一种快速检测解脲支原体的RDA方法及试剂盒与流程

一种快速检测解脲支原体的rda方法及试剂盒
技术领域
[0001]
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于rda荧光法检测技术检测解脲支原体核酸的引物对、探针及相关试剂盒。


背景技术：

[0002]
解脲支原体（ureaplasma urealyticum，uu）是介于细菌和病毒之间的病原微生物，无细胞壁、结构简单、能自行复制，直径仅有15～25um，是目前能独立在体外培养基中繁殖和生长的最小微生物。uu是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症等都有关系，是性传播疾病的病原体之一，是引起非淋菌性尿道炎和泌尿生殖系统感染的主要病原体。男性患者感染uu后，会出现前列腺炎和尿道炎等疾病，还会干扰精子的活动和代谢，减少精子的数量甚至导致精子畸形，使精子与卵子的结合能力降低引发不孕。女性患者感染uu后会出现起尿道炎、子宫内膜炎、输卵管炎、宫颈炎、盆腔炎等疾病。而且uu会破坏女性的输卵管粘膜，造成输卵管粘连或阻塞，使受孕的通道受阻导致不孕。早期筛查，及时诊断并尽量早期治疗，对预防解脲支原体的交叉感染及避免不育不孕等后遗症的发生具有重要意义。
[0003]
目前uu检测实验室方法主要分为病原体检测（培养法）、免疫学检测和分子生物学法。液体培养基法是检测uu的经典方法，也是who推荐检测非淋菌性尿道炎的首选方法。该方法操作简单，对实验条件要求不高。但由于能分解尿素的细菌都可导致培养基颜色发生变化，例如流感嗜血杆菌、克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌等，故单纯依靠颜色的变化来判断会带来误判。固体培养法准确性非常好，但是这种方法操作繁琐，耗时长，对患者的检测带来不便，且临床研究表明其检测阳性率较低。因此，制约了其在uu检测临床上的应用。
[0004]
分子生物学的检测大多基于pcr，检测时需要依赖pcr仪或昂贵的实时定量pcr仪，及其它多种配套设备，需配备专门的pcr实验室和专业操作人员，其成本和应用范围均受到一定限制。随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如lamp（环介导核酸扩增技术）、hda（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增 dna。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 pcr 仪的依赖。若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。


技术实现要素：

[0005]
本发明要解决的技术问题是克服现有解脲支原体检测技术的缺陷和不足。研究得到一种解脲脲原体（uu）rda荧光法检测试剂盒，实现解脲支原体（uu）的快速检测，在检测uu的整个过程中，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，大大缩短了常规的检测时间，提高检测效率。
[0006]
本发明目的在于，提供一组优选后的检测解脲支原体的探针及引物对。
[0007]
所述探针核苷酸序列如seq id no .1或seq id no .2所示。
[0008]
优选地，采用两种方案设计rda荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（thf）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 thf 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于rda荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。
[0009]
所述核苷酸序列为seq id no .1的探针，其5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（thf）替代，其具体信息如下：uu-p1（seq id no .1）：5
’-
fam-tgacc[thf]aaatggtgtagaacatgagataga-bhq1
ꢀ-
3'所述核苷酸序列为seq id no .2的探针，其5’端第30位碱基t标记fam或者其他发光基团，第33位碱基用四氢呋喃残基（thf）替代，第35位碱基标记bhq1或者其他淬灭基团，3’端进行c3-spacer阻断修饰（seq id no .2）：uu-p2（seq id no .2）：5
’-
aatgtcaaaggaattgttgttgaccaaaa[fam-dt]gg[thf]g[bhq1-dt]agaacatgagataga[c3-spacer]
ꢀ-3’
所述引物对核苷酸序列如seq id no .3和seq id no .4所示，所述靶标序列如seq id no .5所示，其具体信息如下：uu-f1（seq id no .3）： 5
’-ꢀ
gataatgatg gaaatttaga aattcacac
ꢀ-3’
；uu-r1（seq id no .4）： 5
’-ꢀ
ggaataataa ccttgccatt agcatcaa
ꢀ-3’
。
[0010]
本发明另一个目的在于，提供一种基于恒温扩增技术的检测解脲支原体的试剂盒。
[0011]
所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及所述的探针及所述的引物。
[0012]
优选地，所述恒温扩增反应模块为恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂。
[0013]
优选地， 所述恒温扩增反应混合试剂为rpa或重组酶依赖型扩增技术（recombinase-dependent amplification，rda）恒温扩增反应混合试剂。
[0014]
本发明另一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术（recombinase-dependent amplification，rda）的检测解脲支原体的试剂盒。
[0015]
重组酶依赖型扩增技术（recombinase-dependent amplification，rda）通过以下技术方案实现：本发明利用生物信息学方法，对批量的蛋白结构进行分析模拟和高通量虚拟筛选，并通过大量的生物学实验验证，最终找到了新的稳定性高的重组酶组合。具体地，本发明开发了一种新的重组酶组合为重组酶kx和辅助蛋白ky，所述重组酶kx，其核苷酸序列如seq id no.6所示，氨基酸序列如seq id no.7所示，辅助蛋白ky的核苷酸序列如seq id no.8所示，氨基酸序列如seq id no.9所示。
[0016]
所述重组酶kx可以替代rpa反应中重组酶uvsx或reca使用，所述ky蛋白可以替代rpa反应中uvsy蛋白使用。
[0017]
重组酶kx与t4 uvsx 蛋白序列同源性为50%（201/395）。基于此重组酶组合，本团队开发了一种新的稳定性高、特异性强的重组酶依赖型扩增技术（rda）的检测方法和检测系统。本发明中重组酶kx的制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。且基于此重组酶组合开发的扩增技术，所需引物短（18-30bp），对靶标序列的长度要求低，适用性广。进一步的，该技术对核酸靶标序列的检测特异性好、灵敏度高，可在25-42℃的恒温条件下实现高灵敏、高精度的快速分子检测，检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景。
[0018]
所述重组酶kx和蛋白ky来源于escherichia phage pht4a噬菌体，escherichia phage pht4a属于myoviridae科，tevenvirinae亚科中slopekvirus属。
[0019]
所述重组酶kx和蛋白ky能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达。
[0020]
具体地作为一种可选择的方案，其制备方法如下：s1. 将目的基因表达片段导入表达载体中，得到重组表达载体；s2. 将所述重组表达载体转入表达菌，得到重组工程菌；s3. 对所述重组工程菌进行诱导培养，经过工程菌富集和超声破碎后离心得到未纯化的重组酶；s4. 将未纯化的重组酶经过层析纯化得到重组酶kx。纯化得到的重组酶kx在低温不出现凝结或沉淀的现象。
[0021]
其中，步骤s1中所述目的基因表达片段含有如seq id no.6所示的核酸序列，所述目的基因表达片段的 5’端具有bamhi 酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的 3’端具有sall 酶切位点黏性末端。
[0022]
优选地，步骤s1中所述表达载体为pet-28a载体。
[0023]
优选地，步骤s2中所述表达菌为大肠杆菌。
[0024]
该制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。
[0025]
优选地，所述重组酶依赖型扩增技术（rda）的反应体系包括如下试剂：重组酶kx、ky蛋白、gp32蛋白、链置换dna 聚合酶、核酸外切酶、肌酸激酶、磷酸肌酸、tris-缓冲液、醋酸钾或醋酸钠、peg20000或peg35000、dtt、dntps、datp、探针、引物对、醋酸镁。优选地，上述反应体系还包括检测模板，如待检样本dna或rna。
[0026]
优选地，所述反应体系的反应条件为25-42℃下反应10-60min。
[0027]
更优选地，所述反应体系的反应条件为39℃反应30min。
[0028]
所述重组酶依赖型扩增技术（rda）反应体系的反应原理为：（1）反应体系中重组酶与18-30bp 的特异性引物结合形成的重组酶-引物复合体，在双链 dna 模板中寻找靶位点；（2）重组酶-引物复合体识别模板特异性序列后，发生定位并引发链交换，单链结合蛋白随即结合被置换的 dna 链形成的d-loop结构；（3）重组酶-引物复合体水解体系中的 datp 构象改变，重组酶解离后引物 3’端暴露并被 dna 聚合酶识别，dna 聚合酶按照模板序列在引物3'端启动dna 合成；（4）dna 聚合酶具有链置换功能，在引物延伸的同时继续解开模板的双螺旋 dna 结构，dna合成过程继续进行；（5）两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子；（6）在反应体系中datp水解为重组酶供能后变成dadp，磷酸肌酸能在肌酸激酶的催化下将其磷酸基转移到dadp分子中形成datp，从而恢复反应体系中datp的水平。上述过程不断重复，最终实现核酸的高效扩增。
[0029]
基于上述反应体系构建一种基于重组酶依赖型扩增技术（rda）检测解脲支原体
（uu）的试剂盒，包括核酸提取试剂，rda恒温扩增反应模块，阳性对照和阴性对照，所述探针及所述引物。
[0030]
优选的，所述rda恒温扩增反应模块为rda恒温扩增反应混合试剂的冻干粉。
[0031]
优选的，所述rda恒温扩增反应模块包含重组酶kx 60-600 ng/μl、ky蛋白16-192 ng/μl、单链结合蛋白gp32 100-1000 ng/μl、链置换dna聚合酶3-100 ng/μl、核酸外切酶30~200u、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mm、tris缓冲液20-100mm、peg2.5%-10%、醋酸钾或醋酸钠0-150 mm、datp 1-5 mm、dntps 150-600 nm each、dtt 1-12 mm、探针150nm-600nm、引物对150-600nm。
[0032]
优选地，tris-缓冲液为tris-tricine。
[0033]
优选地，tris
-ꢀ
tricine的浓度为100mm。
[0034]
所述核酸提取试剂包括buffer a、buffer b。buffer a为样本裂解液，含有tris-hcl缓冲体系、naoh、sds、edta、异硫氰酸胍、tween80、曲拉通；buffer b含有tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；阳性对照为含有解脲支原体（uu）的靶标基因质粒，阴性对照为空载体puc57质粒。
[0035]
本发明再一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术的检测解脲支原体的检测方法。
[0036]
所述检测方法包括以下步骤：提取待测样品的核酸，以待测样品的核酸为模板，在解脲支原体的引物对、探针及rda冻干粉试剂、buffer a和buffer b存在下进行实时荧光rda反应，根据实时荧光rda扩增曲线分析待测样品；其中所述探针的核苷酸序列如seq id no .1或seq id no .2所示; 其中反应温度为25-42℃，反应时间大于10分钟。
[0037]
优选的，包含以下步骤：1）样本处理将20μl buffer a和5μl 阳性对照/阴性对照/待检样本（拭子液/组织研磨液/抗凝全血）震荡混匀，室温静置10-15min；2）体系配制及检测加入25μl buffer b，震荡混匀后将50μl混合液加入rda荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号，30min完成检测；3）结果判定按反应体系产生的荧光值达到阈值的时间即阈值时间(time threshold，tt)为进行结果判读。
[0038]
①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值<25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或tt值≥25min，为有效结果；
③
被检样本：a.若tt值 < 25min，判断为阳性；b.若tt值≥30min，判断为阴性；c.若25min≤tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤tt值<30min，应参照阴性对照tt值，若阴性对照tt值≥30min，则判断为阳性。
[0039]
本发明具有以下有益效果：
manual )，以及《动物细胞培养》( animal cell cμlture )(r .i .弗雷谢尼(r .i .freshney )编辑(1987 ))。
[0056]
实施例1 一种解脲支原体（uu）rda荧光法检测试剂盒检测方法的建立（1）重组酶kx和ky蛋白的获取已报道的重组酶uvsx稳定性差，难以量产和长期保存，为了解决这一问题，本研发团队利用生物信息学方法，通过对大批量的蛋白结构进行分析模拟，最终找到了一种新的重组酶kx及其辅助蛋白ky。
[0057]
在本实施例中，研发团队通过提取重组酶结构中的关键功能位点信息，如dna结合位点、atp水解位点等，映射到蛋白质三维空间结构，获取二级结构信息和三级结构信息，通过综合一级结构序列的功能残基、二级结构特征和三级结构空间距离，构建了一个用于重组酶蛋白结构筛选的数据模型。通过从swissprot、pdb数据查找在一级结构与重组酶蛋白匹配的模板，初步筛选出312个蛋白序列，然后分别进行二级结构和三级结构比对，计算相似性分值，根据相似性评分排名，模拟筛选出了15个疑似有重组酶活性的蛋白。
[0058]
将这15个蛋白分别构建重组蛋白表达载体，分别表达纯化后，检测其水解atp的能力，其中有4个蛋白有atp水解活性，分别为kx、x-1、x-2、x-3蛋白。实验中使用萤火虫荧光素酶 atp 生物发光检测试剂盒，严格按照说明书的操作进行实验，结果如图1所示。
[0059]
将有atp水解活性4个蛋白配制成恒温扩增体系进行扩增反应，结果如图2所示，n为阴性对照，p为加入t4uvsx扩增的阳性对照，1~4分别加入的蛋白为kx、x-1、x-2、x-3，其中只有kx蛋白有扩增活性。kx蛋白源自escherichia phage pht4a噬菌体，其三维结构图如图3所示。
[0060]
以同样的方法，我们筛选出了重组酶kx源自escherichia phage pht4a噬菌体的辅助蛋白ky，其三维结构图如图4所示。其中辅助蛋白ky需以七聚体的形式发挥活性作用。
[0061]
最终获得用于rda扩增的重组酶kx，其核苷酸序列如seq id no.6所示，氨基酸序列如seq id no.7所示；重组酶ky，其核苷酸序列如seq id no.8所示，氨基酸序列如seq id no.9所示。
[0062]
（2）解脲支原体检测引物及探针设计与筛选通过ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov)查找解脲支原体全基因序列，使用clone manager软件和blast进行同源性比对和序列分析，从中选择在本病原的种内保守，种间变异的序列做为靶标区域。经过对多种解脲支原体的全基因组序列比对和同源性分析后，最终选择了高度保守序列作为靶标基因(参考序列genbank登录号：cp041199.1)，以此目的片段进行rda检测引物和探针设计。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成靶标基因dna质粒，引物和探针序列。筛选出解脲支原体基因组保守序列如下：seq id no .5：aagataaaataattgataaacgggatttgaatttattagattcacatccagattttacgtacgataatgatggaaatttagaaattcacactcaattagcaaatgatttaaatgatgatttaagacaaaaagctttaaataatgcaaatgtcaaaggaattgttgttgaccaaaatggtgtagaacatgagatagatgtaagtattgatgctaatggcaaggttattattccaacaaaaaatttagcaaataatgacccaactaaatctaatatatacacacttaaaaaagtcgttttaaaacaaaataatcaaccaaacattg本实施例中采用rda技术引物设计原则进行设计，上游引物和下游引物长度18-30bp，
根据解脲支原体基因组的保守序列，设计上游引物和下游引物各3条，引物序列如下：上游引物uu-f1：5
’-
gataatgatg gaaatttagaaattcacac
ꢀ-3’
上游引物uu-f2：5
’-
cactmaattagcaaatgatttaaatga
ꢀ-3’
上游引物uu-f3：5
’-
atgatttaaracaaaaagctttaaata
ꢀ-3’
下游引物uu-r1：5
’-ꢀ
ggaataataaccttgccattagcatcaa-3’下游引物uu-r2： 5
’-ꢀ
catcaatacttacatctatctcatg-3’下游引物uu-r3：5
’-ꢀ
gtatatattagatttagttgggtca-3’3对引物两两配对形成9个组合进行最佳引物组合筛选。
[0063]
组合1：uu-f1和uu-r1；组合2：uu-f1和uu-r2 组合3：uu-f1和uu-r3组合4：uu-f2和uu-r1；组合5：uu-f2和uu-r2 组合6：uu-f2和uu-r3组合7：uu-f3和uu-r1；组合8：uu-f3和uu-r2 组合9：uu-f3和uu-r3通过一系列的实验筛选和评价，确定组合1（uu-f1和uu-r1）为最佳引物组，具体为：uu-f1（seq id no .3）： 5
’-ꢀ
gataatgatg gaaatttagaaattcacac
ꢀ-3’
；uu-r1（seq id no .4）： 5
’-ꢀ
ggaataataa ccttgccattagcatcaa
ꢀ-3’
。
[0064]
在rda荧光检测技术中，我们采用两种方案设计rda荧光标记探针，第一种方案如下：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（thf）替代，本实施例中所述核苷酸序列为seq id no .1的探针，其5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（thf）替代，其具体信息如下：uu-p1（seq id no .1）：5
’-
fam-tgacc[thf]aaatggtgtagaacatgagataga-bhq1
ꢀ-
3'第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 thf 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。本实施例中所述核苷酸序列为seq id no .2的探针，其5’端第30位碱基t标记fam或者其他发光基团，第33位碱基用四氢呋喃残基（thf）替代，第35位碱基标记bhq1或者其他淬灭基团，3’端进行c3-spacer阻断修饰（seq id no .2）：uu-p2（seq id no .2）：5
’-
aatgtcaaaggaattgttgttgaccaaaa[fam-dt]gg[thf]g[bhq1-dt]agaacatgagataga[c3-spacer]
ꢀ-3’
通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于rda荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异，其中第一种探针设计时所需靶标保守序列较短，对核酸序列要求低，本专利后续的实施例，以第一种探针uu-p1（seq id no .1）为检测探针，配制rda恒温扩增反应体系。
[0065]
（3）一种解脲支原体（uu）rda检测方法的建立本专利构建一种基于重组酶依赖型扩增技术（rda）检测解脲支原体（uu）的试剂盒，包括核酸提取试剂，rda恒温扩增反应模块，阳性对照和阴性对照，其中核酸提取试剂包括buffer a和buffer b， buffer a为样本裂解液，含有tris-hcl缓冲体系、naoh、sds、edta、异硫氰酸胍、tween80、曲拉通，buffer b含有tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；rda恒温扩增反应模块中反应体系最优配比如表1所示，包含了本实施例所述的荧光标记探针及所述的引物；阳性对照为含有解脲支原体（uu）的靶标基因质粒，阴性对照为空载体puc57质粒。
[0066]
表1 rda恒温扩增反应模块反应体系配比序号组分含量浓度1tris-tricine（ph7.9）100mm2醋酸钾50mm3peg20000或peg350005%4二硫苏糖醇(dtt)2mm5dntps200nmeach6datp2mm7肌酸激酶（creatinekinase）0.2mg/ml8磷酸肌酸（creatinephosphate）50mm9链置换dna聚合酶50ng/ul10gp32蛋白300ng/ul11重组酶kx120ng/ul12辅助蛋白ky60ng/ul13核酸外切酶50u14上游引物500nm15下游引物500nm16荧光标记探针300nm17醋酸镁14mm所述反应体系的反应条件为：25-42℃下反应10-60min。
[0067]
最佳反应条件为：37℃反应30min。
[0068]
本实施例中对收集的5例经荧光定量pcr验证均为解脲支原体dna阳性的生殖泌尿道分泌物样本，使用本专利的rda荧光法检测试剂盒测试。
[0069]
具体操作如下：步骤一、样本处理。将20μl buffer a和5μl 阳性对照/阴性对照/待检分泌物样本震荡混匀，室温静置10-15min；步骤二、体系配制及检测。加入25μl buffer b，震荡混匀后将50μl混合液加入rda荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号，30min可完成检测；步骤三、结果判定。
[0070]
①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值<25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或tt值≥25min，为有效结果；
③
被检样本：a.若tt值 < 25min，判断为阳性；b.若tt值≥30min，判断为阴性；c.若25min≤tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤tt值<30min，应参照阴性对照tt值，若阴性对照tt值≥30min，则判断为阳性。
[0071]
检测结果如表2和图5所示，阳性对照、阴性对照符合
“①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值<25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或tt值≥25min，为有效
结果”的内容，各样本的tt值均小于25min，判断为阳性。
[0072]
结果表明，本实施例建立的rda荧光法检测试剂盒的检测方法能够对人生殖泌尿道分泌物中的解脲脲原体dna进行检测。表2 试剂盒检测方法的建立 阴性对照阳性对照样本1样本2样本3样本4样本5tt值-04:1709:5313:5805:3007:5507:52实施例2 rda荧光法检测试剂灵敏度测试阳性对照为含有解脲支原体（uu）的fjm04基因的puc57-fjm04质粒，阴性对照为空载体puc57质粒。
[0073]
具体操作如下：步骤一、将阳性对照质粒稀释到10^3c，再10倍梯度稀释分别稀释成10^2c、10^1c、10^0c。
[0074]
步骤二、样本处理。将步骤一各浓度的质粒各取5μl在ep管中，同时取阴性对照5μl在另一ep管中，分别加入20μl buffer a，震荡混匀，室温静置10-15min；步骤三、体系配制及检测。各管加入25μl buffer b，震荡混匀后将50μl混合液加入rda荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号；步骤四、结果判定。判定标准：
①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值< 25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或者tt值≥ 25min，为有效结果；
③
被检样本：a.若tt值< 25min，判断为阳性；b.若tt值≥30min，判断为阴性；c.若25min≤tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤tt值<30min，应参照阴性对照tt值，若阴性对照tt值≥30min，则判断为阳性。
[0075]
结果如表3和图6所示。阴性对照tt值为na，符合判定标准中“无扩增曲线出现，或tt值 ≥ 25min”的内容。10^3c、10^2c、10^1c、10^0c的tt值均 < 25min，根据结果判定标准，10^3c、10^2c、10^1c、10^0c结果均为阳性。
[0076]
即，rda荧光法检测试剂盒的灵敏度达到单个拷贝。
[0077]
表3 灵敏度测试结果 阴性对照10^310^210^110^0tt值-05:1606:0708:1111:24实施例3 rda荧光法检测试剂特异性测试将临床上收集3例解脲支原体（ureaplasma urealyticum, uu）、1例淋球菌（neisseria gonorrhoeae，ng）、1例沙眼衣原体（chlamydia trachomatis, ct）、1例人乳头瘤病毒18（human papilloma virus，hpv18）4种共6例经荧光定量pcr验证为对应病原体阳性的样本进行检测，检验试剂盒的特异性。
[0078]
具体操作如下：步骤一、样本处理。将以上6例阳性样本各取5μl在ep管中，同时取试剂盒的阳性对照、
阴性对照各5μl在新的ep管中，分别加入20μl buffer a，震荡混匀，室温静置10-15min；步骤三、体系配制及检测。各管加入25μl buffer b，震荡混匀后将50 μl混合液加入rda荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39 ℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号；步骤四、结果判定。判定标准：
①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值< 25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或者tt值 ≥ 25min，为有效结果；
③
被检样本：a.若tt值< 25min，判断为阳性；b.若tt值≥30min，判断为阴性；c.若25min≤tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤tt值<30min，应参照阴性对照tt值，若阴性对照tt值≥30min，则判断为阳性。
[0079]
结果如表4和图7所示。阳性对照、阴性对照符合
“①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值<25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或tt值≥25mn，为有效结果”的内容。uu样本的tt值均小于25min，判断为阳性；ng、ct、hpv18无扩增曲线，判定为阴性。
[0080]
即，仅当靶标病原体为解脲支原体时，rda荧光法检测为阳性，对其他病原体检测为阴性。
[0081]
表4 特异性测试结果样本名称tt值样本名称tt值阴性对照-uu-304:58阳性对照04:39ng-uu-105:06ct-uu-205:52hpv18-实施例4 rda荧光法检测试剂盒稳定性测试液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。本试剂盒将rda荧光法反应模块在真空干燥成粉状试剂，冻干后的粉状试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易。本实施例对rda 荧光检测试剂盒的稳定性进行验证。
[0082]
具体操作如下：将含有冻干试剂的八连管密封于含有干燥剂的铝箔袋中，保存于37℃恒温箱。分别于0天、30天、90天、180天取2个反应试剂测试。
[0083]
步骤一、样本处理。试剂盒的阳性对照/阴性对照各取5μl在ep管中，分别加入20μl buffer a，震荡混匀，室温静置10-15min；步骤二、体系配制及检测。各管加入25μl buffer b，震荡混匀后将50 μl混合液加入rda荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39 ℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号；步骤三、结果判定。判定标准：
①
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，tt值< 25min，为有效结果；
②
阴性对照：无扩增曲线出现，或者tt值≥ 25min，为有效结果；
③
被检样本：
a.若tt值< 25min，判断为阳性；b.若tt值≥30min，判断为阴性；c.若25min≤tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤tt值<30min，应参照阴性对照tt值，若阴性对照tt值≥30min，则判断为阳性。
[0084]
结果如表5和图8、图9、图10、图11所示。分别对保存了0天、30天、90天、180天的rda荧光法反应模块试剂冻干粉进行测试，各个tt值均小于25min，根据结果判定标准，本专利的试剂盒中试剂冻干后，在0天、30天、90天、180天的检测结果均为阳性。表明本专利的试剂盒中试剂冻干后，在37℃中能稳定保存至少3个月。
[0085]
表5 37℃保存稳定性 0天30天90天180天阴性对照
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阳性对照04:4105:0205:2306:32