用于大肠菌群快速显示检测的培养基、制备方法及应用与流程

本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及一种用于大肠菌群快速显示检测的培养基、制备方法及应用。

背景技术：

目前，最接近的现有技术：大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠菌群主要包括肠杆菌科中大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，不形成芽孢；在35～37℃条件下，48小时内能发酵乳糖声酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以大肠埃希氏菌属为主，大肠埃希氏菌属俗称为典型大肠杆菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7～30天后在环境中的变异。所以食品中检出大肠菌群表示食品受动人或温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。

用于检测大肠菌群的方法有很多，主要依靠常规的细菌学培养方法、免疫学方法、核酸探针技术等。细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，一般需4到7天，操作繁琐、费时耗力并且敏感性低、特异性差，且无法检测受损菌及死菌；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低；核酸探针检测技术的最大优点是特异性强，但探针检测技术中也存在一定的问题，如灵敏度不够高；检测一种菌就需制备一种探针。

纸片法也是大肠菌群快速检测常用的方法。纸片法是以大肠菌群细菌生长发育时分解乳糖产酸，同时产生脱氢酶脱氢，氢与无色氯化三苯四氮唑(ttc)作用形成不溶性的红色化合物(三苯基甲腙，ttf)使菌落(菌苔)变红的原理，将一定量的乳糖、指示剂(ttc、酸碱指示剂)、蛋白胨等吸附在特定面积的无菌滤纸上。大肠菌群通过上述2种指示剂显示出发酵乳糖产酸，纸片变黄和形成红色斑点(红晕)的固有特性。以此特性作为阳性结果的唯一判定标准。但是在含有辣椒的食品、调味品等样品的检测中，因其含有的红色辣椒微粒与显红色的大肠菌群菌落极其相似，使判别出现假阳性，严重干扰计数结果。

因此，本领域需要一种高效、快速、低廉、准确、操作简便的方法，对大肠菌群进行检测的方法。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，一般需4到7天，操作繁琐、费时耗力并且敏感性低、特异性差，且无法检测受损菌及死菌。

(2)免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低。

(3)核酸探针检测技术灵敏度不够高；检测一种菌就需制备一种探针。

(4)纸片法可以实现大肠菌群的快速检测，但无法排除含辣椒食品、调味品等样品中红色辣椒微粒对结果判定的影响。

因此，本领域急需一种能够快速、准确、操作简便的大肠菌群测定方法，尤其是可应用于含辣椒食品、调味品等样品中可排除红色辣椒微粒干扰的大肠菌群检测方法。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于大肠菌群快速显示检测的培养基、制备方法及应用。

本发明是这样实现的，一种用于大肠菌群快速显示检测的培养基，所述用于大肠菌群快速显示检测的培养基由酵母粉5～10g，胰化蛋白胨5～15g，乳糖5～15g，氯化钠5～10g，溴甲酚紫0.01～0.04g，噻唑蓝0.0001～0.1g组成，并用水补足至1000ml。

注：噻唑蓝(mtt)全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide，thiazolylbluetetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于大肠菌群快速显示检测的培养基的制备方法，所述用于大肠菌群快速显示检测的培养基的制备方法包括：

(1)液体培养基的配制：按配方分别称取酵母粉、胰化蛋白胨、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫和噻唑蓝，定容至1000ml，配制成培养基，灭菌，备用。

(2)固体培养基的配制：按配方分别称取酵母粉、胰化蛋白胨、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫、噻唑蓝和琼脂，定容至1000ml，配制成培养基，灭菌，倒平板，备用。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于大肠菌群快速显示检测的培养基的大肠菌群检测试剂盒，所述大肠菌群检测试剂盒包含所述肠道菌群快速培养并显色的培养基。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于大肠菌群快速显示检测的培养基的大肠菌群检测纸片，所述大肠菌群检测纸片包含所述肠道菌群快速培养并显色的培养基。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的用于大肠菌群快速显示检测的培养基的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的大肠菌群检测试剂盒的大肠菌群检测纸片的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的大肠菌群检测纸片的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种所述的用于大肠菌群快速显示检测的培养基在用于检测大肠菌群的诊断剂制备中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的大肠菌群检测试剂盒在用于检测大肠菌群的诊断剂制备中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的大肠菌群检测纸片在用于检测大肠菌群的诊断剂制备中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法在医学微生物标本、药品、医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品、食品、调味品、化妆品和工业制品检测方面的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的用于检测大肠菌群的诊断剂在医学微生物标本、药品、医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品、食品、调味品、化妆品和工业制品检测方面的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法选择性高、检测周期短、成本低、可操作性强、操作简单、耗时少并且敏感性高，适用于快速、简便、高效地进行大肠菌群的分离与鉴别。本发明提供的用于大肠菌群快速显示检测的培养基具有较好的特异性，大肠菌群在培养基上具有较快的生长速度，并且能够通过颜色快速的鉴定，从而可以实现特异性的分别鉴定大肠菌群。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的培养基的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于大肠菌群快速显示检测的检测方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的培养基由酵母粉5～10g，胰化蛋白胨5～15g，乳糖5～15g，氯化钠5～10g，溴甲酚紫0.01～0.04g，噻唑蓝0.0001～0.1g组成，并用水补足至1000ml。

如图1所示，本发明实施例提供的应用用于大肠菌群快速显示检测的培养基的制备方法包括：

(1)液体培养基的配制：按配方分别称取酵母粉、胰化蛋白胨、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫和噻唑蓝，定容至1000ml，配制成培养基，灭菌，备用。

(2)固体培养基的配制：按配方分别称取酵母粉、胰化蛋白胨、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫、噻唑蓝和琼脂，定容至1000ml，配制成培养基，灭菌，倒平板，备用。

本发明实施例提供大肠菌群检测试剂盒包含所述肠道菌群快速培养并显色的培养基。

本发明实施例提供的大肠菌群检测纸片包含所述肠道菌群快速培养并显色的培养基。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法应用用于大肠菌群快速显示检测的培养基进行实现。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法应用大肠菌群检测试剂盒的大肠菌群检测纸片进行实现。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法应用大肠菌群检测试剂盒进行实现。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的培养基可应用于检测大肠菌群的诊断剂的制备之中。

本发明实施例提供的大肠菌群检测试剂盒可应用于检测大肠菌群的诊断剂的制备之中。

本发明实施例提供的大肠菌群检测纸片可应用于检测大肠菌群的诊断剂的制备之中。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法可应用于医学微生物标本、药品、医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品、食品、调味品、化妆品和工业制品方面的检测。

本发明实施例提供的用于检测大肠菌群的诊断剂可应用于医学微生物标本、药品、医疗器械卫生检验样品、公共卫生监测样品、食品、调味品、化妆品和工业制品方面的检测。

本发明实施例提供的用于大肠菌群快速显示检测的检测方法可应用于药品、食品、化妆品和工业品方面的检测。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1：培养基配制

液体培养基的配制：按酵母粉6g，胰化蛋白胨12g，乳糖8g，氯化钠9g，溴甲酚紫0.01g，噻唑蓝0.003g的配方称取各组分，定容至1000ml，配制成培养基，灭菌，备用。

固体培养基的配制：按酵母粉6g，胰化蛋白胨12g，乳糖8g，氯化钠9g，溴甲酚紫0.01g，噻唑蓝0.003g，琼脂18g的配方称取各组分，定容至1000ml，配制成培养基，灭菌，倒平板，备用。

实施例2：本发明所述的大肠菌群显色培养基与现有技术纸片法对郫县豆瓣检验的比较试验

1.本发明的显色培养基平板制备：按照实施例1的方法制备。

2.对照采用3m^tmpetrifilm^tm6412大肠菌群快速测试片。

3.样品的处理

称取25g郫县豆瓣样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的样品匀液。

样品匀液的ph应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/lnaoh或1mol/lhcl调节。

用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

4.接种培养

选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个含有本发明培养基的无菌平皿及对照纸片中，每皿(每片)1ml。同时取1ml生理盐水作空白对照。置于36℃±1℃培养18h～24h。

5.结果分析

实验结果如表1所示。

表1实验结果

由此可以看出，本发明的培养基具有特异性的鉴定大肠菌群的能力，大肠菌群在该培养基上具有较快的生长速度，并且能够通过颜色快速的鉴定。

实施例3：本发明所述的大肠菌群显色培养基与现有技术纸片法对郫县豆瓣的检验准确性试验

将分别挑取实施例2培养出的单菌落，分别移种于煌绿乳糖胆盐(bglb)肉汤管内，36℃±1℃培养24h～48h，观察产气情况。凡bglb肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

鉴定结果如下：

本发明培养基：挑取50个蓝紫色菌落，50个结果都是阳性，准确率100％；

市售快速检测纸片：挑取50个红色菌落，45个为阳性，准确率90％；

由此说明，本发明的培养基具有较好的特异性，可以实现特异性的分别鉴定大肠菌群，尤其是调味品中的大肠菌群。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。