一种外胚层发育不全相关的低频/罕见突变及其检测方法与流程

本发明属于医学的生物医药领域，涉及外胚层发育不全相关的低频/罕见突变及其检测方法。

背景技术：

外胚层发育不全(ectodermaldysplasia)，是一种低频罕见遗传病，可分为有汗性和少汗性外胚层发育不全，其中少汗性外胚层发育不全遗传方式包括常染色体显性、常染色体隐性、x连锁显性和隐性遗传，其中x连锁少汗性外胚层发育不全在人群中其发病率约1：100000。因为是x连锁的遗传方式，所以患病男性表现出绝大部分临床典型表现，而女性携带者则表现较轻。典型的临床表现为少汗或无汗；毛发稀疏；缺牙或牙齿形态异常等。其中缺牙或牙齿形态异常不仅会影响患者正常的咀嚼和进食，同时也会对患者的美观、容貌造成影响甚至会引起生理和心理问题。

发现外胚层发育不全相关的致病基因及突变，对先天性缺牙的诊断筛查具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种外胚层发育不全的低频/罕见突变，同时将一个外胚层发育不全家系作为外胚层发育不全的研究模型，结合全基因组外显子测序及sanger测序检测方法，可以为外胚层发育不全致病机理的解析、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。

本发明提供了一种外胚层发育不全相关的低频/罕见突变，突变基因为ikbkg，其突变后序列如seqidno.4所示。

本发明提供的一种外胚层发育不全相关的ikbkg突变基因，与野生型ikbkg基因相比，ikbkg基因序列的第二外显子中第37位碱基由a突变为t。

本发明中所涉及ikbkg基因突变经检测和验证，符合x连锁隐性遗传规律，为外胚层发育不全致病基因，ikbkg:exon2:c.a37t，患者为纯合突变，表型严重，携带者为杂合突变，表型较轻。其中，野生型ikbkg基因在ncbi数据库中的转录组编号为nm_001099857.3，该基因中第二外显子的第37位碱基由a突变为t，其他部分与野生型相同。由于突变发生在外显子区，因此本发明提供的seqidno.5是ikbkg野生型的基因序列，供参比。

本发明还提供一种突变的ikbkg蛋白，在该野生型蛋白np_001093327.1的第13位氨基酸由蛋氨酸突变为亮氨酸。即所述蛋白是在野生型ikbkg蛋白的第13位氨基酸由蛋氨酸突变为亮氨酸，其他部分与野生型相同。

野生型ikbkg蛋白在ncbi数据库中的编号为：np_001093327.1。

本发明还提供所述的ikbkg突变基因在外胚层发育不全机理研究、筛查、辅助诊断和/或治疗中的应用。

本发明还提供本发明所述的ikbkg突变基因的检测方法，包括如下主要步骤：

(1)提取基因组dna；

(2)测序验证：对ikbkg突变基因合成引物，进行基因型检测，ikbkg基因序列的第二外显子的第37位碱基由a突变为t，为外胚层发育不全的指示。

本发明所述的检测方法中，步骤(1)提取基因组dna可以为本领域常用的生物样品，例如血液。

在一种实施例中，本发明所述的检测方法中，步骤(2)所述引物序列，正向引物序列如seqidno：1或seqidno：3所示，反向引物如seqidno：2所示。

本发明还提供一种用于检测所述ikbkg突变基因的引物，正向引物序列如seqidno：1或seqidno：3所示，反向引物如seqidno：2所示。

本发明还提供了所述引物在制备用于筛选ikbkg突变基因的试剂中的应用。

一种筛选ikbkg突变基因的试剂盒，包括本发明所述的引物，所述试剂盒还可以进一步包含dna提取试剂。

本发明基于遗传家系，结合全基因组外显子测序及sanger测序检测方法，包括如下主要步骤：

(1)收集家系，并对家系成员进行规范的口腔检查，检查发现父亲无缺牙，母亲12、22缺失；两名男性子代均仅存11、21，且牙齿形态呈锥形牙，同时伴有毛发稀疏。签署知情同意，并收集家系成员外周血；

(2)辅助检查：全景片：父亲无缺牙，母亲12、22先天缺失，两名男性子代均仅存11、21；

(3)基因检测：抽提外周血dna，通过全基因组外显子测序筛选出致病基因；

(4)筛选候选致病基因：根据1000gemomesproject、esp6500siv2-all、genomad-all和genomad-eas及sift、polyphen-2、mutationtaster等软件进行生物信息学分析，并遵循x连锁隐性遗传模式筛选候选致病基因。

sanger测序验证：在所有家系成员中进行验证，明确其是否携带该基因且同时符合x连锁隐性遗传规律；同时在100例无先天缺牙家族史的正常人中对突变位点进行sanger测序验证。

在本发明的一种实施例中，还提供一种更为具体的外胚层发育不全的致病基因检测方法，主要步骤如下：

(1)对外胚层发育不全的患者进行详细家族史调查以及规范的口腔检查，签署知情同意，采集家系成员外周血，并抽提dna；

(2)利用序列捕获技术将全基因组外显子区域dna捕捉并富集后再illumina平台进行高通量测序；

(3)对测序结果进行生物信息学分析，按照x连锁隐性遗传模式筛选出候选突变基因；

(4)通过对患者家系相关成员样本进行sanger测序，pcr正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，并且遵循x连锁隐性遗传模式进行验证。

本发明的优点是：外胚层发育不全是临床少见的综合征型先天缺牙，通过对这一遗传家系患者的基因检测我们发现了ikbkg:exon2:c.a37t这个突变位点对牙齿发育的影响。因此，这一检测方法可以用于与外胚层发育不全致病基因相关的研究，对于该病的筛查、检测和治疗具有潜在的重要价值。

附图说明

图1是一个外胚层发育不全的家系图谱；

图2是其中ii2的全景片；

图3是筛选致病基因流程图；

图4是sanger测序验证结果，野生型为ⅰ1和100例健康对照基因分型结果，突变型为ⅰ2、ⅱ1和ⅱ2基因分型结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

1.样本的选择(均为中国汉族)

发明人从南京医科大学附属口腔医院收集了诊断明确的两名外胚层发育不全患者及其直系亲属(图1)和无先天缺牙家族史的健康对照100例(50例女性和50例男性)。该遗传疾病的诊治工作过程中，患者依从性较好，具有主观治疗的意愿，所有研究对象均签署知情同意书(18岁以下者，由其监护人代签)，经过医疗机构的伦理审批，研究过程中涉及的检测及实验方法尽可能不影响患者身心健康，完成相应流行病学调查，并提供1-3ml外周血标本。

本实施例所涉及的图1所示的家系是一个x连锁隐性遗传的外胚层发育不全家系，对其中的四人进行全基因组外显子测序，通过生物信息学分析，x连锁隐性遗传模式筛选出致病基因，并进行sanger测序验证以及基因注释等手段，以发现与外胚层发育不全相关的低频/罕见突变。

该家系共有四人，其中父亲为正常人，母亲12、22缺失。两名男性子代均仅存11、21，且牙齿形态呈锥形牙，同时伴有毛发稀疏，确诊为外胚层发育不全(图2)。这种遗传模式符合孟德尔x连锁隐性遗传规律。全外显子测序发现此家系患者均携带相同的致病基因。该疾病暂时没有证据表明会影响患者寿命，所患外胚层发育不全的患者需要进行口腔综合治疗。

2.基因组dna提取

采用qiagen试剂盒提取每个研究对象的基因组dna，经异丙醇沉淀后得到基因组dna，dna沉淀经ae溶解测定浓度后，稀释分装存入-20℃冰箱保存备用。

具体步骤：

(1)400μl抗凝血中加入500μl细胞裂解液cl，颠倒混匀5次；

(2)12,000rpm(13,400×g)离心1min，弃上清；

(3)重复上述1,2步骤，充分裂解细胞；

(4)加入200μl缓冲液fg与proteasek混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块；

(5)65℃水浴15min，期间颠倒混匀数次；

(6)加入200μl异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组dna；

(7)12,000rpm(13,400×g)离心5min，弃上清；

(8)加入200μl70％乙醇，涡旋震荡5s，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃上清；

(9)将离心管倒置在干净的吸水纸上至少5min，确保沉淀在管中；

(10)空气干燥dna沉淀直至所有液体挥发干净；

(11)加入ae50μl，4℃冰箱保存10天后，使用紫外分光计检测dna的浓度和纯度，依据所测浓度稀释分装，分装完成后将三种液体(原液即母液、次级母液、使用液)置于-20℃冰箱中保存备用。

3.本研究对四名家系成员进行全基因组外显子测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，步骤包括对dna样品进行检测；建库捕获；库检；上机测序。

4.生物信息分析流程：如图3所示，包括测序数据质量评估；变异检测；变异筛选及与疾病相关性的预测。

5.根据条件筛选致病基因：

(1)家系中所有人进行全基因组外显子测序后，共检出219562个snp变异位点和34481个indel变异位点，通过1000genomesproject，esp6500siv2-all，genomad-allandgnomad-eas四个数据库中maf＜0.01的条件过滤后，得到7935个snp变异位点和5546个indel变异位点；

(2)保留处于编码区和剪接位点区的非同义突变位点，共有951个snp变异位点和233个indel变异位点；

(3)sift,polyphen-2,mutationtaster和cadd四个软件中至少有两个预测为有害，过滤后得到595个snp变异位点和179个indel变异位点；

(4)基于x连锁隐性遗传模式筛选后仅剩ikbkg:exon2:c.a37t(chrx：153780254)一个突变位点满足条件；

(5)家系中患者进行全基因组外显子测序后，共检出29718个snp/indel变异位点，根据acmg有害性进行分类，其中可能致病性位点11个，致病性位点5个，其中位于x染色体上的致病/可能致病的位点仅ikbkg:exon2:c.a37t(chrx：153780254)。

不同筛选条件都指向ikbkg:exon2:c.a37t(chrx：153780254)这个突变位点可能导致外胚层发育不全这个疾病的发生发展。

6.sanger验证ikbkg:exon2:c.a37t致病性

家系中成员及100个正常人(50例女性，50例男性)中是否携带该基因，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成：

(1)dna提取及质检

(2)利用软件primerpremier5进行引物设计(正向引物序列如seqidno:1或seqidno:3，反向引物序列如seqidno:2)用于pcr；

(3)pcr扩增后，将pcr产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，目的pcr条带切胶回收；

(4)测序产物进行纯化，上机电泳，用sequenceanalysis分析结果，基因分型结果，如图4示，其中家系中两名确诊为外胚层发育不全的男性患者为纯合突变，其母亲为杂合突变，其未患病的父亲及100个正常人均显示无突变。由此可以证明该家系符合x连锁隐性遗传模式，ikbkg:exon2:c.a37t为该外胚层发育不全家系的相关致病位点，该家系中女性成员为携带者，表型较轻，而患病男性为纯合突变且表型明显。且正常人群未携带有此突变，可以从反方面验证本发明提供的ikbkg:exon2:c.a37t这个致病位点，及本发明中提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性，因此，本发明所述的基因突变位点可以用于外胚层发育不全机理研究、筛查、辅助诊断和/或治疗。

序列表

<110>南京医科大学附属口腔医院

<120>一种外胚层发育不全相关的低频/罕见突变及其检测方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctgctaccccttagactgaaaac23

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tttcctcacctcggagctct20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cataggctttttctgctgggt21

<210>4

<211>1973

<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>4

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<212>dna

<213>人类(homosapiens)

<400>5

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