C-P串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、C肽检测试剂盒与流程

文档序号：21087695发布日期：2020-06-12 17:00阅读：321来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种c-p串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、c肽检测试剂盒。

背景技术：

c肽(c-p)是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体—胰岛素原。一个分子的胰岛素原在特殊的作用下，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的c肽，因此在理论上c肽和胰岛素是等同分泌的，血中游离的c肽生理功能尚不很清楚，但c肽不被肝脏破坏，半衰期较胰岛素明显为长，故测定c肽水平更能反应β细胞合成与释放胰岛素功能。对已经用胰岛素治疗的病人，体内产生的胰岛素抗体可干扰胰岛素测定；同时现在采用的放免法测定胰岛素，也分辨不出是内生的还是外源性胰岛素，给了解β细胞的功能带来困难，而c肽与胰岛素之间有相当稳定的比例关系，且不受胰岛素抗体的干扰，注射的外源性胰岛素又不含c肽，所以测定血中c肽水平，可以反映内生胰岛素的水平，即可了解β细胞的功能。

检测c肽对糖尿病预防和治疗具有重要的临床意义：

(1)测定c肽，有助于糖尿病的临床分型，有助于了解患者的胰岛功能。

(2)因为c肽不受胰岛素抗体干扰，对接受胰岛素治疗的患者，可直接测定c肽浓度，以判定患者的胰岛β细胞功能。

(3)可鉴别低血糖的原因。若c肽超过正常，可认为是胰岛素分泌过多所致，如c肽低于正常，则为其它原因所致。

(4)c肽测定有助于胰岛细胞瘤的诊断及判断胰岛素瘤手术效果，胰岛素瘤血中c肽水平偏高，若手术后血中c肽水平仍高，说明有残留的瘤组织，若随访中c肽水平不断上升，揭示肿瘤有复发或转移的可能。

目前实验室检测c肽的方法比较多，常用方法有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法、电化学发光免疫分析法等。随着生物科技的发展，其检测方法也逐步由放射免疫学的检测方法，逐渐向酶联免疫吸附试验、化学发光免疫分析法发展。放射性免疫分析法由于试剂具有放射性，对操作者具有一定的危害，且操作复杂，试剂有效期短等缺点，不推荐作为c肽临床诊断；酶联免疫分析法的缺点在于无法准确进行定量，且批间差异较大，线性范围有限，无法持续监控c肽水平；化学发光免疫分析法是一种较为先进的免疫学方法，具有高灵敏、高特异、快速、高通量等特点。现阶段化学发光法已成为检测c肽水平的主流方法，并且由于自动化检测系统的普及，极大地提升了实验的精密度。根据目前c肽的临床的应用情况，市场应用前景较好的可靠方法为化学发光免疫分析法。化学发光免疫分析法主要有微孔板式化学发光、微孔板式磁颗粒化学发光、时间分辨荧光免疫分析法和光激化学发光法。

使用多肽(体外合成/合成肽)作为c肽体外诊断试剂盒的组成成分已很常见，但c肽的稳定性较差。如何提高多肽(体外合成/合成肽)或某些蛋白的稳定性一直是困扰试剂和开发人员的难题。

技术实现要素：

鉴于此，本发明提供了c-p串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、c肽检测试剂盒。该c-p标准品的稳定性得到明显的提高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种c-p串联表达重组蛋白，其氨基酸序列如seqidno：5所示。

本发明还提供了编码该c-p串联表达重组蛋白的基因，其核苷酸序列如seqidno：6所示。

本发明还提供了该c-p串联表达重组蛋白的制备方法，包括：以seqidno：6所示基因为模板，使用seqidno：7和seqidno：9所示的引物组进行pcr扩增，扩增产物经过bamhi和noti双酶切后，构建到c-p-f1/r2-pet32a中，筛选阳性克隆菌，提取质粒后导入表达宿主细胞，经iptg诱导表达出目的蛋白，经纯化后获得c-p串联表达重组蛋白。

作为优选，宿主细胞为bl21de3。

作为优选，纯化为采用hitrap进行纯化。

本发明还提供了该c-p串联表达重组蛋白在制备c肽标准品或质控品中的应用。

本发明还提供了一种c肽检测试剂盒，包括用于制备c肽标准品或质控品的c-p串联表达重组蛋白。

作为优选，该c肽检测试剂盒还包括包被c-p抗体的酶免板/发光板/磁性微球、c-p抗体标记有辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶、酶免显色剂/化学发光底物中的一种或几种。

本发明提供了c-p串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、c肽检测试剂盒。该c-p串联表达重组蛋白的氨基酸序列如seqidno：5所示。

本发明具有的技术效果为：

本发明使用体外合成c-p多肽或选择人c-p的氨基酸对应的核酸序列进行重组表达，在制备/表达之前将c-p氨基酸对应序列串联后表达出融合两分子c-p氨基酸的串联c-p蛋白，制备之后其c-p的稳定性得到显著提高。本发明制备的c-p串联表达重组蛋白可应用于体外诊断免疫检测试剂(人c肽检测试剂盒)中的标准品或质控品。

具体实施方式

本发明公开了c-p串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、c肽检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

通过体外合成的方式获得c-p多肽，并作为c-p体外诊断试剂盒的组成成分。其中所述c-p氨基酸序列如下：

eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq

通过体外表达系统(原核表达、真核表达等)获得包含c-p的31个氨基酸序列的融合蛋白，并作为c-p体外诊断试剂盒的组成成分。

使用体外合成c-p多肽或选择人c-p的氨基酸对应的核酸序列进行重组表达，在制备/表达之前将c-p氨基酸对应序列串联后表达出融合两分子c-p氨基酸的串联c-p蛋白，制备之后其c-p的稳定性得到提高。

本发明提供的c-p串联表达重组蛋白及其应用，以及含有该c-p重组蛋白的试剂盒中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1合成多肽

提供c-p的氨基酸序列(如seqidno：1所示)委托上海生工合成：eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq(命名：c-p-1)。

c-p-1的核苷酸序列(如seqidno：2所示)：

gaagctgaagaccttcaagtgggtcaagttgaacttggtgggggtcctggtgcgggttctcttcaacctttggctctcgagggatcacttcaa

实施例2融合表达

合成c-p氨基酸对应基因(5’端含bamhi对应碱基，3’端含有终止子、ecori对应碱基)，使用引物c-p-f1和c-p-r1，pcr扩增后，经过bamhi和ecori双酶切后，构建到pet32a载体，筛选阳性克隆菌，提取相应质粒后导入表达宿主细胞bl21de3，经iptg(0.1-1mm)诱导表达出目的蛋白，进一步分别经hitrap纯化获得达90％以上纯度的c-p目的蛋白(c-p-2)。

实施例3融合表达

合成c-p氨基酸对应基因(5’端含bamhi对应碱基，3’端含有终止子、noti对应碱基)，使用引物c-p-f1和c-p-r2，pcr扩增后，经过bamhi和noti双酶切后，构建到c-p-f1/r2-pet32a中，筛选阳性克隆菌，提取相应质粒后导入表达宿主细胞bl21de3，经iptg(0.1-1mm)诱导表达出目的蛋白，进一步分别经hitrap纯化获得达90％以上纯度的c-p目的蛋白(c-p-3)。

实施例1-3的具体方法如下：

1.材料和方法

1.1材料

主要试剂：pet32a,e.colibl21de3等购自novagen，高保真pfu酶、限制性内切酶(bamhi、ecori、noti)、dna连接酶、蛋白marker等购自takara；histrapff等购自ge；其他试剂分析纯级别。

主要设备：pcr仪abi；iwo-960洗板机、化学发光免疫分析仪lumo、人c-肽定量检测试剂盒(化学发光法)等购自郑州安图生物工程股份有限公司

1.2方法

1.2.1基因获得

确定的c-p基因(如seqidno：2、seqidno：3所示)，都由上海生工合成。

c-p的核苷酸序列(如seqidno：2所示)：

gaagctgaagaccttcaagtgggtcaagttgaacttggtgggggtcctggtgcgggttctcttcaacctttggctctcgagggatcacttcaa

串联c-p的核苷酸序列：

gaagctgaagaccttcaagtgggtcaagttgaacttggtgggggtcctggtgcgggttctcttcaacctttggctctcgagggatcacttcaagaattcgaagctgaagaccttcaagtgggtcaagttgaacttggtgggggtcctggtgcgggttctcttcaacctttggctctcgagggatcacttcaataagcggccgcata

1.2.2多肽获得

确定的c-p氨基酸序列(如seqidno：1所示)，都由上海生工合成。

c-p的氨基酸序列(如seqidno：1所示)：

eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq

1.2.3引物设计

利用分子生物学软件dnaman，设计分别含bamhi、ecori、noti限制性内切酶的扩增引物(上游引物如seqidno：7所示；下游引物如seqidno：8、seqidno：9所示)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并计算理论表达目的蛋白分子量。

c-p-f1：5’tatggatccgaagctgaagaccttcaagtg(如seqidno：7所示)；

c-p-r1：5’tatgaattcttattgaagtgatccctcgag(如seqidno：8所示)。

c-p-r2：5’tatgcggccgcttattgaagtgatcc(如seqidno：9所示)。

1.2.4原核表达载体构建

采用分子生物学方法(pcr分别以含c-p-2、c-p-3基因的质粒为模板扩增目的基因、目的基因pcr产物胶回收、双酶切(bamhi和ecori；bamhi和noti)、水平胶回收、连接、转化)，将该阅读框分别插入细菌表达质粒pet32a之间，得到原核表达质粒pet32a-c-pf1r1(蛋白简称c-p-2，理论14.96kd)、pet32a-c-pf1r2(蛋白简称c-p-3，理论24.01kd)。将该质粒常规分别转化e.colibl21de3等表达菌株，32摄氏度0.5mmiptg诱导培养5h，分别表达出c-p-2、c-p-3重组蛋白。

1.2.5重组蛋白纯化

histrapff纯化携带6*his标签的c-p-2、c-p-3重组蛋白。

基于his-tag标签亲和层析纯化：

将大量诱导表达的重组蛋白，离心收集。对pet32a载体表达的c-p-2和c-p-3蛋白用histrapff层析柱亲和纯化：用平衡缓冲液(0.02mol/lpbsph7.4)重悬菌体，超声破碎，20000ⅹg(4℃)离心20min，上清进行纯化，依次用平衡缓冲液和5％洗脱缓冲液(pbsph7.4，50mmol/l咪唑)洗去杂蛋白，用洗脱缓冲液(0.02mol/lpbsph7.4，0.2mol/l咪唑)洗脱目的蛋白，-20摄氏度备用。

1.2.6elisa检测c-p含量

用含10％以上蛋白质(bsa，血清等)、edta等的缓冲液，分别稀释待测融合有c-p的蛋白或多肽到不同浓度梯度，并冻干。一份放置4℃，一份放置37℃。10天后，分别都取出来恢复室温后，做为标本，按照人c-肽定量检测试剂盒(化学发光法)检测试剂的说明书操作，获得c-p含量数据。

通过公式：1-(37℃发光值/4℃发光值)*100％，计算获的热稳定性的降幅数据后统计学分析其差异性。

2.结果：

2.1融合表达了pet32a载体上的硫氧还蛋白(trx)蛋白。

2.2c-p的氨基酸序列(如seqidno：1所示)：

eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq

蛋白质分子量为:3.02kda，等电点:3.25732421875

c-p的核苷酸序列(如seqidno：2所示)：

gaagctgaagaccttcaagtgggtcaagttgaacttggtgggggtcctggtgcgggttctcttcaacctttggctctcgagggatcacttcaa

2.3表达了融合蛋白的包含1个c-p的核苷酸序列(如seqidno：4所示)：

atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggccggttctggttctggccatatgcaccatcatcatcatcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggacagcccagatctgggtaccgacgacgacgacaaggccatggctgatatcggatccgaagctgaagaccttcaagtgggtcaagttgaacttggtgggggtcctggtgcgggttctcttcaacctttggctctcgagggatcacttcaa

表达了融合蛋白的c-p：

pet32a-eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq(命名：c-p-2)；

蛋白质分子量为:20.73kda等电点:4.67

融合蛋白的c-p的氨基酸序列(如seqidno：3所示)：

msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigseaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq

2.3表达了融合蛋白的c-p串联的核苷酸序列(如seqidno：6所示)：

表达了融合蛋白的包含2个c-p：

pet32a-eaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqefeaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq(命名：c-p-3)。

蛋白质分子量为:24.01kda等电点:4.35

表达了融合蛋白的包含2个c-p的氨基酸序列(如seqidno：5所示)：

msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtddddkamadigseaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqefeaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslq

实施例3稳定性评价

对本发明提供的一个多肽(c-p-1)，两个融合抗原(c-p-2，c-p-3)进行稳定性的考察。将三个抗原通过人c-p定量检测试剂盒(化学发光法)试剂检测，分别将其稀释调整到(0.3ng/ml、1ng/ml、6ng/ml、15ng/ml、30ng/ml)浓度后冻干，放置4℃、37℃，10天后考察其信号值，将4℃放置与和37℃放置的抗原放置的抗原发光值做对比，以评价其稳定性。

表1c-p-1

表2c-p-2

表3c-p-3

对表1-表3中37℃放置10天时信号值的降幅进行统计学分析，不同组之间采用t-test方法进行比较，以p＜0.05为差异具有统计学意义。与本发明中的多肽c-p-1相比，融合蛋白c-p-2，c-p-3稳定性有所提升，差异均具有统计学意义(c-p-2：f＝0.027，p<0.01；c-p-3：f＝0.376，p<0.01)，且均为极显著差异。进一步比较融合蛋白的稳定性，与c-p-2相比，c-p-3的37℃加速稳定性显著提高，差异有极显著统计学意义(f＝0.139，p<0.01)。综合比较，c-p-3稳定性最优，不同浓度下加速稳定性降幅均小于10％，符合体外试剂盒国家要求相关标准。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>郑州伊美诺生物技术有限公司

<120>c-p串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、c肽检测试剂盒

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<210>2

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354045

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505560

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145150155160

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