一种血管和肿瘤增强大分子磁共振对比剂及其制备方法和用途与流程

本发明属于磁共振对比剂领域，具体涉及一种血管和肿瘤增强大分子磁共振对比剂及其制备方法和用途。

背景技术：

现代医学的发展与影像医学的进步密不可分。磁共振成像(magneticresonanceimaging,mri)是其中所起到的重要作用的成像工具之一，其无创性、强大的成像优势和多维度高清晰度空间定位以及可获取活体或受试者分子或细胞代谢生理信息，在实体瘤的研究中可起到量化、定性及疗效动态监测的作用，奠定其在分子影像世界的重要地位。尤其是磁共振对比剂增强成像对于实质性肿瘤、深部软组织肿瘤、富血供肿瘤的成像，可有效获取肿瘤解剖和邻近结构相关信息，实现对肿瘤的精确定位和确定肿瘤来源及其相关血管细节等作用。

然而，当前临床用于肿瘤诊断和分期的常用mri对比剂仍然是基于金属三价钆离(gd³⁺)为主的小分子钆类对比剂。这类对比剂在构建技术上虽然已经相对成熟，在过去的长期使用中也相对安全。但是，有研究报道显示其也存在以下不足：一方面是基于对比剂本身的分子结构小的原因，其在体内滞留时间较短，代谢快；另外一方面是对比剂敏感度低，深部组织穿透性较差；体内循环滞留时间较短，在使用中会造成对比剂的用量增加和多次注射，可能引发潜在的后续不良反应，比如脑内钆的沉积和肾的不可逆损伤-慢性肾纤维化(nephrogenicsystemicfibrosis,nsf)等；此外，由于存在对比剂的深部穿透力、敏感性弱的问题，以至于在富血供肿瘤的显像中，比如像乳腺癌、肝细胞癌等肿瘤的血管及周围环境的显示不足及肿瘤本身的灌注信息缺乏也是咎待解决的实际问题。近年来由于纳米医学在mri对比剂成像研究取得的进展，基于纳米尺寸材料构建的新型大分子磁共振对比剂有望成为解决和改善现存mri对比剂成像问题的新策略。

纳米尺寸材料在生物医药领域研究发现，基于纳米技术的大分子纳米尺寸共聚物作为药物递送系统中在肿瘤的治疗中具有显著的增强渗透和滞留效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect，epr效应)，可以增加其在肿瘤部位的聚集度，提高治疗效果。基于此，前期关于纳米尺寸大分子磁共振对比剂的研究显示，大分子纳米尺寸磁共振对比剂同样具有epr效应，能够在肿瘤部位高度聚集，增强肿瘤部位磁共振对比剂的成像效果。

但是，目前报道的纳米尺寸的大分子磁共振对比剂大都存在生物安全性的问题。这些大分子对比剂骨架本身的安全性和不能产生降解的特性，使其将会在不同的器官中发生不同程度的对比剂沉积和积累，从而给相应的器官和组织造成潜在的不良后果。

因此，研制出具有良好的生物安全性和血液相容性的、增强效果和持续时间显著提高的磁共振对比剂对于肿瘤部位成像、血管成像具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有良好的生物安全性和血液相容性的、增强效果和持续时间显著提高的大分子磁共振对比剂。

本发明提供了一种聚合物，所述聚合物的结构如式i所示：

其中，选自组织蛋白酶敏感的基团、ros敏感的基团、谷胱甘肽敏感的基团或ph敏感的基团；

r选自苯基、c1-5烷基、c1-5烷氧基；

a选自15～25，m选自150～180，n选自5～20；

r1、r2、r3各自独立地选自c1-5烷基、c1-5烷氧基。

进一步地，所述聚合物的结构如式ii所示：

其中，为

a选自15～25，m选自150～180，n选自5～20；优选地，a为18，m为167，n为11。

本发明还提供了一种含钆共聚物，所述含钆共聚物的结构如式iii所示：

其中，选自组织蛋白酶敏感的基团、ros敏感的基团、谷胱甘肽敏感的基团或ph敏感的基团；

r选自苯基、c1-5烷基、c1-5烷氧基；

r1、r2、r3各自独立地选自c1-5烷基、c1-5烷氧基；

a选自15～25，m选自150～180，n选自5～20；

所述含钆共聚物的mw为50～90kda，含gd的重量百分比为5％～10％。

进一步地，所述含钆共聚物的结构如式iv所示：

其中，为

a选自15～25，m选自150～180，n选自5～20；优选地，a为18，m为167，n为11；

更优选地，所述含钆共聚物的mw为76kda，含gd的重量百分比为6.9％。

本发明还提供了上述式ii所述聚合物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)将单体ma-gflg-ome与链转移剂cta-gflgkglfg-cta混合，加入引发剂，反应，得中间产物pgflg-gflg-pgflg；

(2)将中间产物pgflg-gflg-pgflg、单体hpma、单体ma-dota混合，加入引发剂，反应，即得；

其中，所述单体ma-gflg-ome的结构为

所述链转移剂cta-gflgkglfg-cta的结构为

所述中间产物pgflg-gflg-pgflg的结构为

所述单体hpma的结构为

所述单体ma-dota的结构为

进一步地，步骤(1)中，所述单体ma-gflg-ome与链转移剂cta-gflgkglfg-cta、引发剂的摩尔比为94.5：1.1：1，所述引发剂为偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐；

所述反应的溶剂为去离子水与甲醇的混合溶剂；

所述反应的温度为0～45℃，反应的时间为5～10小时；所述反应是在惰性气体保护下进行的；

和/或，步骤(2)中，所述中间产物pgflg-gflg-pgflg、单体hpma、单体ma-dota、引发剂的质量比为1：3.5：5：0.02；所述引发剂为偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐；

所述反应的溶剂为去离子水与甲醇的混合溶剂；

所述反应的温度为室温，反应的时间为20～30小时；所述反应是在惰性气体保护下进行的。

本发明还提供了上述式iii或式iv所示含钆共聚物的制备方法，其特征在于：所述方法为将式i或式ii所述的聚合物与含gd³⁺的化合物反应，提纯，即得；

优选地，所述含gd³⁺的化合物为gdcl3·6h2o；式i或式ii所述的聚合物与含gd³⁺的化合物的质量比为2.8：1；所述反应的ph为5.2-5.4，反应的温度为20～25℃，时间为14～24h；

所述提纯的方法为：在去离子水中透析。

本发明还提供了式iii或式iv所述含钆共聚物在制备磁共振对比剂中的用途。

进一步地，所述磁共振对比剂能够在肿瘤部位、血管成像；优选地所述血管包括肿瘤周围血管、肝脏血管、肾脏血管、腹部血管、头部血管。

进一步地，所述磁共振对比剂能够诊断肿瘤和/或血管病变；优选地，所述血管病变包括管腔狭窄、动脉瘤、动静脉瘘、动静脉畸形、动脉夹层。

本发明还提供了一种诊治一体的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的式iii或式iv所述含钆共聚物和化疗药物，以及药学上可接受的载体。

实验结果表明，本发明成功制得了一种gflg组织蛋白酶敏感的可降解含钆共聚物mph-dota-gd，该含钆共聚物mph-dota-gd弛豫率为10.9mm^-1·s^-1，比临床使用的dtpa-gd(3.4mm^-1·s^-1)高约3倍，同时其体内循环时间长，毒性低，具有良好的血液相容性，在肿瘤部位的增强效果和持续时间显著提高，在血管成像方面，特别是在动脉血管解剖形态、解剖细节以及动脉多级分支显示等方面显影效果显著，作为磁共振对比剂和诊治一体大分子聚合物前药具有非常优良的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.磁共振对比剂mph-dota-gd的合成路线图。

图2.(a)磁共振对比剂mph-dota-gd示意图，(b)mph-dota-gd的¹hnmr图谱。

图3.磁共振对比剂mph-dota-gd的粒径，约为180nm。

图4.磁共振对比剂mph-dota-gd的zeta电位，约为-9.3mv。

图5.磁共振对比剂mph-dota-gd的sem扫描粒径，约为120nm。

图6.磁共振对比剂mph-dota-gd的临界胶束浓度

图7.a)磁共振对比剂mph-dota-gd的粒径变化。b)磁共振对比剂mph-dota-gd的电位变化。

图8.磁共振对比剂mph-dota-gd降解粒径变化。

图9磁共振对比剂mph-dota-gd的体外弛豫成像。

图10.磁共振对比剂mph-dota-gd的在huvec细胞和4t1细胞中的细胞毒性实验。

图11.注射磁共振对比剂mph-dota-gd后小鼠体重变化。

图12.注射磁共振对比剂mph-dota-gd后小鼠各器官h&e染色切片。

图13.磁共振对比剂mph-dota-gd的血液相容性。

图14.磁共振对比剂mph-dota-gd的体内代谢。

图15.磁共振对比剂mph-dota-gd的体内分布实验。

图16.磁共振对比剂mph-dota-gd的细胞摄取。

图17.磁共振对比剂mph-dota-gd在乳腺癌皮下瘤模型肿瘤部位t1加权成像。

图18.磁共振对比剂mph-dota-gd在乳腺癌原位瘤模型肿瘤部位t1加权成像。

图19.a)磁共振对比剂mph-dota-gd肿瘤模型中各器官长时间t1加权成像；b)dtpa-gd在肿瘤模型中各器官长时间t1加权成像。

图20.磁共振对比剂mph-dota-gd和dtpa-gd在肿瘤模型肝脏血管成像。

图21.a)注射mph-dota-gd后不同时间点肿瘤周围血管成像mip结果；b)注射dtpa-gd后不同时间点全腹部血管成像mip结果。

图22.a)注射mph-dota-gd后不同时间点肝脏血管成像mip结果(左，冠状位；右，横断位)；b)注射dtpa-gd后不同时间点肝脏血管成像mip结果(左，冠状位；右，横断位)。

图23.a)注射mph-dota-gd后不同时间点肾脏血管成像mip结果(左，冠状位；右，横断位)；b)注射dtpa-gd后不同时间点肾脏血管成像mip结果(左，冠状位；右，横断位)。

图24.a)注射mph-dota-gd后不同时间点全腹部血管成像mip结果(冠状位,1肝血管；2腹主动脉；3下腔静脉；4脾动脉；5肾动脉；6髂血管；7卵巢动脉。

图25.a)注射mph-dota-gd后不同时间点头部血管成像mip结果(冠状位,1上矢状窦；2脑室动脉；3大脑前动脉；4前交通动脉；5后交通动脉；6大脑中动脉；7颈内动脉；)；b)注射dtpa-gd后不同时间点全腹部血管成像mip结果(冠状位)。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、本发明磁共振对比剂mph-dota-gd的合成

根据图1所示的合成路线，制备本发明的磁共振对比剂mph-dota-gd。

(1)原料的合成

a.单体hpma(参照eur.polym.j.,1973,9,7-14制备)、ma-dota(参照acsappl.mater.interfaces,2016,8,10499-10512制备)均按已有文献制得。

b.ma-gflg-ome的制备

boc-gflg-ome按文献报道的方法合成(bioconjugatechem.,vol.11,no.2,2000137)。取boc-gflg-ome2g(0.004mol，1eq)于圆底烧瓶中，冰浴下加入dcm/tfa(10eq)的混合溶液，tlc检测至反应完全。旋去溶剂，加入乙醚沉淀，得到白色固体粉末。将该固体粉末溶于30mldcm，加入阻聚剂及三乙胺(3eq)。冰浴下滴加甲基丙烯酰氯(0.5g，1.2eq)，滴加完毕后转移至室温反应，tlc监测至反应完全。用水洗后干燥浓缩，过柱纯化得白色固体粉末ma-gflg-ome(1.6g，yield85.6％)。

c.cta-gflgkglfg-cta的制备

取boc-gflg-ome2g(0.004mol，1eq)于圆底烧瓶，加入30ml甲醇溶解后冰浴下加入氢氧化钠(0.8g，5eq)的甲醇溶液。室温反应，tlc检测反应完全。旋去甲醇，加入100mlea后用稀盐酸(1m)调节ph至酸性。干燥后旋干得白色固体粉末(1.9g，yield97.7％)。上步制备的boc-gflg-oh1g(0.004mol，1eq)、fmoc及otbu保护的赖氨酸fmoc-otbu-lys-nh2(1.03g，1.1eq)、缩合剂hobt(0.81g，1.5eq)及hbtu(1.68g，1.5eq)置于氮气氛。加入20mldmf溶解后冰浴下加入diea(1.55g，3eq)，tlc检测反应。反应完全后将反应液加入到300mldcm中，依次用饱和碳酸氢钠、稀盐酸及饱和氯化钠洗后干燥，浓缩后过柱纯化得固体粉末boc-gflgk-fmoc-otbu(1.4g，yield78.8％)。

将上步所得产品boc-gflgk-fmoc-otbu1g溶于5mldmf中，冰浴下加入1ml吡啶，反应15min，加入大量pe处理得黏稠物，过柱纯化得固体粉末(0.65g，yield86.3％)。上步制得的固体0.6g(0.886mmol，1eq)、boc-gflg-cooh(0.46g,1.05eq)、缩合剂hobt(0.37g，1.5eq)及hbtu(0.18g，1.5eq)置于氮气氛。加入10mldmf溶解后冰浴下加入diea(0.17g，3eq)，tlc检测反应。反应完全后将反应液加入到300mldcm中，依次用饱和碳酸氢钠、稀盐酸及饱和氯化钠洗后干燥，浓缩后过柱纯化得固体粉末boc-gflgkglfg-boc-otbu(1.2g，yield79.7％)。

取boc-gflgkglfg-boc-otbu1g(0.869mmol)溶于tfa/dcm(1:1,10ml)中选择性脱去boc保护基团，反应完全后旋去溶剂，用乙醚处理得白色固体粉末。将所得粉末与cta-cooh(0.51g，1.05*2eq)、缩合剂hatu(0.99g，1.5*2eq)置于氮气氛，冰浴下加入dmf溶解后加入diea(0.64g，3*2eq)反应，tlc检测反应。反应完全后将反应液加入大量300mldcm中，依次用饱和碳酸氢钠、稀盐酸及饱和氯化钠洗后干燥，浓缩后过柱纯化得红色固体粉末cta-gflgkglfg-cta-otbu(0.96g，yield75％)。

将所得的红色固体粉末cta-gflgkglfg-cta-otbu0.8g溶于tfa(10ml)中脱去otbu保护，反应完全后旋去溶剂，过柱纯化得红色固体粉末cta-gflgkglfg-cta(0.7g，yield90.9％)。

(2)mph-dota-gd的合成

将单体ma-gflg-ome(1.78g,3.75mmol)和链转移剂cta-gflgkglfg-cta(42.5mg,44.5μmol)置于充满氮气的反应器中，加入20ml包含va044(偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐，9.6mg,39.7μmol)的去离子水/甲醇(1:2)混合溶剂。冰浴条件，氩气保护反应45分钟。然后，封闭反应装置，将此反应体系在44℃下继续搅拌5小时。打开反应系统，用液氮终止反应，得到的粗产品在丙酮/乙醚(1:1)的混合溶液中析出，离心法分离。继续在丙酮溶液进行两次溶解-析出，干燥后得到淡粉色产物pgflg-gflg-pgflg(545mg,产率29.9％)。

将单体hpma(1.75g,12.25mmol)、ma-dota(2.52g,4.90mmol)和上述聚合物pgflg-gflg-pgflg(498mg)置于充满氮气的反应器中，加入20ml包含va044(8.6mg,26.5μmol)的去离子水/甲醇(1:2)混合溶剂，聚合24小时后，将聚合终止。将粗产物从丙酮中沉淀出来，并通过fplc系统进一步纯化。收集产物，在水中透析并冻干，得到聚合物p[hpma-dota]-block-pgflg-gflg-pgflg-block-p[hpma-dota](3.45g，产率71.7％)。

为了使聚合物具有mr成像的能力，将聚合物p[hpma-dota]-block-pgflg-gflg-pgflg-block-p[hpma-dota](850mg)溶于水中。搅拌溶液，并逐滴加入gdcl3·6h2o(300mg，0.81mmol)的水溶液，同时用naoh(0.1m)将反应溶液的ph控制在5.2-5.4。将该溶液在20℃下搅拌14小时。将该溶液在水中透析，冻干，得到最终产物，得到最终产物p[hpma-dota-gd]-block-pgflg-gflg-pgflg-block-p[hpma-dota-gd](命名为：mph-dota-gd，885mg，mw＝82kda，pdi＝1.24)。

示意图如图2(a)所示，通过icp-ms测量gd含量为6.9％，¹hnmr图谱如图2(b)所示。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、磁共振对比剂mph-dota-gd的表征

a、实验方法

1磁共振对比剂mph-dota-gd的分子量表征

将实施例1所得最终产物磁共振对比剂mph-dota-gd，通过尺寸排阻色谱(sizeexclusionchromatography，sec，gehealthcare公司)测得其分子量(mw)和多分散指数(pdi)。乙酸钠缓冲液/甲醇(7：3，ph6.5)用作流动相，相应的流速为0.4ml/min。磁共振对比剂mph-dota-gd通过尺寸排阻色谱法使用superose6hr10/30柱纯化，流动相为乙酸钠缓冲液/甲醇(7：3，ph6.2)和流速为2.5ml/min，温度为4℃。磁共振对比剂mph-dota-gd通过尺寸排阻色谱法使用superose6hr10/30分级分离/纯化(亲水性中性聚合物的mw范围15-300kda/14ml分离体积)在系统(gehealthcare)柱上用乙酸钠进行色谱柱分离含有30％甲醇(ph＝6.5)的缓冲液作为流动相。

2磁共振对比剂mph-dota-gd的粒径分布和zeta电位

称取磁共振对比剂mph-dota-gd，pbs溶解至终浓度为1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml，nanozs(malverninstruments，worcestershire，uk)表征样品粒径和ζ电位。每次测量重复三次，最终数据使用dts软件版本3.32进行处理。

3磁共振对比剂mph-dota-gd的扫描电镜(sem)形貌表征

称取磁共振对比剂mph-dota-gd,使用超纯水溶解至100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml，移液枪吸取10μl溶解液垂直滴加在硅片上，室温下放于通风处晾干。晾干后，用扫描电子显微镜观察样品形貌。

4磁共振对比剂mph-dota-gd的gd含量测定

称取磁共振对比剂mph-dota-gd，纯水溶解至终浓度为1mg/ml。用初始浓度为1mg/ml的含gd标准溶液配置浓度为1mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l的标准浓度曲线。标准曲线浓度溶液和样品用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量其载钆量。

5磁共振对比剂mph-dota-gd的临界胶束浓度(cmc)测量

将浓度为1mg/ml的mph-dota-gd溶液稀释至不同浓度(0.001-1000μg/ml)。然后，准确称量芘并溶解在丙酮中以制备浓度为10μg/ml的芘溶液。移取21μl芘/丙酮溶液到一系列ep管中，并将它们放在通风的黑暗处。让丙酮干燥。然后将1.5ml制备的聚合物溶液转移到每个ep管中，并在37℃下在80rpm的温和摇动下温育过夜。荧光激发波长为330nm，扫描范围为350至500nm。读取λ1＝372nm和λ3＝383nm处的峰值强度值i1和i3，并计算i1/i3。通过i1/i3计算其临界胶束浓度。

6磁共振对比剂mph-dota-gd的稳定性研究

称取磁共振对比剂mph-dota-gd，pbs溶液溶解至1mg/ml放置在室温下，每天用nanozs(malverninstruments，worcestershire，uk)表征样品粒径和ζ电位，连续观测7天，观察粒径和ζ电位变化及其稳定性。

7磁共振对比剂mph-dota-gd的生物降解性研究

称取磁共振对比剂mph-dota-gd，用超纯水溶解至1mg/ml，加入谷胱甘肽(gsh，3.2mg/ml)和木瓜蛋白酶(1.5mg/ml)溶液在37℃下孵育5分钟以模拟体内肿瘤环境，然后将混合的溶液加入到试剂溶液(1mg/ml)中探索可生物降解的潜力，孵育后1h、2h、4h和8h检测其粒径变化。

8磁共振对比剂mph-dota-gd的弛豫率测定

室温下ph7.4pbs溶解材料，材料浓度为对应gd(iii)溶度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mm)，临床用gd-dtpa为对照组，3.0t磁共振扫描，t1加权磁共振扫描序列参数如下：te＝8.7ms,tr＝25、30、50、70、90、110、150、170、190、210、250、300、400、600、700和800ms；fov＝200mm；slicethickness＝2.0mm；matrixdimensions＝256×256。弛豫效率值通过1/t1和gd(iii)离子线性关系的斜率得出。

9磁共振对比剂mph-dota-gd的体外细胞毒性实验

将4t1细胞(鼠源乳腺癌细胞)和huvec细胞(人源血管内皮细胞)，两种细胞分别接种到96孔板中(5×10³个/孔)，100μldmem培养基在37℃，5％co2的培养箱中培养24h后，弃去96孔培养板中的培养基。然后加入含有不同浓度(25、50、100、200μg/ml)的磁共振对比剂mph-dota-gd和dtpa-gd的培养基继续孵育24小时。24小时后用磷酸盐缓冲液(phosppatebufferedsaline,pbs)洗三次细胞，然后每孔加入细胞毒性评价试剂盒cck-8(dojindo，japan)。孵育2小时后，用用酶标仪(thermofisherscientific)测450nm处的吸光度。未处理的细胞活性记作100％，根据横向和纵向比较评价其细胞毒性作用。

10磁共振对比剂mph-dota-gd的红细胞溶血性实验

用含有柠檬酸钠的抗凝管抽取正常短期内为服用任何药物的志愿者新鲜血液，1000g离心5min，pbs洗3次，弃去上层清液，取红细胞和pbs配成16％的红细胞悬液。然后向50ul细胞悬液中分别加入终浓度为1、3、5mg/ml的mph-dota-gd，设立去离子水为对照组，37℃孵育12小时后1000g离心5min，取上层清液200μl转移至96孔板中，酶标仪测定样品在540nm的od值。每个浓度设立三个平行组进行测试。溶血百分率通过下面的公式来计算：

溶血率(％)＝(a-b)/(c-b)×100％

a:纳米粒样品溶液测试的吸光度，b:pbs缓冲液样品测试的吸光度，c:水溶液样品测试的吸光度。

11磁共振对比剂mph-dota-gd的红细胞形貌和聚集实验

抽取健康人体新鲜血液(抗柠檬酸钠管子中)，加入pbs,1000g离心5min，弃去上层清液，重复两次，搜集红细胞。向1.5ml的ep管中，加入100μl的mph-dota-gd材料pbs溶液，设立同体积pbs溶液为对照组，然后加入20μl的红细胞，吹打混匀。室温孵育15min，离心，弃去上清液，加入0.5ml4％的pbs多聚甲醛溶液，吹打，混匀，固定至少1h。将固定的红细胞重悬，吸取20μl悬浮液均匀涂在24孔板底部，5min后次用75％、85％、95％和100％的乙醇水溶液进行脱水。最后在25度恒温条件下自然晾干，sem扫描观察细胞形貌和聚集。

12磁共振对比剂mph-dota-gd的体内毒性实验

28只正常雌性balb/c小鼠(20±2g)，随机分为3组，称重，标记。其中三组小鼠分别尾静脉给予0.08mmolgd(iii)/kg浓度的dtpa-gd,mph-dota-gd，另外一组给予相同体积的生理盐水作为阴性对照，每4天给药一次，共3次，给药后每2天小鼠称重一次并记录。20天后，处死后取出重要器官(心、肝、脾、肺、肾)，用4％的多聚甲醛溶液固定48小时，石蜡包埋，he染色，作组织切片分析。

13磁共振对比剂mph-dota-gd的体内代谢实验

为了检测聚合物的循环时间和药代动力学，通过尾静脉将0.08mmolgd(iii)/kg的mph-dota-gd和dtpa-gd注射到健康小鼠中。之后，在注射后的估计时间点从眼底静脉丛收集20μl血液。用hno3和h2o2消化血液并通过icp-ms测试。

14磁共振对比剂mph-dota-gd的体内分布实验

15只皮下乳腺癌模型小鼠随机分为3组，分别通过尾静脉注射mph-dota-gd和dtpa-gd[0.08mmgd(iii)/kg]，24小时后处死小鼠，取出重要脏器和组织(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)，4％甲醛溶液固定。器官和组织用pbs清洗一次，称重。用h2o2(1ml)和hno3(3ml)溶解器官，加热到120℃直到组织完全消化，然后用去离子水稀释到4ml。最终样品用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测量各器官或组织内剩余的钆的浓度。体内剩余gd的含量通过下面公式可计算出：

b、实验结果

1磁共振对比剂mph-dota-gd的分子量表征

所得mph-dota-gd的mw：82kda，pdi：1.24。

2磁共振对比剂mph-dota-gd的粒径分布和zeta电位

如图3，磁共振对比剂mph-dota-gd的粒径约为180nm。目前，食品和药物管理局(fda)批准的具有治疗效果的纳米颗粒的粒径一般在50-200nm左右。因此，本发明制得的聚合物mph-dota-gd能够通过epr效应选择性地在肿瘤部位高度聚集。自组装后形成纳米级别的胶束样磁共振对比剂，其表面电位约为-9.3mv(图4)。由于同性相斥的物理原理，表面带负电荷的对比剂进入血液循环后不会与循环中的同样带负电荷各类蛋白质结合，保证了其在血液循环中的稳定性和安全性。

3磁共振对比剂mph-dota-gd的sem形貌

通过扫描电子显微镜结果可以看出(图5)，磁共振对比剂mph-dota-gd的干相粒径约为120nm左右，形貌类似球形。sem显示的粒径相比于dls测量的粒径偏小，是由于sem结果是待样品晾干后观测到的。sem形貌显示对比剂类似球形。

4磁共振对比剂mph-dota-gd的gd含量

通过icp-ms检测和标准曲线计算后得到磁共振对比剂mph-dota-gd的载钆量为6.9％。

5磁共振对比剂mph-dota-gd的临界胶束浓度(cmc)

临界胶束浓度(cmc)是表征化合物表面活性性质的物理值。聚合物胶束的核-壳结构通常在cmc浓度以上自组装形成，通常由两亲物之间的亲水疏水相互作用驱动。从实验结果可以看出，mph-dota-gd在372和383nm处荧光强度比(i1/i3)的趋势在约5-10μg/ml处改变(图6)，这意味在这个浓度以上聚合物逐渐形成胶束。本发明mph-dota-g的体内给药浓度远高于cmc，因此具有大量羟基的亲水基团的壳为改善mph-dota-gd的生物相容性和生物安全性以及延长体循环时间提供了巨大的潜力。

6磁共振对比剂mph-dota-gd的稳定性

如图7所示，在pbs溶液中连续观察7天，磁共振对比剂mph-dota-gd的粒径和ζ电位没有出现明显变化。磁共振对比剂自身组装形成的纳米尺寸球状结构，在水溶液中始终保持外周亲水核心疏水的状态，在溶液中的组装形态没有发生改变，同时其表面电位也没有发生改变，以此保证了磁共振对比剂mph-dota-gd的稳定性。

7磁共振对比剂mph-dota-gd的生物降解性

可生物降解性赋予了聚合物良好的生物安全性。有研究报道，浸润性肿瘤组织中具有高表达的蛋白酶，比如组织蛋白酶b，其与侵袭性和转移性表型高度相关。本发明通过在37℃下与木瓜蛋白酶溶液一起孵育用于模拟肿瘤环境来研究聚合物的可生物降解性质，因为木瓜蛋白酶和组织蛋白酶b之间具有相似的活性和功能。如图8所示，用木瓜蛋白酶孵育12小时后出现约20nm，这表明聚合物可以在肿瘤部位降解成小片段。孵育后其他时间点(3h和6h)的结果如图所示，1000nm处的峰值代表木瓜蛋白酶的大小。gflg连接体可能在高浓度的木瓜蛋白酶降解，并导致mph-dota-gd的降解。mph-dota-gd的大小和可降解性质确保了肿瘤部位的选择性聚集和敏感性降解。

8磁共振对比剂mph-dota-gd的弛豫率

弛豫率是mr对比剂的基本特性。在3.0tmri扫描仪中大分子对比剂的弛豫率为10.9mm^-1·s^-1，比临床使用的dtpa-gd(3.4mm^-1·s^-1)高约3倍(图9)。从结果可以看出，大分子对比剂mph-dota-gd比dtpa-gd作为mri对比剂具有更好的效果，其具有比临床dtpa-gd更高的弛豫率和溶解度。

9磁共振对比剂mph-dota-gd的体外毒性

本发明通过cck-8实验进一步测试了mph-dota-gd材料对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性作用。cck-8试剂盒是一种基于wst-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒，wst-8在电子耦合剂1-methoxypms(1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯)存在的情况下可以被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(formazandye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。利用酶标仪测定450nm吸光度可以定量反应活细胞数量，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

如图10示，与不同浓度的mph-dota-gd(25-200μg/ml)孵育后，与对照组相比，huvec和4t1细胞的细胞活力没有显著改变。结果表明，mph-dota-gd对正常细胞和肿瘤细胞没有显着的细胞毒性。

10磁共振对比剂mph-dota-gd的体内毒性

上述实验证明了mph-dota-gd具有良好的生物安全性。本发明通过分析健康小鼠的重量变化和器官的组织学，进一步评估mph-dota-gd的体内毒性。根据给药后一周内的体重数据，未发现体重的显著变化(图11)。一周后，处死所有小鼠并收集主要器官进行组织学分析。所有主要器官均正常，未观察到明显的组织病理学异常(图12)，表明没有明显的体内细胞和组织损伤迹象。上述结果证明了该对比剂良好的生物安全性和药剂的生物相容性。

11磁共振对比剂mph-dota-gd的血液相容性评价

良好的血液相容性是外源生物材料的基本需求，因为血浆和血细胞在血管给药后首先与材料相互作用。从实验中，可以检测到材料的溶血效应。与阳性对照组相比，从肉眼看，mph-dota-gd在与血浆孵育后几乎不引起溶血(图13a)，并且溶血的情况与阴性对照相似。紫外分光光度计的半定量分析表明，聚合物mr对比剂的溶血率为0.8％，远低于美国测试和材料协会标准(图13b)。实验还测试了mph-dota-gd对rbc形态的影响，如图13c-d所示，通过sem与mph-dota-gd孵育后，与pbs比较，rbc的形态没有变化。这些结果表明聚合物mr对比剂具有很好的血液相容性。

12磁共振对比剂mph-dota-gd的体内代谢

本发明测试了健康小鼠中对比剂的血液循环。如图14所示，mph-dota-gd的半衰期为161分钟，这比dtpa-gd(14分钟)长得多，与上述的实验结果一致。

13磁共振对比剂mph-dota-gd的体内分布

在注射后24小时检测药剂在器官中的生物分布。如图15所示，mph-dota-gd的残留钆显着高于肿瘤中的dtpa-gd(p<0.01)，由于epr效应，其在肿瘤中有明显的对比效果。然而，在其他器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)中，mph-dota-gd的残留钆也比dtpa-gd更多。mph-dota-gd的高分子量和纳米级尺寸导致体内循环时间长，然后增加主要器官中残留的钆。

上述实验表明，本发明合成的磁共振对比剂mph-dota-gd在pbs溶液中具有良好的稳定性，且在模拟肿瘤内部环境中能被降解为小片段；其具有t1增强对比剂的属性，弛豫率为10.9mm^-1·s^-1，比临床使用的dtpa-gd(3.4mm^-1·s^-1)高约3倍。同时，本发明合成的磁共振对比剂mph-dota-gd毒性低、不会引起溶血反应，具有良好的血液相容性，体内循环时间长，是一种具有良好稳定性和生物降解性，且具有较高的弛豫率的新型大分子磁共振对比剂。

实验例2、本发明磁共振对比剂mph-dota-gd的肿瘤部位成像和肿瘤周围血管成像性能评价

a、实验方法

1磁共振对比剂mph-dota-gd的细胞摄取实验

将4t1细胞(每孔1×10⁵)接种在6孔板上。随后，加入具有gd(iii)浓度(100和25μg/ml)的mph-dota-gd并在培养箱中孵育12小时。洗涤，收集细胞，离心并处理以进行mr成像。mri扫描在7tmri扫描仪(bruker)中进行，具有以下参数：tr＝1000ms、te＝6.5ms、rarefactor＝4、numberofaverages＝2、slicethickness＝0.6mm。在扫描系统中定量测量细胞信号强度。

2磁共振对比剂mph-dota-gd乳腺癌皮下瘤模型肿瘤部位t1加权成像

利用4t1细胞小鼠背部皮下接种建立小鼠乳腺癌皮下模型。首先7×10⁵个4t1细胞准确接种到6-7周龄balb/c小鼠背部，肿瘤生长到约150mm³左右后将小鼠随机分为2组，每组包括5只小鼠。三组小鼠分别尾静脉注射mph-dota-gd和临床用dtpa-gd(0.08mmolgd(iii)/kg)。同样的，将细胞准确接种到小鼠第四对乳房右侧脂肪垫上建立原位肿瘤模型。通过3.0t磁共振扫描仪获得不同时间点材料在肿瘤部位的聚集度。扫描前用戊巴比妥麻醉小鼠，然后将小鼠固定于定制线圈。t1加权扫描序列如下：tr＝500ms、te＝11ms、slices＝13、fovread＝47mm。注射前，注射后10分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时和12小时后分别扫描，获得肿瘤部位聚集图像，然后利用磁共振成像系统工具圈取肿瘤部位获得具体数值。

3磁共振对比剂mph-dota-gd乳腺癌原位瘤模型肿瘤部位t1加权成像

利用4t1细胞接种到小鼠第四对乳房右侧脂肪垫上建立小鼠乳腺癌原位模型。首先7×10⁵个4t1细胞准确接种到小鼠第四对乳房右侧脂肪垫上，肿瘤生长到约150mm³左右后将小鼠随机分为2组，每组包括5只小鼠。三组小鼠分别尾静脉注射mph-dota-gd和临床用dtpa-gd(0.08mmolgd(iii)/kg)。通过3.0t磁共振扫描仪获得不同时间点材料在肿瘤部位的聚集度。扫描前用戊巴比妥麻醉小鼠，然后将小鼠固定于定制线圈。t1加权扫描序列如下：tr＝500ms、te＝11ms、slices＝13、fovread＝47mm。注射前，注射后10分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时和12小时后分别扫描，获得肿瘤部位聚集图像，然后利用磁共振成像系统工具圈取肿瘤部位获得具体数值。

4磁共振对比剂mph-dota-gd肿瘤模型各器官长时间t1加权成像

为了探索聚合物在主要器官中的生物分布和循环，在一周内进行扫描过程。通过尾静脉给小鼠施用mph-dota-gd和dtpa-gd。药剂的浓度为0.08mmolgd(iii)/kg。在注射后0.5h、1h、2h、3h、24h、2d，3d、4d、5d、6d和7d，在mri扫描仪(siemens，3.0t)中获得图像。扫描参数与肿瘤成像相同。在扫描系统中定量测量主要器官的信号。

5磁共振对比剂mph-dota-gd肿瘤模型肿瘤周围血管成像

本发明使用皮下乳腺肿瘤模型，进行肿瘤周围血管的mr血管造影以评价mph-dota-gd作为血池对比剂的潜力。在扫描中使用飞行时间(tof)序列，参数如下：tr＝30ms、te＝6.41ms、slicethickness＝0.35mm、fovread＝47mm、fovphase＝92mm。在不同时间点注射mph-dota-gd和dtpa-gd后获得mra图像。首先收集dtpa-gd的图像，2天后，在注射dtpa-gd的同一小鼠中获得mph-dota-gd的图像。

6磁共振对比剂mph-dota-gd肿瘤模型肝脏血管成像

本发明中使用皮下乳腺肿瘤模型，进行肝脏周围血管的mr血管造影以评价mph-dota-gd作为血池对比剂的潜力。在扫描中使用飞行时间(tof)序列，参数如下：tr＝30ms、te＝6.41ms、slicethickness＝0.35mm、fovread＝47mm、fovphase＝92mm。在不同时间点注射mph-dota-gd和dtpa-gd后获得mra图像。首先收集dtpa-gd的图像，2天后，在注射dtpa-gd的同一小鼠中获得mph-dota-gd的图像。

b、实验结果

1磁共振对比剂mph-dota-gd的细胞摄取

本发明测试了肿瘤细胞对聚合物的吞噬作用。如图16所示，随着浓度的增加，肿瘤细胞的信号逐渐增强，这表明mph-dota-gd可以吞噬到肿瘤细胞中。随着药剂浓度的增加，来自mri的图像也显示出更明亮(图16)。结果表明药剂可以进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞中，mph-dota-gd的试剂可以被溶酶体中的高浓度的组织蛋白酶b降解成小片段并从体内清除。

2磁共振对比剂mph-dota-gd乳腺癌皮下瘤模型肿瘤部位t1加权成像

如上述体外实验结果所示，大分子磁共振对比剂具有很好的增强效果，本发明利用动物实验进一步测试体内增强效果。如图17a所示，乳腺癌皮下瘤小鼠模型中，注射临床对比剂dtpa-gd后肿瘤的亮度略微增强，并且在注射后10分钟达到最亮。10分钟后信号开始下降，并在注射后约4小时恢复到原始状态。但是在注射磁共振对比剂mph-dota-gd后情况完全不同。注射后，肿瘤的亮度迅速增强，在肿瘤部位持续约8小时。对比可以发现，聚合物mph-dota-gd比临床用dtpa-gd具有更好的对比增强效果和更长的体内成像时间。通过信号圈取工具半定量地分析相对增强效果。如图17b所示，相对增强的si在注射mph-dota-gd后随时间增加，并在注射后8小时达到约175％。然而，在注射dtpa-gd后30分钟检测到最高的si仅110％。结果表明mph-dota-gd试剂在肿瘤中具有很大的增强效果并且在体内具有比临床dtpa-gd更长的循环时间。

3磁共振对比剂mph-dota-gd乳腺癌原位瘤模型肿瘤部位t1加权成像

上述实验表明在乳腺癌皮下瘤模型大分子磁共振对比剂具有很好的增强效果，本发明进一步测试了mph-dota-gd在乳腺癌原位瘤模型中的t1增强效果。乳腺癌原位瘤模型是将肿瘤细胞注射到小鼠乳房垫上，待其生长到合适大小再进行扫描。与乳腺癌皮下瘤模型相比，乳腺癌原位瘤模型更接近人体乳腺癌的生长特点。如图18a所示，乳腺癌原位瘤小鼠模型中，注射临床对比剂dtpa-gd后肿瘤的亮度略微增强，并且在注射后约30分钟达到最亮。30分钟后信号开始下降，并在注射后约1小时恢复到原始状态。而注射磁共振对比剂mph-dota-gd后，肿瘤的亮度持续增强，在肿瘤部位持续约8小时。对比可以发现，聚合物mph-dota-gd比临床用dtpa-gd具有更好的对比增强效果和更长的体内成像时间。

通过信号圈取工具半定量地分析相对增强效果。如图18b所示，相对增强的si在注射磁共振对比剂mph-dota-gd后随时间增加，并在注射后8小时达到约200％。然而，在注射dtpa-gd后30分钟检测到最高的si-仅150％。结果表明mph-dota-gd试剂在肿瘤中具有很大的增强效果并且在体内具有比临床dtpa-gd更长的循环时间。乳腺癌原位瘤原位瘤模型和皮下瘤模型得到的结果类似，更加充分的验证了磁共振对比剂mph-dota-gd在肿瘤部位的成像效果明显优于临床用小分子磁共振对比剂dtpa-gd。

4磁共振对比剂mph-dota-gd肿瘤模型各器官长时间t1加权成像

本发明在肿瘤模型小鼠中注射mph-dota-gd和dtpa-gd后连续扫描主要器官(肝脏、肾脏和膀胱)，测试了造影剂的增强时间，将不同时间的肌肉信号强度作为参照。结果显示在图19、图20中，可以看出在注射dtpa-gd后肝脏和肾脏的相对增强在注射0.5小时后增加至最高点，1天恢复至约原始状态。在膀胱中，由于膀胱中尿液的储存，峰值时间为1小时，注射后恢复时间约为1天。然而，mph-dota-gd(图19a)比dtpa-gd(图19b)的增强效果好且增强时间长。所有器官的相对增强超过300％，远高于临床使用的dtpa-gd(100-200％)。并且所有器官的强度在注射后第4天恢复到原始状态。

5磁共振对比剂mph-dota-gd肿瘤模型肿瘤周围血管成像

如上所述，mph-dota-gd试剂具有比临床使用的dtpa-gd更好的增强效果。此外，mr对比剂剂是很好的血池对比剂，可用于血管造影的mr成像。因此，本发明进一步通过使用fisp序列在血管中测试了mph-dota-gd的增强效果。fisp是一种最主要的mra成像方法。在这种方法中，进入成像区域的血液尚未饱和，当使用短回波时间和流量补偿时，它会产生更高的信号。

如图21所示，注射dtpa-gd后，无法检测到肿瘤周围的小血管。然而，在注射mph-dota-gd后主要供血血管可以清楚地成像并且持续约2小时，肿瘤周围部分供应血管清晰可见，边缘锐利，甚至可见部分肿瘤内部小的血管。2小时后肿瘤周围血管增强效果开始减低，12小时后基本消退。通过这种方式，可以清楚地呈现肿瘤的血液供应和肿瘤周围的环境，这对肿瘤的诊断和治疗非常有帮助。此外，mra的巨大功效还可用于诊断其他血管疾病，包括出血，缺血，栓塞等。

上述实验表明，相较于临床用磁共振对比剂dtpa-gd，本发明制得的大分子磁共振对比剂mph-dota-gd在相同浓度下在肿瘤部位的增强效果和持续时间显著提高，在肿瘤部位周围血管和肝脏血管的成像中显示效果也更为显著。所以，本发明大分子磁共振对比剂mph-dota-gd在肿瘤部位成像和肿瘤周围血管成像中具有明显优势。

实验例3、本发明磁共振对比剂mph-dota-gd对正常小鼠血管的mra成像测试

a、实验方法

取正常balb/c小鼠，称重后放置在诱导盒，用异氟烷诱导麻醉。完全麻醉后将小鼠放入扫描线圈，固定并给予小剂量异氟烷持续麻醉，使用7.0t布鲁克小动物扫描仪进行扫描。使用3d-fisp序列进行血管成像，扫描参数如下：te＝2.6ms、tr＝5.5ms、fov＝35mm×35mm×45mm、resolution＝0.12×0.12×0.35、flipangle＝10°、scantime＝14min。尾静脉注射mph-dota-gd前采集基线数据，然后注射大分子磁共振对比剂mph-dota-gd[0.08mmolgd(iii)/kg]。注射前，注射后10分钟、30分钟、1小时、1.5小时、2小时、5小时和12小时后分别扫描，获得小鼠肝脏、肾脏、腹部、头部血管增强图像。使用radiantdicom软件进行图像后处理。

b、实验结果

1磁共振对比剂mph-dota-gd正常小鼠肝脏血管成像

正常小鼠注射磁共振对比剂mph-dota-gd后不同时间点肝脏血管成像结果如图22a所示，注射后10分钟，腹膜后腹主动脉明显强化，小鼠肝动脉、门静脉主干及其分支开始出现显著强化，形似树枝状分布，走行迂曲清晰、管壁锐利、管腔充盈，与周围肝实质对比度佳，同时，引流的下腔静脉充盈亦呈明显强化，5小时观察，肝内部分肝、门静脉分支仍可见轻度强化显影，12小时观察腹主动脉、肝内血管无明显强化。应用mph-dota-gd观察肝脏血管强化于30分钟内效果最为显著，强化平台期长，持续约5小时左右。对比注射临床磁共振对比剂dtpa-gd如图22b，于注射后30分钟内，小鼠腹主动脉强化，肝内肝动脉、门静脉部分分支浅淡显影，强化程度低，分支显示稀疏、管腔充盈欠佳，与周围组织对比度差，30分钟后各个时间点肝脏血管均无法清楚显示，对比剂代谢速度快，无平台期存在。分析原因为大分子磁共振对比剂的弛豫率大约3倍于dtpa-gd，同时其较大的分子量使其具有较长的血液循环时间。从实验结果来看磁共振对比剂mph-dota-gd相较于临床用dtpa-gd在正常小鼠肝脏磁共振血管成像中具有强化程度高，血管解剖细节显示清晰、易于辨别，强化持续时间长等较为显著的优势，对于判断血管病变，如管腔有无狭窄及狭窄程度、动脉瘤、动静脉瘘、动静脉畸形等，有着良好的应用前景。

2磁共振对比剂mph-dota-gd正常小鼠肾脏血管成像

正常小鼠注射磁共振对比剂mph-dota-gd后不同时间点肾脏血管成像结果如图23a所示，注射后10分钟，腹主动脉明显强化，双侧肾动脉起始部由腹主动脉发出，显示清晰、管腔充盈明显，肾动脉主干及肾内部分分支(以靠近肾门为主)显影，中度强化，30分钟肾动脉主干及肾内血管显著强化、分支增多，各节段及部分亚段动脉显示，走行迂曲清晰、管腔充盈明显、管壁锐利，与周围组织对比度佳，5小时观察仍可见双侧肾动脉主干及肾内部分分支动脉轻度强化显影，与周围组织对比度降低，12小时观察腹主动脉、双侧肾动脉及其分支无明显强化。应用mph-dota-gd观察肝脏血管强化于30分钟效果最为显著，强化平台期长，持续约5小时左右。对比注射临床磁共振对比剂dtpa-gd如图23b，于注射后10分钟观察，小鼠腹主动脉强化，双侧肾动脉起始部中度强化、管腔充盈欠佳、管壁欠锐利，肾动脉主干及肾内部分分支动脉浅淡显影，与周围组织对比度差，10分钟各个时间点肾脏血管均无强化显影，对比剂代谢速度快，无平台期存在。从实验结果来看磁共振对比剂mph-dota-gd相较于临床用dtpa-gd在正常小鼠肾脏磁共振血管成像中具有强化程度高，血管解剖细节显示清晰、易于辨别，强化持续时间长等较为显著的优势，对于判断血管病变，如肾动脉有无狭窄及狭窄程度、动脉瘤等，有着良好的应用前景。

3磁共振对比剂mph-dota-gd正常小鼠全腹部血管成像

正常小鼠注射磁共振对比剂mph-dota-gd后不同时间点全腹部血管成像结果如图24(a)所示，注射后10分钟，腹主动脉、腹腔干、脾动脉、双肾动脉、双侧卵巢动脉、髂动脉起始部明显强化，走行迂曲，管腔充盈明显、管壁锐利，末端分支显示清晰，与周围组织对比度佳，肝、肾组织内血管分支显影明显，形似树枝状分布，30分钟观察腹主动脉、腹腔干、脾动脉及双侧髂动脉起始部强化程度稍降低，双侧肾动脉及卵巢动脉持续强化，5小时观察，腹主动脉强化程度降低，上腹部腹主动脉部分管腔显示不全，腹腔干、肝动脉、脾动脉及双侧卵巢动脉部分浅淡显影或无明显强化，两侧肾动脉仍可见持续强化，12小时观察腹主动脉及其分支均无强化。应用mph-dota-gd观察肝脏血管强化于10-30分钟效果最为显著，强化平台期长，持续约2-5小时。对比注射临床磁共振对比剂dtpa-gd如图24(b)，于注射后10分钟，小鼠腹主动脉、双侧卵巢动脉及肾动脉起始部明显强化，管腔充盈欠佳、管壁欠锐利，与周围组织对比度较差，与腹主动脉分支未见确切强化显影；30分钟观察中上腹主动脉中度强化，中下腹主动脉纤细、部分管腔显示不全，余腹主动脉各分支均无强化，30分钟后各个时间点腹主动脉及其分支血管均无强化显影，对比剂代谢速度快，无平台期存在。从实验结果来看磁共振对比剂mph-dota-gd相较于临床用dtpa-gd在正常小鼠全腹部磁共振血管成像中具有强化程度高，血管解剖细节显示清晰、易于辨别，强化持续时间长等较为显著的优势，对于判断血管病变，如腹主动脉及其主干分支有无狭窄及狭窄程度、动脉瘤、动脉夹层等，有着良好的应用前景。

4磁共振对比剂mph-dota-gd正常小鼠头部血管成像

正常小鼠注射磁共振对比剂mph-dota-gd后不同时间点头部血管成像结果如图25所示，注射后10分钟观察，颅内双侧大脑前、中动脉及其分支显著强化，血管走行迂曲、管壁锐利、管腔充盈，分支数量显示增多，尤以脑边缘细小血管为甚，侧枝循环清晰可见，形似网状分布，亦可见上下静脉窦显影；颅外见双侧粗大迂曲的颈外静脉及其分支显影，管腔充盈，走行迂曲，与周围组织对比度佳。5小时观察，颅内、外血管强化程度降低，管腔充盈度下降，大血管所属分支数量显示减少；12小时观察颅内、外血管强化程度进一步降低，但仍可见颅内大脑中、前动脉及其少许分支轻度强化；颅外静脉亦仍有强化。应用mph-dota-gd观察颅内、外血管强化于5小时内效果最为显著，强化平台期长，强化血管与周围组织对比度佳。对比注射临床磁共振对比剂dtpa-gd，于注射后10分钟观察，颅内双侧大脑中、前动脉轻度强化，分支显示稀疏，血管浅淡显影，管腔充盈欠佳，脑边缘及侧枝循环未见血管影强化；颅外静脉亦未见强化。1小时观察，颅内血管强化程度明显降低，大血管分支数量显示减少，与周围组织对比度差，1小时后各个时间点头部血管均无明显强化，对比剂代谢速度快，无平台期存在。从实验结果来看磁共振对比剂mph-dota-gd相较于临床用dtpa-gd在正常小鼠头部磁共振血管成像中具有强化程度高，血管解剖细节显示清晰、易于辨别，强化持续时间长等较为显著的优势，对于判断血管病变，如动脉瘤、动静脉畸形等，有着良好的应用前景。

上述实验表明，本发明制得的磁共振对比剂mph-dota-gd以其高弛豫率、长效的血液循环时间在血管成像方面对比临床磁共振对比剂dtpa-gd有着十分明显优势，尤其是在动脉血管解剖形态、解剖细节以及动脉多级分支显示等方面显影效果显著，对于各种血管病变(如判断管腔有无狭窄及狭窄程度、动脉瘤、动静脉畸形、主动脉夹层等)能够做到长时间、高组织对比度的显影效果和观察，有效的解决了目前临床磁共振对比剂dtpa-gd成像窗口时间短和组织对比度差的瓶颈，有着良好的临床应用前景。

综上，本发明以n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺为原料，制得了一种gflg组织蛋白酶敏感的可降解含钆共聚物mph-dota-gd，该含钆共聚物mph-dota-gd作为一种新型的大分子磁共振对比剂，具有良好的生物安全性和血液相容性，具有较高的弛豫率，在体内代谢时间较长，能够提供更长的成像窗口期。同时，其在肿瘤部位，肝脏、肾脏和腹部血管中增强效果明显优于临床用小分子磁共振对比剂dota-gd，本发明制得的mph-dota-gd对于动脉血管解剖形态、解剖细节以及动脉多级分支显示等方面显影效果显著，作为磁共振对比剂和诊治一体大分子聚合物前药具有非常优良的应用前景。