三株新分离到的快速生长弧菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及三株新分离到的快速生长弧菌及其应用。
背景技术：
：弧菌(vibrio)是一类杆状、可通过极生鞭毛运动、可进行兼性厌氧代谢的革兰氏阴性菌。目前弧菌科共包含8个有效属，分别是弧菌属、肠弧菌属、盐弧菌属、另类弧菌属、链状球菌属、格利蒙氏菌属以及海胆单胞菌属。弧菌广泛分布于河口、海湾等海域的海水中且数量丰富，其中，可能致使人类和多种水产动物感染引起疾病的种类超过十种，例如霍乱弧菌、创伤弧菌以及副溶血性弧菌。因弧菌生长速率快、酸碱度生长范围广、可在各种盐度的海水中生长，所以可直接利用海水进行发酵。同时，弧菌具有丰富的生理生化机能，从生产活力和发酵特点等各方面都具备工业化开发的潜力，可以作为一种优良的底盘细胞进行进一步的改造以及工业应用。目前，对于弧菌的培养与操作方法以及弧菌的生产工艺技术的研究逐步成熟，为其工业化生产中各种最佳参数的设置提供了理论依据。作为一种典型的快速生长细菌，弧菌倍增时间低于10分钟，生长比大肠杆菌要快很多，未来很有可能成为大肠杆菌的替代菌。快速生长赋予了弧菌快速的的蛋白质合成、dna复制和生物量的产生等特性，在发酵过程中可以有效地缩短发酵时间，提高产率。自1958年被发现以来研究人员对需钠弧菌vibrionatriegensatcc14048进行了非常多的研究，包括各种操作方法的建立和优化。但是大部分对于弧菌的研究都针对需钠弧菌vibrionatriegensatcc14048这株菌，而且对于弧菌的工业应用潜力研究很少。此外，大部分的研究都用了丰富培养基比如说lb，不能够在大规模的发酵中进行应用。因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的更加快速生长的细菌，并且能够具有优秀的生物技术主要底盘生物的工业应用潜力、成为工业
技术领域：
的新宿主。技术实现要素：有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种新的能够快速生长的弧菌，并能够适应多种培养环境，具有应用于生物技术主要底盘生物的工业应用潜力、成为工业
技术领域：
的新宿主。为实现上述目的，本发明提供了三株新分离到的快速生长弧菌，三株弧菌分别命名为vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3，于2019年08月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号依次为cctccno：m2019603、cctccno：m2019604、cctccno：m2019605。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的全基因组序列大小分别为5,097,912bp，5,246,686bp和5,108,924bp。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的所述全基因组序列均具有两条环状染色体，即染色体1和染色体2，其中，所述弧菌vibriosp.fa1的所述染色体1的大小为3.3mb，所述弧菌vibriosp.fa1的所述染色体2的大小为1.78mb；所述弧菌vibriosp.fa2的所述染色体1的大小为3.41mb，所述弧菌vibriosp.fa2的所述染色体2的大小为1.83mb；所述弧菌vibriosp.fa3的所述染色体1的大小为3.25mb，所述弧菌vibriosp.fa3的所述染色体2的大小为1.85mb。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的gc含量分别为44.7％，44.6％，44.9％。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的rna数量分别为166、161和166；所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的编码序列数量分别为4,737、4,799、4,671。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3可应用化学合成培养基进行培养，适宜培养温度范围包括30℃～42℃。进一步地，所述化学合成培养基的组分包括碳源、氮源、无机盐、金属离子成分、ph中和剂，其中，所述碳源包括甘油、蔗糖、几丁质、葡萄糖；所述氮源包括硫酸铵、氯化铵；所述无机盐包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙；所述金属离子成分包括氯化锌、氯化铁、氯化锰、氯化铜、氯化钴、硼酸、钼酸钠、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、氯化镍；所述ph中和剂包括碳酸钙；所述化学合成培养基的组分还包括氯化钠。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1可利用碳源包括甘油、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、乙酰氨基葡萄糖、柠檬酸、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、龙胆二糖、葡萄糖酸钾17种碳源；所述弧菌vibriosp.fa2可利用碳源包括甘油、核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、乙酰氨基葡萄糖、柠檬酸、水杨苷、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、龙胆二糖、d-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸钾19种碳源；所述弧菌vibriosp.fa3可利用碳源包括甘油、核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、乙酰氨基葡萄糖、柠檬酸、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、葡萄糖酸钾15种碳源。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的代谢途径包括丁醇，乳酸，丁酸酯，丙酮和丁二醇。进一步地，所述弧菌vibriosp.fa2和所述弧菌vibriosp.fa3可通过电转化进行质粒转化，其中所述质粒包括peb03和pacycduet-1；所述弧菌vibriosp.fa2和所述弧菌vibriosp.fa3还可以进行接合转移和利用同源重组进行基因敲除。与现有技术相比，本发明至少具有以下有益技术效果：(1)本发明提供的三种弧菌vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3为新分离得到的，相较于广泛研究的vibrionatriegensatcc14048具有更多的dna复制相关基因、氨基酸合成相关基因及抗逆性相关基因，能够更加快速生长；(2)本发明提供的三种弧菌能够适应于化学合成培养基，且可用碳源包括甘油、蔗糖、几丁质等多种碳源，培养温度可在30～42℃间，为弧菌培养条件的优化、尤其是工业生产的应用提供了重要的基础和依据；(3)本发明提供的弧菌vibriosp.fa2和vibriosp.fa3还可进行电转化转化质粒，并实现基因的敲除，为其作为新的工业
技术领域：
的宿主的应用提供了重要的基础。以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。附图说明图1是本发明的一个较佳实施例的菌株vibriosp.fa1、vibriosp.fa2、vibriosp.fa3和vibrionatriegensatcc14048以及其他常见菌株的16srrna系统进化树分析示意图；图2是本发明的一个较佳实施例的菌株vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3和vibrionatriegensatcc14048在mko培养基里摇瓶培养的生长和耗糖情况，其中，a为生长曲线，b为耗糖情况曲线；图3是本发明的一个较佳实施例的菌株vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3和vibrionatriegensatcc14048在vn培养基里摇瓶培养的生长和耗糖情况，其中，a为生长曲线，b为耗糖情况曲线。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中使用的三株弧菌的命名分别为vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3，于2019年08月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号依次为cctccno：m2019603、cctccno：m2019604、cctccno：m2019605。实施例一、vibriosp.fa1、vibriosp.fa2、vibriosp.fa3生长温度的测试其步骤为：步骤一：将vibriosp.fa1、vibriosp.fa2、vibriosp.fa3三株菌的甘油管从-80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜活化培养；步骤二：活化好的三株菌的菌液各以1％的接种量分别接种到事先灭好菌的新的5mllb3培养基中。30℃、37℃和42℃三个温度条件下，200rpm分别进行培养。5小时后，观察此时摇管中菌的浑浊程度，测定此时培养物的od600值，发现在三个温度条件下三株菌都可以进行正常生长。实施例二、对vibriosp.fa1菌株分别用mko和vn两种化学合成培养基进行生长测试其步骤为：步骤一、将vibriosp.fa1的甘油管从-80℃冰箱中取出以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜活化培养；步骤二、将活化的菌以1％的接种量分别转接到灭菌的100mlmko和vn培养基中，37℃，200rpm培养；步骤三、每隔两个小时用分光光度计测量od600的值，用sba-40d生物传感分析仪(购自山东科学院，济南，中国)测量培养基中剩余葡萄糖的量来记录菌的生长和耗糖情况。本实施例采用的所述mko和vn培养基的配方如下：mko培养基：20gglucose，15gnacl，10gk2hpo4，2gkh2po4，3.3g(nh4)2so4，0.1gmgso4·7h2o，5gcaco3，3.2mgcacl2·2h2o，3.8mgzncl2，0.03gfecl3·6h2o，11.1mgmncl2·4h2o，0.96mgcucl2·2h2o，2.6mgcocl2·6h2o，0.35mgh3bo3，0.024mgna2moo4·2h2o。vn培养基：5g(nh4)2so4，15gnacl，5gcaco3，1gkh2po4，1gk2hpo4，0.25gmgso4，0.01gcacl2，16.4mgfeso4·7h2o，10mgmnso4·h2o，0.3mgcuso4·5h2o，1mgznso4·7h2o，5gcaco3，0.02mgnicl2·6h2o。摇瓶培养24小时后，菌株fa1在mko培养基中的最终od600约为3.42，培养基中剩余葡萄糖浓度为0.53g/l。摇瓶培养12小时后，菌株fa1在vn培养基中的最终od600约为5.72，培养基中剩余葡萄糖浓度为0.7g/l。实施例三、对vibriosp.fa2菌株分别用mko和vn两种化学合成培养基进行生长测试其步骤为：步骤一、将vibriosp.fa2的甘油管从-80℃冰箱中取出以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜培养；步骤二、活化的菌以1％的接种量分别转接到灭菌的100mlmko和vn培养基中，37℃，200rpm培养；步骤三、每隔两个小时用分光光度计测量od600的值，用sba-40d生物传感分析仪(购自山东科学院，济南，中国)测量培养基中剩余葡萄糖的量来记录菌的生长和耗糖情况。本实施例采用的所述mko和vn培养基的配方如下：mko培养基：20gglucose，15gnacl，10gk2hpo4，2gkh2po4，3.3g(nh4)2so4，0.1gmgso4·7h2o，5gcaco3，3.2mgcacl2·2h2o，3.8mgzncl2，0.03gfecl3·6h2o，11.1mgmncl2·4h2o，0.96mgcucl2·2h2o，2.6mgcocl2·6h2o，0.35mgh3bo3，0.024mgna2moo4·2h2o。vn培养基：5g(nh4)2so4，15gnacl，5gcaco3，1gkh2po4，1gk2hpo4，0.25gmgso4，0.01gcacl2，16.4mgfeso4·7h2o，10mgmnso4·h2o，0.3mgcuso4·5h2o，1mgznso4·7h2o，5gcaco3，0.02mgnicl2·6h2o。摇瓶培养24小时后，菌株fa2在mko培养基的最终od600约为5.04，培养基中剩余葡萄糖浓度为0.5g/l。摇瓶培养12小时后，菌株fa2在vn培养基中的最终od600约为5.5，培养基中剩余葡萄糖浓度为0.9g/l。实施例四、对vibriosp.fa3菌株分别用mko和vn两种化学合成培养基进行生长测试其步骤为：步骤一、将vibriosp.fa3的甘油管从-80℃冰箱取出以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜培养；步骤二、将活化的菌以1％的接种量分别转接到灭菌的100mlmko和vn培养基中，37℃，200rpm培养；步骤三、每隔两个小时用分光光度计测量od600的值，用sba-40d生物传感分析仪(购自山东科学院，济南，中国)测量培养基中剩余葡萄糖的量来记录菌的生长和耗糖情况。本实施例采用的所述mko和vn培养基的配方如下：mko培养基：20gglucose，15gnacl，10gk2hpo4，2gkh2po4，3.3g(nh4)2so4，0.1gmgso4·7h2o，5gcaco3，3.2mgcacl2·2h2o，3.8mgzncl2，0.03gfecl3·6h2o，11.1mgmncl2·4h2o，0.96mgcucl2·2h2o，2.6mgcocl2·6h2o，0.35mgh3bo3，0.024mgna2moo4·2h2o。vn培养基：5g(nh4)2so4，15gnacl，5gcaco3，1gkh2po4，1gk2hpo4，0.25gmgso4，0.01gcacl2，16.4mgfeso4·7h2o，10mgmnso4·h2o，0.3mgcuso4·5h2o，1mgznso4·7h2o，5gcaco3，0.02mgnicl2·6h2o。摇瓶培养24小时后，菌株fa3在mko培养基中的最终od600约为3.53，培养基中剩余葡萄糖浓度为2.53g/l。摇瓶培养12小时后，菌株fa3在vn培养基中的最终od600约为3.67，培养基中剩余葡萄糖浓度为0.97g/l。实施例五、对vibrionatriegensatcc14048菌株分别用mko和vn两种化学合成培养基进行生长测试其步骤为：步骤一、将vibrionatriegensatcc14048的甘油管从-80℃冰箱取出以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜活化培养；步骤二、将活化的菌以1％的接种量分别转接到灭菌的100mlmko和vn培养基中，37℃，200rpm培养；步骤三、每隔两个小时用分光光度计测量od600的值，用sba-40d生物传感分析仪(购自山东科学院，济南，中国)测量培养基中剩余葡萄糖的量来记录菌的生长和耗糖情况。本实施例采用的所述mko和vn培养基的配方如下：mko培养基：20gglucose，15gnacl，10gk2hpo4，2gkh2po4，3.3g(nh4)2so4，0.1gmgso4·7h2o，5gcaco3，3.2mgcacl2·2h2o，3.8mgzncl2，0.03gfecl3·6h2o，11.1mgmncl2·4h2o，0.96mgcucl2·2h2o，2.6mgcocl2·6h2o，0.35mgh3bo3，0.024mgna2moo4·2h2o。vn培养基：5g(nh4)2so4，15gnacl，5gcaco3，1gkh2po4，1gk2hpo4，0.25gmgso4，0.01gcacl2，16.4mgfeso4·7h2o，10mgmnso4·h2o，0.3mgcuso4·5h2o，1mgznso4·7h2o，5gcaco3，0.02mgnicl2·6h2o。摇瓶培养24小时后，菌株vibrionatriegensatcc14048在mko培养基中的最终od600约为3.38，培养基中剩余葡萄糖浓度为10.2g/l；摇瓶培养12小时后，菌株vibrionatriegensatcc14048在vn培养基中的最终od600约为4.32，培养基中剩余葡萄糖浓度为7.6g/l四种菌株在两种化学合成培养基mko培养基和vn培养基中检测得到的生长曲线、耗糖情况分别如图2(其中a为生长曲线，b为耗糖情况曲线)及图3(其中a为生长曲线，b为耗糖情况曲线)所示。在mko培养基中，vibriosp.fa1、vibriosp.fa2的最大生物量约为vibrionatriegensatcc14048的两倍左右。对vibriosp.fa1、vibriosp.fa2、vibriosp.fa3和vibrionatriegensatcc14048在mko和vn培养基不同生长阶段的in(od600)和时间做线性拟合。vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3和vibrionatriegensatcc14048在0～12小时的生长速率分别为0.87/时、0.86/时、0.83/时、0.77/时；0～8小时的生长速率分别为0.93/时、0.91/时、0.90/时、0.88/时；2～12小时的生长速率分别为0.86/时、0.85/时、0.77/时、0.68/时；2～8小时的生长速率分别为0.90/时、0.85/时，0.84/时，和0.83/时。在vn培养基中，vibriosp.fa1、vibriosp.fa2的最大生物量约为vibrionatriegensatcc14048的1.3倍。vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3以及vibrionatriegensatcc14048在0～12小时阶段的生长速率分别为0.86/时、0.84/时、0.82/时和0.8/时；0-8小时的生长速率分别为0.94/时、0.91/时、0.91/时和0.88/时；2～12小时的生长速率分别为0.84/时、0.84/时、0.84/时和0.77/时；2～8小时的生长速率分别为0.93/时、0.93/时，0.94/时和0.87/时。因此总的来讲，fa菌株和vibrionatriegensatcc14048相比具有一定的生长优势，具有发展成为下一代工业宿主的可能性。实施例六、vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3三株菌基因组dna的提取其步骤为：步骤一、将vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3的甘油管从-80℃冰箱中取出各以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜活化培养；步骤二、将活化培养的vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3各取1ml菌液12000rpm，2min离心；步骤三、按照promega基因组提取试剂盒的说明书对三管菌液进行基因组提取；步骤四、用nanodrop对提取好的vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3基因组进行浓度的测定。提取的vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3三管基因组dna的浓度分别为268ng/μl、350ng/μl、292ng/μl。实施例七、对vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3进行基因组测序其步骤为：步骤一、对vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3提取好的基因组用pacbiorsii测序平台进行全基因组测序。测序过程包括样品质检、文库构建和上机测序。使用sequelbindingkit2.0、sequelsequencingkit2.1与sequelsmrtcell1mv2进行测序，使用smrtlink5.0软件进行数据处理；步骤二、通过hpga等软件进行基因组序列的组装；步骤三、用rast网站和prokka软件对测序获得的三个基因组以及从ncbi网站获取的vibrionatriegensatcc14048基因组分别进行注释。vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3三株菌基因组均具有两条环状染色体。vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3以及vibrionatriegensatcc1404基因组的基因特征如表1所示。表1四种菌株的基因组基本特征特征fa1fa2fa3atcc14048大小5，097，9125，246，6865，108，9245，175，153gc含量44.744.644.945.1rnas数目166161166163contigs数目2222编码序列数目4737479946714640trna129127129129rrna37343734亚系统数目399405406417实施例八、对vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3以及vibrionatriegensatcc14048进行基因组比较分析步骤一、对上述的三株菌和弧菌vibrionatriegensatcc14048与其他几株常见的弧菌以及常见的工业宿主菌株共计34株菌的16srrna序列用mega7.0软件用进行系统进化树分析，结果如图1所示。vibriosp.fa2和vibriosp.fa3两株菌的进化距离比较近，vibriosp.fa1和vibrionatriegensatcc14048两株菌的进化距离比较近。这个结果和前面生长测试呈现的结果不一致；步骤二、在步骤一的基础上，对上述的三株菌和弧菌vibrionatriegensatcc14048的全基因组用mauve软件做共线性比较，结果显示四株菌之间的基因排列比较混乱，存在大量的基因倒位和重排。相对来讲vibriosp.fa1、vibriosp.fa2之间的共线性比较好；步骤三、对上述的三株菌和弧菌vibrionatriegensatcc14048的直系同源分析。包括cog分析和基因级的比较。具体地，将上述三株菌和弧菌vibrionatriegensatcc14048的全基因组进行cog注释，获得25个类别功能的基因，四株弧菌不同类别基因的数目差异如表2所示。我们从表中注释的结果发现vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3这三株菌中关于细胞基本生命过程的基因如dna复制、细胞壁合成、翻译等类别的基因数目会比vibrionatriegensatcc14048要多。为了更进一步地验证这部分结论的正确性，我们也针对cog注释的基因进行了功能富集。结果如表3所示。这部分的数据也显示了和cog分类基因数目分析相一致的结果；表2vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3以及vibrionatriegensatcc14048cog分类表3vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3以及vibrionatriegensatcc14048cog功能富集步骤四、对菌株fa1、fa2、fa3和atcc14048全基因组注释到的总基因数进行分析。发现fa菌株的总基因数比atcc14048总基因数目多出两百多个基因。对这部分多出来的基因进行分析。在差异基因中发现fa2中和dna复制相关的基因拷贝数比较多。比如fa2中有5个polc(dna聚合酶iii)，xerc(酪氨酸重组酶)和recf(dna复制和修复蛋白)，但这些基因在vibrionatriegensatcc14048中的拷贝数相对较少。在差异基因中发现了与氨基酸合成有关的基因。比如asd仅仅存在于vibriosp.fa1和vibriosp.fa2中，已经被报道该基因与赖氨酸，甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，l-丙氨酸和天冬氨酸的生物合成有关。在差异基因中发现了与菌体抗逆性有关的基因。比如基因簇cadabc，仅存在于vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3中。它被报道在酸性环境下可以提高ph从而促进菌体生长。考虑到快速生长的细菌在生长过程中会产生较多的酸，这个基因簇可能一定程度上促进弧菌的快速生长。因此，我们推测这些多出来的基因可能和fa菌株的快速生长有关。实施例九、对所述的三株弧菌的工业化应用潜力的评估包括以下步骤：步骤一、对所述的三株菌基因组进行分析发现它们基因组均含有甘油、蔗糖、几丁质等多种碳源的利用途径，梅里埃api50ch试纸条和50chb培养基证明了这三株菌确实有利用甘油、蔗糖、几丁质等多种碳源的能力。梅里埃api50ch试纸条和50chb培养基的使用方法参照说明书。vibriosp.fa1、vibriosp.fa2和vibriosp.fa3以及vibrionatriegensatcc14048能利用的碳源如表4所示；步骤二、对所述的三株菌的基因组进行分析。发现其基因组内均含有丁醇，乳酸，丁酸酯，丙酮和丁二醇等的代谢途径，便于进行代谢工程改造，生产其他多种化合物；步骤三、对所述的三株菌进行电转化，具体步骤如下：将所述的三株菌从-80℃冰箱的甘油管中各以1％的接种量接种到5mllb3培养基(3％氯化钠，1％蛋白胨，0.5％酵母粉)中，37℃，200rpm过夜培养。第二天将前一天活化的菌再分别转接到新的5mllb3培养基。待od600至0.6-0.8时分别将培养物倒入三个灭菌过的15ml离心管中，4500rpm，4℃，10min离心。倾倒所有的上清液，各加入10ml电转缓冲液并用移液枪吸打混匀，4500rpm，4℃，10min离心。重复洗三遍，最后用200μl电泳缓冲液重悬。将1μg质粒加入到做好的电转化感受态细胞中轻轻吸打混匀并将所有的细胞加入到提前预冷好的2mm电转杯中，用biorid电转仪以1400v，25μf，200ω，2mm的参数进行电穿孔。穿孔完毕迅速加入到1ml的lb3培养基中37℃孵育2小时，涂布到具有适当抗生素的lb3平板上。发现fa2和fa3均可以通过电转化将质粒peb03和pacycduet-1成功转化，转化的效率如表5所示；步骤四、基于同源重组的原理对菌株fa2进行基因敲除。目前fa2中已经实现了nagb和nagk两个基因的敲除。表4四种菌株fa1、fa2和fa3以及atcc14048对不同碳源的利用情况(其中，“+”代表可以利用，“–”代表不可以利用，“q”代表不确定。1(甘油)；5(核糖)；10(d-半乳糖)；11(d-葡萄糖)；12(d-果糖)；13(d-甘露糖)；15(鼠李糖)；18(d-甘露醇)；22(n-乙酰氨基葡萄糖)；25(柠檬酸esculin)；26(水杨苷)；27(d-纤维二糖)；28(d-麦芽糖)；31(蔗糖)；32(d-海藻糖)；36(淀粉)；37(糖原)；39(龙胆二糖)；45(d-阿拉伯糖醇)；47(葡萄糖酸钾))表5四种菌株fa1、fa2和fa3以及atcc14048电转化效率pacycduet-1(cfu/μg)peb03(cfu/μg)fa100fa2140030fa32.6*10427atcc140483873以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本
技术领域：
中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。当前第1页12