瓜的处理，随机采集土壤样品，测定苯磺隆含量，与种植黄瓜的根际土壤样品中的苯磺隆含量作对比。第20d测定黄瓜真叶面积、根长、茎叶鲜重和根系鲜重。

土壤中苯磺隆浓度的测定：称取5g收集的土壤样品，置于50ml离心管中，加入20ml的萃取液(pbs∶乙腈＝6∶4)，100rpm震荡2h，12000g离心30min，收集上清液。所得沉淀继续用20ml萃取液重悬，重复上述操作3次，将所得上清液合并，cleanerthxn固相萃取柱纯化萃取液，具体操作见说明书。n2吹干，1ml甲醇重悬，0.22μm尼龙膜过滤，hplc计算苯磺隆含量，液相色谱条件如上所述(同实施例1)。

实验结果：(1)菌株chenggangzhangellasp.bi-1对黄瓜药害的解除效果如下表1所示：

表1菌株bi-1对黄瓜药害的解除效果(20天)

注：对照：种植黄瓜，未添加菌株bi-1和苯磺隆；bi-1：种植黄瓜，仅添加菌株bi-1；苯磺隆：种植黄瓜，仅添加苯磺隆；苯磺隆+bi-1：种植黄瓜，添加苯磺隆与菌株bi-1。不同字母代表在p<0.05水平差异显著(邓肯检验)

如表1所示，黄瓜的各项指标，如真叶面积与根长等，因受到苯磺隆的药害而显著下降，当同时接种bi-1菌悬液，黄瓜的各项指标恢复到对照水平，而单独接种bi-1菌悬液对黄瓜的生长没有影响，表明菌株bi-1通过代谢苯磺隆，生成对黄瓜无药害的产物，从而降低对环境的危害。

(2)菌株chenggangzhangellasp.bi-1对苯磺隆的降解情况如下表2所示：

表2菌株bi-1对不同处理下苯磺隆的降解情况(降解率，％)

注：苯磺隆+bi-1+黄瓜：种植黄瓜，添加苯磺隆与菌株bi-1；苯磺隆+bi-1：未种植黄瓜，添加苯磺隆与菌株bi-1

由上表2可知：菌株bi-1单独修复3mg/kg苯磺隆污染土壤，培养5d与10d时对苯磺隆的降解率分别为54.7％与88.7％，15d无法检测到苯磺隆的存在；而种植黄瓜幼苗，并通过灌根接种bi-1菌悬液，培养5d时的降解率提高到77.9％，10d便无法检测到苯磺隆的存在，黄瓜的种植可起到促进菌株chenggangzhangellasp.bi-1对苯磺隆的降解的作用，提高苯磺隆的降解效率。

(3)激光共聚焦显微镜观察结果显示：菌株chenggangzhangellasp.bi-1可在黄瓜根系定殖(详见说明书附图4，图4中左图为未接种菌株bi-1的条件下培养5d的黄瓜根系图，右图为接种菌株bi-1的条件下培养5d的黄瓜根系图)，通过与黄瓜根系相互作用，利用根系分泌物，提高自己的存活能力，20d的菌株数量仍然有2.21×10⁶cfu/g，远高于未种植黄瓜幼苗处理的菌株数量(7.19×10⁴cfu/g)，进而提高降解效率。

本发明分离得到的苯磺隆高效降解菌株bi-1，是chenggangzhangella属中的菌株，丰富了苯磺隆降解的种质资源，并提供苯磺隆高效降解菌株的培养方法，同时提出以菌株bi-1与黄瓜联合修复苯磺隆污染土壤，接种后10d即可完全降解黄瓜根际土壤中3mg/kg苯磺隆，且降解产物对黄瓜无害，提高修复效率，具有高效，价廉，便利，无二次污染的优点。本发明对于苯磺隆污染环境的修复，保护生态环境有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>南阳师范学院

<120>一种可降解苯磺隆的成刚菌bi-1及其培养方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1451

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gagtttgatcctggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcg60

catccttcggggtgagcggcagacgggtgagtaacgcgtggggatgtgcctggtggtacg120

gaacaactcatggaaacgtgagctaataccgtataagcccttttggggaaagatttatcg180

ccaccagatcaacccgcgttggattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgac240

gatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagact300

cctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgc360

cgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctctttcactggggaagataatgacgg420

tacccagagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatactaagggggc480

tagcgttgttcggaatcactgggcgtaaagcgcacgtaggcggagtcttaagtcagaggt540

gaaatcccaaggctcaaccttggaactgcctttgatactgggtgtcttgaggtcgagaga600

ggtgagtggaactgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtgg660

cgaaggcggctcactggctcgattctgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacag720

gattacctgataccctggtagtccacgccgtaaacgatggaagctagccgttggtcagca780

tgctgatcagtggcgcagctaacgctttaagcttcccgcctggggagtacggtcgcaaga840

ttaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg900

aagcaacgcgcagaaccttaccagcctttgacatcctgtgccactcagagagatttgagg960

ttcccttcggggacgcagagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagat1020

gttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccctagttgccagcattcagttggg1080

cactctagggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctc1140

atggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggcagcgaag1200

gggtgacccggagctaatctccagaagccgtctcagttcggattgcactctgcaactcga1260

gtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttccc1320

gggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgttgcgc1380

taacccgcaagggaggcaggcgaccacggtagggtcagcgactggggtgaagtcgtaaca1440

aggtaaccgta1451