基于菌丝特征和生化指标快速判断杏鲍菇菌种退化的方法及其应用与流程

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种基于菌丝特征和生化指标快速判断杏鲍菇菌种退化的方法及其应用。

背景技术：

杏鲍菇（pleurotuseryngii）分类学定位属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科。又名刺芹侧耳，含有丰富的蛋白质、维生素、碳水化合物等营养物质，以及锌、镁、钙、铜等矿质元素。杏鲍菇子实体肉质肥美厚实、质地脆嫩、味道清爽，是一种能够增强人体免疫功能，具有降血脂、美容、滋润肠道、抗癌等作用，集食、药、疗三大功能于一体的深受消费者喜爱的珍稀食用菌品种。目前，杏鲍菇主要来源于工厂化栽培，而影响工厂化栽培的关键问题就是菌种退化。菌种退化是指食用菌菌种群体经济性状发生劣变的现象，而导致产量、品质、抗性等方面发生了背离人类需要的变化。真菌在人工培养基上继代培养过程中会出现菌株退化现象，在外部形态上表现为菌丝细弱，气生菌丝稀疏，菌丝生长缓慢，容易被杂菌污染；生产上表现为出菇期推迟，成菇数目减少，出菇不整齐，产量下降等。从而造成巨大的人力、物力、财力的损失。大多数杏鲍菇生产工厂仍然采用的是子实体分离加菌种继代来保藏和使用菌种，但工厂对于杏鲍菇菌种是否退化没有一套快速判断的指标，运用较多的还是通过出菇产量进行判断，这种方法既耗费时间，也会使工厂的经济效益遭受重大影响。因此，寻找一套快速判断菌种退化的指标势在必行。

技术实现要素：

目前对于杏鲍菇的研究主要集中于栽培技术、育种技术、活性物质分析方面，而对于杏鲍菇工厂生产中菌种退化问题的相关研究并没有实质性的进展；并且工厂对于菌种退化仍然停留在通过产量的变化来进行判断，费时费力。因此，本实验通过对退化菌株进行菌丝特征以及生理生化指标的研究，旨在提供一种快速判断杏鲍菇菌种退化的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）测定菌丝生长速度、菌丝直径、菌丝分支量、菌株菌落形态：将杏鲍菇菌株接种至pda培养基上，于25℃培养7d，进行菌种活化；将活化后的不同代数杏鲍菇菌株接种至pda培养基上进行培养，与菌株第一代原种相比，菌丝的平均生长速度下降≥22%，菌丝直径下降≥16%，菌丝分支减少，菌丝生长停滞，菌落不规则隆起，菌丝稀薄边缘呈极不规则圆形，白色，棉絮状，判定为退化；

（2）测定纤维素酶分泌能力：菌落直径、变色圈直径以及酶指数分别在24.50～32.50mm、26.00～42.00mm、1.10～1.30ei，判定为退化；

（3）测定淀粉酶分泌能力：菌落直径、变色圈直径以及酶指数分别在52.00～70.00mm、13.50～26.00mm、0.25～0.37ei，判定为退化；

（4）锰过氧化物酶分泌能力：菌落直径、变色圈直径以及酶指数分别在52.00～71.00mm、13.50～26.00mm、0.25～0.37ei区间范围或者小于以上范围时，判定为退化；

（5）lbl脱色能力：脱色率在48.00%～55.00%区间范围内或者低于此范围时，判定为退化；

（6）分解栽培料的速度：杏鲍菇菌株菌丝在栽培料中的平均生长速度下降百分数≥7.5%，判定为退化。

所述菌丝生长速度的测定方法为：菌丝萌发后每两天测定其生长速度，直至菌丝长满平板；菌丝生长的平均速度mm/d=长满平板的菌丝长度/菌丝长满平板的天数。

所述菌丝直径、菌丝分支量、菌株菌落形态的观察方法为：将活化后的各代杏鲍菇菌株接种至pda培养基上，于25℃培养，观察培养过程中菌落形态变化情况，直至菌丝长满平板，并挑取各代活化后杏鲍菇菌种pda培养基上相同位置的培养基一小块，放置于载玻片上，制片后于40倍镜下观察菌丝形态，并用image-proplus软件测定各代菌丝直径。

所述纤维素酶分泌能力、淀粉酶分泌能力、锰过氧化物酶分泌能力的测定方法为：将活化后的不同代数杏鲍菇菌株用孔径1cm的打孔器分别接种至刚果红-羧甲基纤维素钠培养基、pda可溶性淀粉培养基、pda-愈创木酚培养基中，于25℃条件下培养，第7d测定菌落直径以及变色圈直径，计算酶指数ei；ei=变色圈直径/菌落直径，结果以5个重复实验的平均值±标准差来表示。

所述刚果红-羧甲基纤维素钠培养基配方为：羧甲基纤维素钠2.0g/l，mgso4·7h2o1.88g/l，kh2po40.5g/l，蛋白胨2.0g/l，刚果红0.25g/l，琼脂粉15g/l；

所述pda可溶性淀粉培养基配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，可溶性淀粉2g/l；

所述pda-愈创木酚培养基配方为：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，mgso4·7h2o1g/l，kh2po41g/l，维生素ｂ10.02ｇ/l，琼脂15g/l，愈创木酚0.1g/l。

所述lbl脱色能力的测定方法为：将保藏的各代杏鲍菇菌株接种至pda培养基上进行活化，从活化后的不同代数杏鲍菇菌株的pda培养基中移取5个直径为1cm的菌丝块于lbl液体培养基中，于25℃条件下进行液体培养，每代5个生物学重复；液体培养3d后取培养液10ml，8000r/min、4℃离心15min，移取上清液于615nm处测定吸光值，脱色率dr=（1－(a615nmstrain/a615nmblank))×100%。

所述分解栽培料的速度的测定方法为：将活化的不同代数的杏鲍菇菌株的pda培养基中移取1个直径为1cm的菌丝块于装有40g栽培料的大试管中，每代5个生物学重复，于25℃条件下培养30d，每隔5天测定生长速度，并观察菌丝分解栽培料情况；所述栽培料配方按质量分数计为：棉籽壳14%、木屑64%、麸皮20%、石膏1%、糖1%。

进一步地，将上述方法应用于快速判断杏鲍菇菌种衰退中。

本发明的优点在于：本发明通过杏鲍菇菌种连续传代培养，分析测定不同代数杏鲍菇菌种酶活性、菌丝特征，探讨杏鲍菇连续传代过程中的菌种退化情况，以明确杏鲍菇菌种可使用种代数及菌种出现衰退的菌丝特征及其酶活表现，为杏鲍菇工厂化栽培时菌种质量提供快速鉴定方法。利用菌丝特点及其平板显色法定性测定酶活适合于杏鲍菇菌种的快速检测，耗时短、成本低、结果稳定可靠，可用作工厂化菌种质量判断。

附图说明

图1为40倍显微镜视野下不同代数杏鲍菇菌丝显微结构；

图2为不同代数杏鲍菇菌株菌落局变形态；

图3为不同代数杏鲍菇菌株菌丝分解料能力比较。

具体实施方式

1、供试菌株：源自杏鲍菇子实体分离并通过继代培养获得目的菌种，并将通过继代培养的单数代共8代菌种保存于福建农林大学生命科学学院，此杏鲍菇子实体来自福建漳州绿生源生物科技有限公司。

2、培养基

（1）pda固体加富培养基（1l）：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母粉2g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁.7h2o1.5g，维生素b10.1g，琼脂20g。

（2）标准pda固体培养基（1l）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。

（3）lbl培养基（1l）：马铃薯200g，乳糖20g，nh4no32g，mgso4·7h2o0.5g，kh2po41.5g，btb0.06g，ph7.0。

（4）刚果红－羧甲基纤维素钠培养基（1l）：羧甲基纤维素钠2.0g，mgso4·7h2o1.88g，kh2po40.5g，蛋白胨2.0g，刚果红0.25g，琼脂粉15g。

（5）pda可溶性淀粉培养基（1l）：马铃薯200g，葡萄糖10g，可溶性淀粉2g。

（6）pda-单宁酸培养基：马铃薯200g，葡萄糖10g，mgso4·7h2o1g，kh2po41g，维生素ｂ10.02ｇ，琼脂15g，单宁酸0.4mmol。

（7）pda-愈创木酚培养基：马铃薯200g，葡萄糖10g，mgso4·7h2o1g，kh2po41g，维生素ｂ10.02ｇ，琼脂15g，愈创木酚0.1g。

（8）栽培料配方：棉籽壳14%、木屑64%、麸皮20%、石膏1%、糖1%。

以上培养基采用121℃，30min灭菌，栽培料采用121℃，4h灭菌，待冷却后备用。

3、实验仪器

恒温培养箱，超净工作台，光学显微镜，分光光度计。

4、实验方法

（1）杏鲍菇菌丝生长速度测定：将保藏的各代杏鲍菇菌株接种至pda培养基上，于25℃培养一周左右，进行菌种活化。将活化后的不同代数杏鲍菇菌株接种至pda培养基上，接种面积为5mm×5mm，每个处理设置10个重复，菌丝萌发后每两天测定其生长速度，直至菌丝长满平板。

菌丝生长的平均速度（mm/d）=长满平板的菌丝长度（mm）/菌丝长满平板的天数（d）

（2）杏鲍菇菌丝直径的测定以及菌落形态的观察：将活化后的各代杏鲍菇菌株接种至pda培养基上，于25℃培养，观察培养过程中菌落形态变化情况，直至菌丝长满平板，并挑取各代活化后杏鲍菇菌种pda培养基上相同位置的培养基一小块，放置于载玻片上，制片后于40倍镜下观察菌丝形态，并用image-proplus软件测定各代菌丝直径。

（3）平板变色圈实验：将活化后的不同代数杏鲍菇菌株用打孔器（孔径1cm）接种至相应的测试培养基中央（刚果红-羧甲基纤维素钠培养基（测定纤维素酶体系）、pda可溶性淀粉培养基（测定淀粉酶）、pda-愈创木酚培养基（测定锰过氧化物酶）），于25℃条件下培养，第7d测定菌落直径以及变色圈直径，淀粉酶指数则先测量菌落直径，然后去除菌落表面的菌丝并用卢戈氏碘液法染色，最后测量未被染成蓝色区域的直径。计算酶指数（enzymaticindex,ei）ei=变色圈直径/菌落直径，结果以5个重复实验的平均值±标准差来表示。

（4）lbl培养基脱色实验：将保藏的各代杏鲍菇菌株接种至pda培养基上进行活化，从活化后的不同代数杏鲍菇菌株的pda培养基中移取5个直径为1cm的菌丝块于lbl液体培养基中，于25℃条件下进行液体培养，每代5个生物学重复。液体培养3d后取培养液10ml，8000r/min、4℃离心15min，移取上清液于615nm处测定吸光值，并用脱色率公式计算脱色率。

dr=（1－(a615nmstrain/a615nmblank))×100%。

式中，dr表示脱色率，a615nmstrain为接种菌株培养后的吸光度值，a615nmblank为空白培养液的吸光度值。dr值越高，表示菌丝活力越高，菌种质量越高。

（5）杏鲍菇菌丝分解栽培料实验：将保藏的各代杏鲍菇菌株接种至pda培养基上进行活化，从活化后的不同代数杏鲍菇菌株的pda培养基中移取1个直径为1cm的菌丝块于装有40g栽培料的大试管中，每代5个生物学重复，于25℃条件下培养30d，每隔5天测定生长速度，并观察菌丝分解栽培料情况。

5、结果与分析

（1）杏鲍菇不同代数菌株生长速度的变化

由表1可以看出，杏鲍菇菌株菌丝生长速度在g7时出现显著下降，平均生长速度为3.00±0.02mm/d，相较于g1生长速度下降了21.88%。故当杏鲍菇菌丝的平均生长速度下降百分数大于22%时，即表明菌株已经发生一定程度的退化，不再适合作为工厂栽培生产用种。

表1不同代数杏鲍菇菌株菌丝生长速度

（2）杏鲍菇不同代数菌株菌丝直径的变化

由表2可以看出，g7的菌丝直径为2.93±0.20µm，出现明显降低，下降百分数达到16.76%，并且随着继代的进行，菌丝直径持续走低，g15的菌丝直径仅为2.56±0.23µm，下降百分数达到27.27%。故当杏鲍菇菌丝直径下降百分数大于16%时，也可表明菌株已经发生一定程度的退化，不再适合作为工厂栽培生产用种。

表2不同代数杏鲍菇菌株菌丝直径

（3）杏鲍菇不同代数菌株菌丝显微结构的变化

由图1可知，随着传代次数的增加，菌丝分支逐渐减少，从g7开始显微镜视野下的菌丝量明显减少，并且菌丝分支出现明显下降。故当40倍显微镜视野下菌丝量以及菌丝分支大量减少时，可表明菌株已经发生一定程度的退化，不再适合作为工厂栽培生产用种。

（4）杏鲍菇不同代数菌株菌落形态的变化

由图2可以看出，从g7开始出现菌落局变，菌丝在培养基上长至一定程度但没长满平板时会出现停滞现象，并且后续长出的菌丝十分虚弱，同时菌落结构较致密，内部略微内凹，菌丝较旺盛，边缘呈较规则圆形，浓白，绒毡状，并且这种现象随着继代的进行，变异程度逐步加深；到g15时菌落平坦，表面出现不规则隆起，菌丝稀薄，边缘呈极不规则圆形，白色，棉絮状，菌丝停滞现象更加明显。故当杏鲍菇菌丝在培养基上培养时出现此类情况，可表明菌株已经发生一定程度的退化，不再适合作为工厂栽培生产用种。

（5）不同代数杏鲍菇菌株平板变色圈实验结果

由表3、表4和表5可以看出，菌丝培养7天后，三种变色圈实验结果均表明g7在相应的菌落直径、变色圈直径以及酶活力指数上均表现出明显的下降，并且随着继代的进行，这种下降的趋势仍在继续。因此，杏鲍菇菌株菌丝在刚果红-羧甲基纤维素钠培养基上的菌落直径、变色圈直径以及酶指数分别在24.50～32.50mm、26.00～42.00mm、1.10～1.30ei；在pda可溶性淀粉培养基上的菌落直径、变色圈直径以及酶指数分别在52.00～70.00mm、13.50～26.00mm、0.25～0.37ei；在pda-愈创木酚培养基上的菌落直径、变色圈直径以及酶指数分别在52.00～71.00mm、13.50～26.00mm、0.25～0.37ei区间范围或者小于以上范围时，均可以表明菌株已经有一定程度的退化。

表3刚果红-羧甲基纤维素钠实验结果

表4淀粉-卢戈氏碘液试验结果

表5pda-愈创木酚实验结果

（6）不同代数杏鲍菇菌株lbl脱色实验结果

由表6可以看出，从g7开始脱色率开始有明显的变化，而脱色率越低，表明菌株活性越弱，g7的脱色率为54.29±0.52%。故当杏鲍菇菌株菌丝lbl脱色率在48.00%～55.00%区间范围内或者低于此范围时，表明菌种活性已经降低，菌种已然出现退化。

表6不同代数杏鲍菇菌株lbl脱色实验

（7）不同代数杏鲍菇菌株分解栽培料实验结果

由表7和图3可以看出，从g7开始菌丝分解栽培料的速度和能力开始出现明显的减弱现象，菌丝在栽培料中的生长速度为3.24±0.06mm/d，下降百分数为7.95%。故杏鲍菇菌株菌丝在栽培料中的平均生长速度下降百分数大于7.5%时，表征菌株在生产水平上出现了一定的退化。

表7不同代数杏鲍菇菌株栽培料中菌丝生长速度

6、总结

通过对各代菌株的菌丝特征以及生理生化指标的探究，结果表明不同代数菌株在菌丝生长速度、菌丝直径、菌丝显微结构、菌落形态、变色圈试验、lbl脱色试验、菌丝分解栽培料速度等七个方面均存在着一定的差异，并且都是从g7开始出现显著性的变化，表明这些指标均可以用作表征菌种退化的指标。通过本研究所确定的判断杏鲍菇菌种退化的各类指标，能够快速判断菌种是否退化，能够为工厂在快速判断菌种方面提供重要的参考。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。