一种harpinF蛋白及其在诱导欧美杨抗细菌性溃疡病害中的应用的制作方法

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种harpinf蛋白及其在诱导欧美杨抗细菌性溃疡病害中的应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

杨树是在我国广泛分布的树种之一，其在营造生态防护林或是用材林方面均为主要的造林树种。欧美杨又称“加拿大杨，”是我国第四代杨树品种，由意大利白杨与美国黑杨杂交而成，是一种用途广泛，生长迅速，具有很高生态价值和经济价值的优良树种。近年来，华北地区大面积营造欧美杨，有效的改善这些区域的生态环境，对缓解木材供需矛盾起到了显著作用。但由于长时间、大面积的纯种种植，导致病虫害严重、生态环境破坏、生物多样性下降，造成严重的经济损失。欧美杨细菌性溃疡病(lonsdaleaquercinasubsp.populi)于2006年首次在河南濮阳的多块欧美杨林地发现，随后在山东菏泽、山东兖州和天津等多个地市均有发现，成为危害欧美杨生长的重要病害。该病主要发生在树木的枝干部位，在2至20年生的幼苗、幼林和成林均可发病，发病树木在枝干部出现肿胀溃疡，树皮腐烂，导致树势衰弱，树干畸形，木材的利用价值降低，溃烂严重时可造成树干因风自发病部位折断，导致树木全株死亡，造成重大经济损失。欧美杨细菌性溃疡病病原侵入主要是通过刺伤口、裂口侵入植物体危害植物的枝干部，发病初期在树干皮层产生裂口，流出乳白色至橘黄色的粘液。病情随时间的推移和温度的升高发展至中期，危害部位由表皮扩展至韧皮部，粘液变为褐色，在伤口和孔口处产生溃疡斑，之后皮层腐烂，在木质部产生乳白色浆状物，并逐渐变为黄褐色。粘液随树干流至地面，发病部位腐烂发酵，散发出腐臭的气味，吸引多种附生昆虫在腐烂部位繁殖，加速病害在林间的传播。

目前针对欧美杨细菌性溃疡病的防治，主要有两种方法，一种方法是通过化学防治，即通过施用化学农药进行防治，在病害爆发时可以有效地控制病害的扩散，同时化学农药的广谱性可以针对多种病害，是防治病害的主要方法；但是长期化学防治产生了许多弊端，农药高残留危害人、畜健康、长期施药导致病菌的抗药性不断增强、对生态环境造成不可逆的损伤等等；另一种是通过施用拮抗菌的方式进行防治，徐方媛通过稀释分离法从根际土壤中分离筛选菌株，采用平板对峙法筛选出5株对欧美杨细菌性溃疡病病原菌具有抑制效果的拮抗菌，经鉴定分别为枯草芽孢杆菌和委内瑞拉链霉菌，经灌根处理后，其防效达到51％。但是通过平板对峙筛选出拮抗菌时，通常只采用一种病原菌作为靶标菌，而田间环境复杂，一般为多种病原菌混合侵染，因此对病害的防治具有局限性。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种harpinf蛋白及其在诱导欧美杨抗细菌性溃疡病害中的应用，本发明通过研究获得一种harpinf蛋白，该蛋白可作为一种安全高效，并能诱导植株产生广谱抗性的蛋白诱抗剂，用于防治欧美杨细菌性溃疡病，因此具有良好的实际应用之价值。

为了实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种名为harpinf的蛋白质，所述名为harpinf的蛋白质来源于欧美杨细菌性溃疡病病原菌lonsdaleaquercinasubsp.populi菌株。

所述harpinf是如下(a1)或(a2)：

(a1)seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

本发明的第二个方面，提供一种编码所述harpinf的基因。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)seqidno.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，seqidno.2由228个核苷酸组成，其中第1-225为编码序列，第226-228位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。

本发明的第三个方面，含有所述基因的重组表达载体或重组细胞亦在本发明的保护范围之内。

所述重组表达载体为重组原核表达载体，所述重组原核表达载体包括在表达载体pet30a中插入上述编码基因后所得。

所述重组细胞为原核细胞，优选为细菌，进一步选自大肠杆菌、芽孢杆菌等；更进一步的，所述重组细胞为含有上述基因和/或重组表达载体的bl21。

本发明的第四个方面，所述编码基因、重组表达载体或重组细胞在制备蛋白质harpinf中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的第五个方面，提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明的第六个方面，所述蛋白质harpinf作为蛋白诱抗剂的应用也应在本发明的保护范围之内。

具体的，所述应用至少包括：

1)预防和/或治疗欧美杨细菌性溃疡病；

2)诱导植株产品广谱抗性；

3)促进植株生长。

所述植株为杨树，进一步优选为欧美杨。

本发明的第七个方面，提供一种蛋白诱抗剂，所述蛋白诱抗剂至少包括上述蛋白质harpinf。

所述蛋白诱抗剂还包括农药学上可接受的辅料。

本发明的第八个方面，提供一种诱导欧美杨抗细菌性溃疡病害的方法，所述方法包括：将上述蛋白质harpinf或蛋白诱抗剂施用于欧美杨叶片、枝条或根茎上；优选为叶片或枝条。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

1.公开一种欧美杨细菌性溃疡病病原菌lonsdaleaquercinasubsp.populi菌株的hrpf基因序列及其所编码的蛋白质，采用基因工程方法利用his融合表达harpin蛋白，显著提高其在大肠杆菌中的表达量。并通过ni柱对目的蛋白进行纯化，纯蛋白浓度约为1mg/ml。

2.使用上述技术方案获得harpinf蛋白喷施欧美杨枝条，可以显著提高欧美杨对细菌性溃疡病抗性，从而证明harpinf具有开发成生物源农药的应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例2中载体片段双酶切和重组质粒pet30a(+)-hrpf菌落pcr验证：a为双酶切片段，其中m为dnamarkerdl2000；1号为hrpf双酶切；b为重组质粒pet30a(+)-hrpf菌落pcr验证，其中1-5为转化子，6为阴性对照。

图2为本发明实施例4中harpinf的表达及纯化：其中1为纯化的harpinf蛋白；2为harpinf粗提蛋白。

图3为本发明实施例4中harpinf生物活性检测：其中a为hrpf；b为n-5-1菌株；c为bl21/pet30a(+)空载体对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种名为harpinf的蛋白质，所述名为harpinf的蛋白质来源于欧美杨细菌性溃疡病病原菌lonsdaleaquercinasubsp.populi菌株。

本发明的又一具体实施方式中，所述harpinf是如下(a1)或(a2)：

(a1)seqidno.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

其中，seqidno.1由75个氨基酸残基组成。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种编码所述harpinf的基因。

其中，所述基因具有(b1)-(b3)中任一所述核苷酸序列：

(b1)seqidno.2所示的核苷酸序列；

(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；

(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，seqidno.2由228个核苷酸组成，其中第1-225为编码序列，第226-228位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。

本发明的又一具体实施方式中，含有所述基因的重组表达载体或重组细胞亦在本发明的保护范围之内。

所述重组表达载体为重组原核表达载体，所述重组原核表达载体包括在表达载体pet30a中插入上述编码基因后所得。

即所述载体为pet30a(+)-hrpf重组载体，其由以下方法构建：

(1)将n-5-1和pet-30a(+)载体划线接种于lb固体平板，37℃培养24h，用细菌基因组dna提取试剂盒提取n-5-1基因组dna。以n-5-1gdna为模板，利用primestar和hrpf的特异性引物进行目的基因扩增：

hrpf-f：5'-ggggtaccatgtcttcatcgctgggattacag-3'(seqidno.3)；

hrpf-r：5'-cggaattctcagttgaagtcattgatgatggcc-3'(seqidno.4)；

pcr反应体系为25μl，反应条件为：98℃5min；98℃10s；62℃15s；72℃10s；72℃5min；循环32次。pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的条带。将切胶回收片段与t载体连接，连接产物热激转化dh5α化学感受态细胞，涂布于含有kn的lb琼脂培养基，37℃培养12h，挑取单菌落进行pcr鉴定，将阳性克隆菌落接种于含有kn抗性的lb液体培养基，37℃培养12h，得到重组质粒t-hrpf。

(2)将t-hrpf和pet-30a(+)载体分别用kpni和ecori双酶切，切胶回收hrpf和pet-30a(+)目的条带。16℃条件下将回收片段与载体用t4连接酶过夜连接，将连接产物热激转化dh5α化学感受态细胞，涂布于含有kn的lb琼脂培养基，37℃培养12h，挑取单菌落进行pcr鉴定，将阳性克隆菌落接种于lb液体培养基，37℃培养12h，提质粒测序。将测序结果与目的基因通过snapgene软件进行比对，测序正确即为重组表达载体pet30-hrpf。

所述重组细胞为原核细胞，优选为细菌，进一步选自大肠杆菌、芽孢杆菌等；更进一步的，所述重组细胞为含有上述基因和/或重组表达载体的bl21；即所述重组细胞为重组大肠杆菌bl21/pet30a(+)-hrpf。

其构建方法包括将上述重组质粒pet30a(+)-hrpf转化至大肠杆菌bl21中，即获得重组大肠杆菌bl21/pet30a(+)-hrpf。

本发明的又一具体实施方式中，所述编码基因、重组表达载体或重组细胞在制备蛋白质harpinf中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的又一具体实施方式中，提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明的又一具体实施方式中，所述蛋白质harpinf作为蛋白诱抗剂的应用也应在本发明的保护范围之内。

具体的，所述应用至少包括：

1)预防和/或治疗欧美杨细菌性溃疡病；

2)诱导植株产品广谱抗性；

3)促进植株生长。

所述植株为杨树，进一步优选为欧美杨。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种蛋白诱抗剂，所述蛋白诱抗剂至少包括上述蛋白质harpinf。

所述蛋白诱抗剂还包括农药学上可接受的辅料。

本发明的又一具体实施方式中，述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述菌剂可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。

其中，所述分散剂为阴离子型分散剂和/或非离子型分散剂，可选自木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种。

所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉bx中的一种或多种。

所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种。

所述粘结剂可选自淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种。

所述消泡剂可选自c8～c20脂肪醇类化合物、c10～c20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种。

所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种。

所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种。

所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种。

所述溶剂可选自水(优选为去离子水)或油酸甲酯。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诱导欧美杨抗细菌性溃疡病害的方法，所述方法包括：将上述蛋白质harpinf或蛋白诱抗剂施用于欧美杨叶片、枝条或根茎上；优选为叶片或枝条。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明中使用的缩略语：

lb：细菌培养基，酵母粉5g/l+胰蛋白胨10g/l+nacl10g/l，ph7.0；

kn50：50μg/ml的卡那霉素；iptg：异丙基硫代-β-半乳糖苷；pmsf：蛋白酶抑制剂苯甲基黄酰氟。

实施例1hrpf基因的克隆

将欧美杨细菌性溃疡病菌(lonsdaleaquercinasubsp.populi)n-5-1菌株(保藏于山东农业大学植物保护学院微生物楼a507，保藏日期为2018年3月15日)在37℃条件下于lb固体培养基上培养，待菌株生长到对数期，提取n-5-1菌株基因组dna，设计特异性引物，在5'端分别引入kpni和ecori酶切位点；

hrpf-f：5'-ggggtaccatgtcttcatcgctgggattacag-3'(seqidno.3)；

hrpf-r：5'-cggaattctcagttgaagtcattgatgatggcc-3'(seqidno.4)；

以n-5-1菌株的基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr反应体系为25μl，反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；62℃退火15s；72℃延伸10s；循环32次；72℃终延伸5min；4℃永久保温。将pcr产物与pce2-ta载体连接，转化到大肠杆菌dh5α中，经菌落pcr验证得到阳性转化子。提取重组质粒dna并测序。序列分析采用snapgene软件，同源性比对在genbank(http://www.ncbi.nlm.gov)中通过blast程序进行比对。

实施例2harpinf蛋白的表达及纯化

以测序正确的阳性重组质粒pce2-ta-hrpf为模板，pcr扩增。扩增产物回收后经kpni和ecori双酶切后连接到表达载体pet30a(+)上，使得hrpf基因与pet30a(+)上的多聚组氨酸标签his-tag融合，进而得到重组质粒pet30a(+)-hrpf。将重组质粒和pet30a(+)转入大肠杆菌bl21后经菌落pcr鉴定出阳性重组菌株。

将重组菌株bl21/pet30a(+)-hrpf接种于含有kn的lb液体培养基，37℃过夜培养，以1:100比例将过夜菌液加入含有kn的lb液体培养基，37℃培养2h，期间多次测od值，以od600＝0.8为宜，加入iptg至终浓度为1mmol/l，取部分不加iptg的菌液为对照，37℃，200r/min培养3h。用50ml离心管收集菌体，4℃，12000rpm离心5min(注意要将菌体一直处于低温状态)。去上清，加灭菌水清洗两遍，4℃，5000rpm离心15min。去上清，按照1：100比例加入预冷pmsf(100mm)，加入适量pbsbuffer，约每50ml菌液加3ml。超声波破碎菌体(工作4s，停4s)，将菌体始终置于冰水混合物上至菌液清澈，-80℃保存。经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白，sds-page检测目的蛋白的表达情况。

使用histraphp柱对标签蛋白进行纯化，具体操作参见操作说明书进行，纯蛋白浓度约为1mg/ml。以上获得的纯化harpinf可以在促进植物生长，诱导植物抗病方面得到应用。

实施例3欧美杨细菌性溃疡病菌n-5-1菌株基因的克隆与测序

将欧美杨细菌性溃疡病菌(lonsdaleaquercinasubsp.populi)n-5-1菌株(保藏于山东农业大学植物保护学院微生物楼a507，保藏日期为2018年3月15日)在37℃条件下于lb固体培养基上培养，待菌株生长到对数期，提取n-5-1菌株基因组dna，设计特异性引物，在5'端分别引入kpni和ecori酶切位点；

hrpf-f：5'-ggggtaccatgtcttcatcgctgggattacag-3'(seqidno.3)；

hrpf-r：5'-cggaattctcagttgaagtcattgatgatggcc-3'(seqidno.4)；

以n-5-1菌株的基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr反应体系为25μl，反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性10s；62℃退火15s；72℃延伸10s；循环32次；72℃终延伸5min；4℃永久保温。将pcr产物与pce2-ta载体连接，转化到大肠杆菌dh5α中，经菌落pcr验证得到阳性转化子。提取重组质粒dna并送至擎科生物科技公司测序。对重组质粒pce2-ta-hrpf序列测定结果显示，hrpf基因大小为228，编码76个氨基酸，其编码的蛋白不含半胱氨酸，富含甘氨酸(6.7％)。

实施例4harpinf蛋白的表达及纯化

1.hrpf基因工程表达菌株的构建

以测序正确的阳性重组质粒pce2-ta-hrpf为模板，pcr扩增。扩增产物回收后经kpni和ecori双酶切后连接到表达载体pet30a(+)上，使得hrpf基因与pet30a(+)上的多聚组氨酸标签his-tag融合，进而得到重组质粒pet30a(+)-hrpf。将重组质粒和pet30a(+)转入大肠杆菌bl21后经菌落pcr鉴定出阳性重组菌株。

2.harpinf蛋白的表达

(1)活化原种：将重组菌株bl21/pet30a(+)-hrpf接种于含有kn的lb液体培养基，37℃过夜培养，以1:100比例将过夜菌液加入含有kn的lb液体培养基，37℃培养2h，期间多次测od值，以od600＝0.8为宜，加入iptg至终浓度为1mmol/l，取部分不加iptg的菌液为对照，37℃，200r/min培养3h。

(2)破碎细胞：用50ml离心管收集菌体，4℃，12000rpm离心5min(注意要将菌体一直处于低温状态)。去上清，加pbs(磷酸缓冲液)清洗两遍，4℃，5000rpm离心15min。去上清，按照1：100比例加入预冷pmsf(100mm)，加入适量pbsbuffer，约每50ml菌液加3ml。超声波破碎菌体(工作4s，停4s)，将菌体始终置于冰水混合物上至菌液清澈，-80℃保存。经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白。sds-page检测融合蛋白大小为8.84kda，harpinf大小为8.0kda，his-tag标签大小为0.84kda(图2)。

3.harpinf的纯化

使用histraphp对标签蛋白进行纯化，具体步骤按照说明书显示的方法，纯化之前，用0.45μm滤膜过滤harpinf粗提蛋白，去除粗提蛋白中一些细胞碎片或其它杂质，以免阻塞纯化柱，纯化时使用蠕动泵上样。纯化的样品经超滤柱超滤、浓缩，利用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，纯蛋白于-80℃保存。

4.harpinf蛋白的生物活性检测

稀释蛋白浓度至10mg/ml，取50μl在同一片烟草叶片上接种hrpf、野生型n-5-1和bl21/pet30a(+)空载体对照，每12h观察hr反应情况(图3)。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种harpinf蛋白及其在诱导欧美杨抗细菌性溃疡病害中的应用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>75

<212>prt

<213>harpinf蛋白

<400>1

metserserserleuglyleuglnargargleuaspthralapheval

151015

aspalaglnserglnleuaspalametalaleuasnvalalaglugly

202530

glyalaasnmetalaaspserhisalaphepheglualasermetasp

354045

tyralaasnalaasntrpalaserglyglnleuleuservallyshis

505560

glyleualalysalaileileasnasppheasn

657075

<210>2

<211>228

<212>dna

<213>hrpf核苷酸

<400>2

atgtcttcatcgctgggattacagcgtcggctggataccgcgtttgtggatgcgcaatcg60

cagctggatgctatggcgctaaacgtcgcggaagggggagccaacatggcggacagccat120

gccttcttcgaagccagtatggactacgcgaacgccaactgggcaagcgggcagctgctg180

agcgtcaaacacggtctggccaaggccatcatcaatgacttcaactga228

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

ggggtaccatgtcttcatcgctgggattacag32

<210>4

<211>33

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

cggaattctcagttgaagtcattgatgatggcc33